CN113999938A - 用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字pcr检测试剂及应用 - Google Patents

用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字pcr检测试剂及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113999938A
CN113999938A CN202111434978.5A CN202111434978A CN113999938A CN 113999938 A CN113999938 A CN 113999938A CN 202111434978 A CN202111434978 A CN 202111434978A CN 113999938 A CN113999938 A CN 113999938A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
probe
new coronavirus
detection
sgrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111434978.5A
Other languages
English (en)
Inventor
董莲华
王霞
戴新华
牛春艳
张永卓
杨佳怡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Metrology
Original Assignee
National Institute of Metrology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Metrology filed Critical National Institute of Metrology
Priority to CN202111434978.5A priority Critical patent/CN113999938A/zh
Publication of CN113999938A publication Critical patent/CN113999938A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于检测具有传染性的活新冠病毒(SARS‑CoV‑2)的数字PCR方法及检测试剂盒，包括：用于检测SARS‑CoV‑2包膜蛋白E基因亚基因组(E‑sgRNA)和核衣壳蛋白N基因亚基因组(N‑sgRNA)的两对引物(引物1和引物2；引物3和引物4)和两条探针。本发明采用数字PCR(dPCR)技术针对新冠病毒的亚基因组进行检测，可以有效地判断出样本中是否含有传染性的新冠病毒即活病毒，可以第一时间对感染新冠病毒的病人进行确诊，还可以直接判断出该病人体内感染的病毒是否为具有传染性的活病毒，无需再取样进行病毒的体外分离和培养。从而做到对传染型和非传染型病人的精确分型和分流，减少大量医疗资源的浪费。

