CN112881672A - 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112881672A
CN112881672A CN202110030584.7A CN202110030584A CN112881672A CN 112881672 A CN112881672 A CN 112881672A CN 202110030584 A CN202110030584 A CN 202110030584A CN 112881672 A CN112881672 A CN 112881672A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
colloidal gold
antibody
test strip
labeled
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110030584.7A
Other languages
English (en)
Inventor
曹亮
张媛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Huading Biotechnology Co ltd
Nanjing Zoonbio Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Huading Biotechnology Co ltd
Nanjing Zoonbio Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Huading Biotechnology Co ltd, Nanjing Zoonbio Biotechnology Co ltd filed Critical Nanjing Huading Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110030584.7A priority Critical patent/CN112881672A/zh
Publication of CN112881672A publication Critical patent/CN112881672A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Abstract

本发明属于医学检测领域，具体涉及通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用。本发明的试纸条可以替代核酸扩增检测环节的仪器如核酸电泳凝胶成像、荧光定量PCR仪、恒温扩增荧光检测仪，操作简便、检测时间快速、成本低。

Description

通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
目前，核酸扩增方法包括常规PCR、实时荧光PCR、等温核酸扩增技术等，上述各核酸扩增技术在疾病诊断、动植物检疫、食品安全及转基因检测等领域广泛应用。对核酸扩增后的产物，现有技术利用仪器设备进行检测分析，如通过电泳系统及荧光染色进行紫外显影分析扩增产物，或者通过其他荧光检测器进行探测收集数据，因此，核酸产物的检测对设备的依赖性很强，同时仪器检测对仪器使用人员的操作技能具有一定要求，从而影响了核酸扩增方法在实验室外灵活应用，并在很大程度上限制了核酸检测的广泛应用场景，如医学POCT检测、动植物食品安全等快速的检测需求无法得到满足。
胶体金免疫层析法是一种快速的检测方法。胶体金检测试剂条主要由样品垫、背衬(底板)、连接垫(胶体金垫)、检测线、质检线、硝酸纤维素膜、吸收垫组成。在试纸条一端的样品垫上滴加样品溶液，其受膜的毛细管作用向试纸条的另一端移动，移动过程中被分析物和固定在膜上的某一区域的受体结合固相化，无关物质则通过该区域时被分离，通过胶体金标记物显色来判定实验结果。现有技术没有针对多重核酸产物的通用型胶体金检测试剂条。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通用型多核酸产物检测胶体金试纸条。
本发明的再一目的在于提供上述试纸条的其制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述试纸条的应用。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，所述试纸条包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述检测线上包被有FITC单克隆抗体、TAMRA单克隆抗体、DIG单克隆抗体或CY5单克隆抗体中的至少两种，或者所述检测线上包被有FAM单克隆抗体、TAMRA单克隆抗体、DIG单克隆抗体或CY5单克隆抗体中的至少两种；所述金标垫上包被有胶体金标记的生物素单克隆抗体。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，将包被浓度为0.3mg/mL的FITC单克隆抗体、0.3mg/mL的TAMRA单克隆抗体、0.2mg/mL的DIG抗体单克隆抗体、0.5mg/mL的CY5单克隆抗体或0.3mg/mLFAM单克隆抗体，按1μL/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，所述质控线上包被有羊抗鼠抗体。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，将生物素单克隆抗体加入到金标缓冲液中，加入封闭液，混匀，离心,得到沉淀，将沉淀复溶得到胶体金标记的生物素单克隆抗体。