Description

用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字PCR检测试剂及 应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体是涉及一种用于检测具有传染性的活新冠病毒(SARS-CoV-2)的数字PCR检测试剂及应用。
背景技术
新冠病毒肆虐全球，感染人数近2亿，死亡人数超过400万。对人类社会造成了非常严重的破坏。早发现、早隔离、早治疗被证明是非常有效的疫情防控措施。早发现依赖于准确、灵敏、可靠的检测试剂盒。现阶段新冠病毒核酸检测作为作为辅助临床确诊的金标准，已经大量应用于疫情防控。而目前的核酸检测以荧光PCR方法为主，检测的靶标主要集中在新冠病毒基因组中的特征基因核衣壳蛋白基因(N)、开放阅读框1ab(ORF1ab)和包膜蛋白基因(E)，这些目标基因的检测可以有效识别新冠病毒的核酸是否存在，但无法区分存在的新冠病毒核酸是否具有传染性，即复制活性。
开发传染性新冠病毒检测试剂，可实现对新冠病毒感染患者的有效区分，从而及时对具有传染性的患者进行隔离，防止大规模传染至关重要。通过检测新冠病毒在样本中sgRNA的存在，可以直接判断出该病毒是否为具备传染性的活病毒。SgRNA的存在表明该病毒进入了复制阶段，因此即可以第一时间对感染新冠病毒的病人进行确诊，还可以直接判断出该病人体内感染的病毒是否为具有传染性的活病毒，无需再取样进行病毒的体外分离和培养。从而做到对传染型和非传染型病人的精确分流，减少大量医疗资源的浪费。
数字PCR与荧光PCR方法相比，具有如下优势：第一，可以对样本进行绝对定量。其定量结果直接为目的基因拷贝数(对应病毒个数)而非Ct值，为病程和疗效的判读提供量化的核酸水平依据。第二、缩小检测灰区，减少假阴性。数字PCR方法不依赖扩增曲线和Ct值的判断，更加直观，可有效避免人为错误，缩小检测灰区。在高灵敏的同时，具备核酸检测结果的高可靠性和重复性，有可能提升出院标准符合性的可信度。第三，可排除复杂样本对实验结果的干扰。不受PCR抑制物的影响，可避免样本复杂性导致的PCR假阴性，尤其适用于检测成分复杂的粪便样本或其他复杂样本，这一特性也可适用于检测成分复杂的环境样本。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种能够准确有效地检测具有传染性的活新冠病毒的数字PCR检测试剂、检测试剂盒及检测方法。
本发明的第一方面，提供了一种用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字PCR检测试剂，包含用于特异性扩增新冠病毒的E基因的亚基因组的特异性引物1和引物2以及特异性探针1；和用于特异性扩增新冠病毒的N基因的亚基因组的特异性引物3和引物4以及特异性探针2；所述引物1、引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述引物3和引物4的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQID No.5所示，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
和之前已有的新冠病毒核酸检测技术相比，本发明的技术最重要的是直接检测新冠病毒在复制转录过程中产生的亚基因组，即检测的是具有复制活性、具有传染性的活新冠病毒，该技术可以高精确度地区分假阴性、假阳性等。现存的新冠病毒核酸检测技术，以荧光PCR方法为主，检测的靶标集中在新冠病毒全基因组中的特征基因核衣壳蛋白基因(N)、开放阅读框1ab(ORF1ab)和包膜蛋白基因(E)，如图1所示。这些目标基因的检测虽然可以有效识别新冠病毒的核酸是否存在，但无法区分存在的新冠病毒是否具有传染性，即复制活性。这在临床应用时对于患者的分型造成了很大困扰。
新冠病毒作为一种RNA病毒，SARS-Cov-2进入宿主细胞复制基因组RNA并产生许多较小的RNA(称为亚基因组RNA)。新冠病毒的结构基因在进行翻译前必须要先转录成亚基因组RNA(subgenomic RNA,sgRNA)，故而针对这些亚基因组进行检测，则检测到的阳性结果就说明患者体内存在具有转录活性的活新冠病毒，这对于临床患者分型以及检测结果的准确性具有莫大的好处。亚基因组RNA包括前导序列、转录调控序列和目标基因序列。本发明的引物和探针即是通过设计特异性的上游引物结合亚基因组的前导序列，下游引物结合目标基因(E和N)，可以特异的检测出新冠病毒亚基因组的存在，如图2所示。
进一步地，本发明的检测试剂，其中所述探针1、探针2优选为VIC探针或FAM探针。
所述的检测试剂，其中所述引物1、引物2的反应浓度优选的在800nM，所述探针1的反应浓度优选的在400nM；所述引物3、引物4的反应浓度优选的在800nM，所述探针2的反应浓度优选的在200nM。
本发明的第二方面，提供了一种用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字PCR检测试剂盒，其中所述试剂盒中包括如上述的检测试剂。具体地，所述试剂盒包括：(1)第一容器，以及位于所述容器内的引物1、引物2和探针1；(2)第二容器，以及位于所述容器内的引物3、引物4和探针2；(3)其他试剂及使用说明书。所述其他试剂包括数字PCR反应酶试剂、阳性对照、阴性对照和无RNA酶水等。
在上述基础上，本发明提供一种用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字PCR检测方法，采用上述的检测试剂或检测试剂盒，对检测样本进行数字PCR检测。具体地，所述检测方法包括步骤：
(1)提供一检测样本，所述的检测样本是咽拭子、鼻拭子、痰液、粪便、肺泡灌洗液样本、新冠病毒感染的细胞培养液中的任一种；
(2)对所述的检测样本进行RNA抽提处理，获得RNA抽提物；
(3)步骤(2)所得到的RNA提取物为模板，采用特异性引物和探针，进行数字PCR反应，从而获得含E和N亚基因组的扩增产物；
(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出新冠病毒E和N基因亚基因组的拷贝数含量。
所述步骤(2)中，对于3ml样本而言，所述RNA提取物为50～100μL的浓度提取液。在步骤(3)中，所述dPCR扩增所使用的RNA模板量为0～100ng。所述的方法是非诊断且非治疗性的。
所述的检测方法，其中所述数字PCR反应的反应体系优选的包括：待测基因组：0～100ng，2X RT-ddPCR SuperMix for Probes：5μL，2μL ofreverse transcriptase，1μLof300 mM DTT，引物1和引物2：1.6μL，探针1：0.8μL，引物3和引物4：1.6μL，探针2:0.4μL；
PCR反应条件优选的为：45℃逆转录60min，95℃变性10min；随后94℃变性30sec，58℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。所述的步骤(4)包括：分析所述E-sgRNA引物对E-sgF/E-sgR，N-sgRNA引物对N-sgF/N-sgN，如新冠病毒E或N基因的亚基因组引物对扩增检测的拷贝数有一个大于2拷贝/反应，则判定为传染性新冠病毒阳性，若两个亚基因组引物对扩增为阴性，则判断为传染性新冠病毒阴性。
本发明提供的用于检测具有传染性的活新冠病毒(SARS-CoV-2)的数字PCR方法及检测试剂盒，包括：用于检测SARS-CoV-2包膜蛋白E基因的亚基因组(E-sgRNA)和核衣壳蛋白N基因(N-sgRNA)的亚基因组的两对引物(引物1和引物2；引物3和引物4)和两条探针(探针1和探针2)。本发明采用数字PCR(dPCR)技术针对新冠病毒的亚基因组进行检测，通过检测样本中sgRNA的存在，可以直接判断出该病毒是否具备传染性，即是否为活病毒。因此即可以第一时间对感染新冠病毒的病人进行确诊，还可以直接判断出该病人体内感染的病毒是否为具有传染性的活病毒，无需再取样进行病毒的体外分离和培养。从而做到对传染型和非传染型病人的精确分型和分流，减少大量医疗资源的浪费。
附图说明
图1为新冠病毒全基因组及常规试剂盒的检测靶标示意图；
图2为新冠病毒亚基因组及本发明中检测试剂和试剂盒的检测靶标示意图；
图3为E-sgRNA退火温度优化结果图(A01：54℃；A03：55℃；C05：56℃；A07：57