其中，封闭液可选择10％牛血清白蛋白，将沉淀使用复溶溶液复溶，复溶溶液为10％牛血清白蛋白。
将胶体金标记的生物素单克隆抗体以16～17μL/cm速度铺在6mm×150mm金垫上。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，将胶体金与0.2M碳酸钾溶液混合得到金标缓冲液，其中，胶体金的金颗粒为40nm。
0.2M碳酸钾溶液与胶体金的混合比例为1～5：1000。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将生物素单克隆抗体加入到金标缓冲液中，加入封闭液，混匀，离心,得到沉淀，将沉淀复溶得到胶体金标记的生物素单克隆抗体，并负载于基质上，干燥，得到胶体金垫；
(2)将FITC单克隆抗体、TAMRA单克隆抗体、DIG单克隆抗体或CY5单克隆抗体中的至少两种包被到硝酸纤维素膜上，作为检测线；将羊抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上，做为质控线上；
(3)将胶体金垫、硝酸纤维素膜与底板、样品垫和吸水垫进行组装。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，步骤(2)中，将包被浓度为0.3mg/mL的FITC单克隆抗体、0.3mg/mL的TAMRA单克隆抗体、0.2mg/mL的DIG抗体单克隆抗体、0.5mg/mL的CY5单克隆抗体或0.3mg/mLFAM单克隆抗体，按1μL/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，将生物素单克隆抗体加入到金标缓冲液中，加入封闭液，混匀，离心,得到沉淀，将沉淀复溶得到胶体金标记的生物素单克隆抗体。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，将胶体金与0.2M碳酸钾混合，得到所述金标缓冲液，其中，胶体金的金颗粒为40nm。
根据本发明具体实施方式的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，所述封闭液为10％的牛血清白蛋白。
本发明的有益效果：
本发明将生物素抗体标记胶体金用于捕获核酸产物中的生物素标记物，将常用的标记物FITC\FAM、TAMRA、DIG、CY5等标记物所制备的单克隆抗体喷涂在硝酸纤维素膜上做为检测线，检测线可以是一条、两条、三条、四条，从而对多种核酸产物进行同时、准确的检测。
本发明的通用型多重核酸产物检测胶体金试纸条无专业背景人员即可操作，3～10分钟完成检测，单次检测仅5～20元。因此，本发明的试纸条可以替代核酸扩增检测环节的仪器如核酸电泳凝胶成像、荧光定量PCR仪、恒温扩增荧光检测仪，操作简便、检测时间快速、成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示抗体间接ELISA标准曲线；
图2显示标记物抗体的SDS-PAGE电泳结果，1：生物素抗体-4B6，2：FITC(FAM)抗体-3G8，3：TAMRA抗体-1E4，4：DIG抗体-2D6，5：CY5抗体-3A5，M：为分子量标志；
图3为本发明的试纸条的验证结果；
图4为对新冠病毒RdRP、E、ORF1ab、N阳性对照质粒的检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1制备单克隆抗体
将标记物生物素、FITC(或FAM)、TAMRA、DIG、CY5分别偶联KLH载体蛋白和BSA载体蛋白，利用KLH-标记物作为免疫原分别免疫10只BALB/c小鼠，利用电融合仪进行融合，细胞上清通过BSA-标记物间接ELISA检测及竞争ELISA检测，筛选出高效价特异性好的细胞株，通过杂交瘤无血清培养及蛋白A纯化获得纯化抗体，用于胶体金试纸条制备。
所获得抗体为：生物素抗体-4B6、FITC(FAM)抗体-3G8、TAMRA抗体-1E4、DIG抗体-2D6、CY5抗体-3A5。
检测所获得的抗体的效价，具体操作如下：
(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。
(2)用PBS包被液将小分子标记物-BSA稀释成需要的0.1ug/mL浓度，混匀后加入板条中，每孔100uL，4℃冰箱过夜。
包被抗原：小分子标记物-BSA；
包被浓度：0.1ug/mL，100ul/孔；
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)；
(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200uL封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。
(4)抗抗体按1ug/mL，3倍稀释，每孔100uL，37℃恒温箱1h。
(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100uL稀释好的酶标二抗；酶标二抗：山羊抗鼠-HRP，1/5000。37℃恒温箱1h。
(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100uL TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。
(7)每孔加入1M HCL溶液100uL，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。结果如表1、图1所示：
表1标记物抗体的效价检测结果
Figure BDA0002891747290000051
如表1所示，生物素抗体-4B6抗体效价为3280500，FITC(FAM)抗体-3G8抗体效价为3280500，TAMRA抗体-1E4抗体效价为1093500，DIG抗体-2D6抗体效价为29524500，CY5抗体-3A5抗体效价为1093500。
对纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果如图2所示，可见抗体纯化后纯度在95％以上。
实施例2制备胶体金试纸条
2.1胶体金标记生物素抗体
取2支1.5mL离心管用超纯水清洗两遍，吸取1mL40nm胶体金加入每管中，每管加入3μL0.2M碳酸钾，分别向每管中加入8μg生物素抗体-4B6，混匀后反应10min。向每管中加入50μL封闭液(10％BSA)反应10min，11000r/min转速下离心20min。弃去上清，用250μL金复溶液(10％BSA)将沉淀复溶，得到金标生物素抗体，以16.6μL/cm速度铺在6mm×150mm金垫上，进行干燥。
2.2点膜
将检测线抗体FITC抗体-3G8、TAMRA抗体-1E4、DIG抗体-2D6、CY5抗体-3A5)用稀释液(10mM的磷酸缓冲液)稀释至0.2-0.5mg/mL(0.3mg/mL的FITC(FAM)单克隆抗体、0.3mg/mL的TAMRA单克隆抗体、0.2mg/mL的DIG抗体单克隆抗体、0.5mg/mL的CY5单克隆抗体)，并按照1μL/cm速度分别包被在NC膜上，作为检测线。
将质控线包被抗体羊抗鼠用稀释液稀释至0.5mg/mL,1μL/cm并包被在NC膜上，室温，在45％～65％的低湿度条件下进行干燥。
2.3组装
在底板上从上到下依次粘贴吸水纸、NC膜、金垫(两层)、样品层析垫，用斩切机切成3.5mm宽的试纸条用以检测。
以含有5nM各种标记物的PCR核酸产物，生物素-FITC(FAM)、生物素-TAMRA、生物素-DIG、生物素-CY5双标记PCR核酸产物为样品溶液，用滴管取样本溶液70～90μL，滴加去离子水助跑液，反应10min～20min。30min内观察结果有效。
结果如图3所示，检测线1为FITC(FAM)抗体-3G8、检测线2为TAMRA抗体-1E4、检测线3为DIG抗体-2D6、检测线4为CY5抗体-3A5。因此，试纸条检测线设置为一条、两条、三条、四条时均能很好的检出阳性结果，可以用于多重核酸产物的检测。
实施例3多重核酸产物的检测
利用新冠病毒RdRP、E、ORF1ab、N阳性对照质粒进行试纸条多重PCR产物应用检测。
将阳性对照质粒分别稀释为10个拷贝/mL、100个拷贝/mL、1000个拷贝/mL、10000个拷贝/mL，进行普通多重PCR，将PCR产物稀释50倍后，利用本发明的胶体金试纸条进行检测。其中，PCR所用引物如表2所示：
表2PCR引物序列
Figure BDA0002891747290000071
在常温制备如下PCR体系：
Figure BDA0002891747290000072
Figure BDA0002891747290000081
进行3重PCR：
Figure BDA0002891747290000082
将PCR产物稀释50倍后,利用本发明中的通用型多重核酸产物检测胶体金试纸条进行检测。
结果如图4所示，从下往上(自试纸条的样品垫方向至稀释垫方向),检测线1为FITC(FAM)抗体-3G8捕获RdRP基因产物的结果、检测线2为TAMRA抗体-1E4捕获E基因产物的结果、检测线3为DIG抗体-2D6捕获N基因产物的结果、检测线4为CY5抗体-3A5捕获ORF1ab基因产物的结果,当大于10个拷贝/mL为强阳性。
本发明中，生物素抗体不但需要与金标溶液形成稳定的金标生物素抗体，成为稳定检测的前提，还需要在测定过程中满足与ITC(FAM)抗体-3G8、TAMRA抗体-1E4、DIG抗体-2D6、CY5抗体-3A5以及羊抗鼠IgG结合的需要，使测定结果满足能够同时、准确的检出多重PCR，避免结果出现漏检、或检测无效的情况。
取2mL离心管，分别加入碳酸钾溶液调节至最佳pH的胶体金溶液1mL，依次向各管中加入不同量的生物素抗体-4B6(5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg)，轻轻摇匀，室温反应30min后，在上述试管中加入0.1mL 10％NaCl后，混匀静置2小时后，观察结果。
观察结果显示，当加入量为8μg时，胶体金溶液保持稳定、不聚沉、颜色不发生显著变化，即生物素抗体抗体浓度为8μg/mL时，为最佳稳定标记量。
本发明进一步以0.5mg/mL羊抗鼠IgG的浓度喷到硝酸纤维膜上，与上述金标生物抗体结合后，控制线显色效果明显、良好。
以本发明实施例2为实验组(检测线上FITC(FAM)抗体-3G8 0.3mg/mL、TAMRA抗体-1E4 0.3mg/mL、DIG抗体-2D6 0.2mg/mL、CY5抗体-3A5 0.5mg/mL)同时设定4个对照组，比较体系灵敏度的变化。
将终浓度5nM生物素-FITC(FAM)双标记PCR核酸产物、5nM生物素-TAMRA双标记PCR核酸产物、5nM生物素-DIG双标记PCR核酸产物、5nM生物素-CY5双标记PCR核酸产物，混合后作为阳性检测物。
对照组1：检测线上FITC抗体-3G8、TAMRA抗体-1E4、DIG抗体-2D6、CY5抗体-3A5浓度均为0.1mg/mL；
对照组2：检测线上FITC抗体-3G8、TAMRA抗体-1E4、DIG抗体-2D6、CY5抗体-3A5浓度均为0.2mg/mL；
对照组3：FITC抗体-3G8、TAMRA抗体-1E4、DIG抗体-2D6、CY5抗体-3A5浓度均为0.3mg/mL；
对照组4：FITC抗体-3G8、TAMRA抗体-1E4、DIG抗体-2D6、CY5抗体-3A5浓度均为0.4mg/mL；
对照组5：FITC抗体-3G8、TAMRA抗体-1E4、DIG抗体-2D6、CY5抗体-3A5浓度均为0.5mg/mL；
对照组6：FITC抗体-3G8、TAMRA抗体-1E4、DIG抗体-2D6、CY5抗体-3A5浓度均为0.6mg/mL；
结果见表3：
表3灵敏度比较结果(生物素抗体浓度为8μg/mL)
Figure BDA0002891747290000091
注：表中+:表示T线淡红色++:表示T线浅红色+++:表示T线红色++++:表示T线深红色
结果如表3所示，实验组的条带颜色深度一致，均为深红色。而按照对比组1～6的浓度，在检测时会出现条带深浅不一，甚至造成漏检的可能，导致结果失真。即使FITC(FAM)抗体、TAMRA抗体、DIG抗体、CY5抗体的分子大小、分子量、与核酸结合能力、迁移能力存在诸多差异，而本发明的试纸条仍能保证在同一次检测中，出现颜色深浅一致的显色条带，避免漏检情况。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述检测线上包被有FITC单克隆抗体、TAMRA单克隆抗体、DIG单克隆抗体或CY5单克隆抗体中的至少两种，或者所述检测线上包被有FAM单克隆抗体、TAMRA单克隆抗体、DIG单克隆抗体或CY5单克隆抗体中的至少两种，所述金标垫上包被有胶体金标记的生物素单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，其特征在于，将包被浓度为0.3mg/mL的FITC单克隆抗体、0.3mg/mL的TAMRA单克隆抗体、0.2mg/mL的DIG抗体单克隆抗体、0.5mg/mL的CY5单克隆抗体或0.3mg/mLFAM单克隆抗体，按1μL/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线。
3.根据权利要求1所述的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，其特征在于，将0.5mg/mL的羊抗鼠抗体包被于质控线上。
4.根据权利要求1所述的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，其特征在于，将生物素单克隆抗体加入到金标缓冲液中，加入封闭液，混匀，离心,得到沉淀，将沉淀复溶得到胶体金标记的生物素单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条，其特征在于，将胶体金与0.2M碳酸钾混合得到金标缓冲液，其中，胶体金的金颗粒为40nm。
6.权利要求1所述的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将生物素单克隆抗体加入到金标缓冲液中，加入封闭液，混匀，离心,得到沉淀，将沉淀复溶得到胶体金标记的生物素单克隆抗体，并负载于基质上，干燥，得到胶体金垫；
(2)将FITC单克隆抗体、TAMRA单克隆抗体、DIG单克隆抗体或CY5单克隆抗体中的至少两种包被到硝酸纤维素膜上，或者将FAM单克隆抗体、TAMRA单克隆抗体、DIG单克隆抗体或CY5单克隆抗体中的至少两种包被到硝酸纤维素膜上，作为检测线；将羊抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上，做为质控线上；
(3)将胶体金垫、硝酸纤维素膜与底板、样品垫和吸水垫进行组装。
7.根据权利要求6所述的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将包被浓度为0.3mg/mL的FITC单克隆抗体、0.3mg/mL的TAMRA单克隆抗体、0.2mg/mL的DIG抗体单克隆抗体、0.5mg/mL的CY5单克隆抗体或0.3mg/mLFAM单克隆抗体，按1μL/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线。
8.根据权利要求6所述的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，将生物素单克隆抗体加入到金标缓冲液中，加入封闭液，混匀，离心,得到沉淀，将沉淀复溶，得到胶体金标记的生物素单克隆抗体。
9.根据权利要求6所述的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，将胶体金与0.2M碳酸钾混合，得到所述金标缓冲液，其中，胶体金的金颗粒为40nm。
10.根据权利要求8所述的通用型多核酸产物检测胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述封闭液为10％的牛血清白蛋白。
CN202110030584.7A 2021-01-11 2021-01-11 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用 Pending CN112881672A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110030584.7A CN112881672A (zh) 2021-01-11 2021-01-11 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110030584.7A CN112881672A (zh) 2021-01-11 2021-01-11 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112881672A true CN112881672A (zh) 2021-06-01

Family

ID=76046140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110030584.7A Pending CN112881672A (zh) 2021-01-11 2021-01-11 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112881672A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113999938A (zh) * 2021-11-29 2022-02-01 中国计量科学研究院 用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字pcr检测试剂及应用

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009165371A (ja) * 2008-01-11 2009-07-30 Univ Of Tokushima 二重標識融合ｐｃｒイムノクロマトグラフィー
CN102103143A (zh) * 2011-02-24 2011-06-22 南京基蛋生物科技有限公司 一种双指标检测用胶体金试纸条及其制备方法
CN102520172A (zh) * 2011-12-12 2012-06-27 北京陆桥技术有限责任公司 单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用
CN103215366A (zh) * 2013-04-25 2013-07-24 中国科学院广州生物医药与健康研究院 基于核酸酶和发夹dna探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法
CN104101706A (zh) * 2014-07-28 2014-10-15 国家纳米科学中心 一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法
CN104846068A (zh) * 2015-06-25 2015-08-19 南京钟鼎生物技术有限公司 一种快速检测核酸的方法
CN105301237A (zh) * 2015-10-12 2016-02-03 武汉中帜生物科技股份有限公司 一种用胶体金层析技术检测核酸的方法及试剂盒
CN105403707A (zh) * 2015-09-29 2016-03-16 南方医科大学 一种检测靶物质的信号放大方法及使用该方法的免疫层析试纸和装置
CN106676200A (zh) * 2017-01-17 2017-05-17 佛山科学技术学院 一种rt‑lamp核酸试纸条试剂盒及应用
CN107287349A (zh) * 2017-06-23 2017-10-24 河南农业大学 一种用于同时检测ndv、ibv和h9n2亚型aiv的多重rpa引物和探针及其检测方法
US20180319657A1 (en) * 2015-11-04 2018-11-08 Biocifer Pty Ltd Multiplex Lateral Flow Devices and Assays
CN110794130A (zh) * 2019-10-22 2020-02-14 中科佑隆（杭州）食安标准科技有限公司 一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法
CN111505275A (zh) * 2020-03-20 2020-08-07 浙江工业大学 一种基于Cas9核酸等温扩增的免疫层析多重基因检测方法
CN211771300U (zh) * 2019-12-10 2020-10-27 江苏猎阵生物科技有限公司 一种用于检测pcr扩增产物的检测装置
CN112034161A (zh) * 2020-04-03 2020-12-04 安徽省疾病预防控制中心（省健康教育所） 新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金家庭化快速检测方法及试纸条

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009165371A (ja) * 2008-01-11 2009-07-30 Univ Of Tokushima 二重標識融合ｐｃｒイムノクロマトグラフィー
CN102103143A (zh) * 2011-02-24 2011-06-22 南京基蛋生物科技有限公司 一种双指标检测用胶体金试纸条及其制备方法
CN102520172A (zh) * 2011-12-12 2012-06-27 北京陆桥技术有限责任公司 单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用
CN103215366A (zh) * 2013-04-25 2013-07-24 中国科学院广州生物医药与健康研究院 基于核酸酶和发夹dna探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法
CN104101706A (zh) * 2014-07-28 2014-10-15 国家纳米科学中心 一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法
CN104846068A (zh) * 2015-06-25 2015-08-19 南京钟鼎生物技术有限公司 一种快速检测核酸的方法
CN105403707A (zh) * 2015-09-29 2016-03-16 南方医科大学 一种检测靶物质的信号放大方法及使用该方法的免疫层析试纸和装置
CN105301237A (zh) * 2015-10-12 2016-02-03 武汉中帜生物科技股份有限公司 一种用胶体金层析技术检测核酸的方法及试剂盒
US20180319657A1 (en) * 2015-11-04 2018-11-08 Biocifer Pty Ltd Multiplex Lateral Flow Devices and Assays
CN106676200A (zh) * 2017-01-17 2017-05-17 佛山科学技术学院 一种rt‑lamp核酸试纸条试剂盒及应用
CN107287349A (zh) * 2017-06-23 2017-10-24 河南农业大学 一种用于同时检测ndv、ibv和h9n2亚型aiv的多重rpa引物和探针及其检测方法
CN110794130A (zh) * 2019-10-22 2020-02-14 中科佑隆（杭州）食安标准科技有限公司 一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法
CN211771300U (zh) * 2019-12-10 2020-10-27 江苏猎阵生物科技有限公司 一种用于检测pcr扩增产物的检测装置
CN111505275A (zh) * 2020-03-20 2020-08-07 浙江工业大学 一种基于Cas9核酸等温扩增的免疫层析多重基因检测方法
CN112034161A (zh) * 2020-04-03 2020-12-04 安徽省疾病预防控制中心（省健康教育所） 新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金家庭化快速检测方法及试纸条

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113999938A (zh) * 2021-11-29 2022-02-01 中国计量科学研究院 用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字pcr检测试剂及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK160108C (da) Fremgangsmåde og udstyr til direkte eller indirekte påvisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans
EP2530466B1 (en) Method and device for trichomonas detection
AU782582B2 (en) Immunochromatographic assay devices with separators
CN107765002B (zh) 一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN101017169B (zh) 生物样本分析装置
CN111273001A (zh) 一种快速检测血液样本中新冠状病毒2019-nCoV的系统及其制备方法
US8404479B2 (en) Simple membrane assay method and kit
JPH0312705B2 (zh)
CN108956989B (zh) 一种幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡及其制备方法
US20150079581A1 (en) Detection kit for influenza a virus
CN106324243A (zh) 一种胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法
JP4800739B2 (ja) アッセイ用媒体及びアッセイ方法
EP2290367A1 (en) Method for detecting objective substance and kit for detecting objective substance
CN116041489A (zh) 猴痘病毒结合蛋白及其应用、猴痘病毒检测试剂盒
CN112881672A (zh) 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用
JP2008275511A (ja) インフルエンザウイルス抗原の免疫測定法及びそれに用いられる物
JP3493544B2 (ja) 抗体アッセイ装置
CN116298297A (zh) 一种同时检测合胞病毒和新型冠状病毒抗原的胶体金层析试纸条
JP4365329B2 (ja) 複数の被検出物を検出する簡易アッセイ装置及び方法
CN114460287A (zh) 一种中和抗体的检测方法和试剂盒
Forghani Diagnosis by viral antigen detection
JP2001305139A (ja) 特異的結合体
EP0152254A2 (en) Chromogenic support immunoassay utilizing labeled complement components
CN114829935A (zh) 免疫测定方法及免疫测定工具
Chantler et al. 7 Labelled-Antibody Methods for Detection and Identification of Microorganisms

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination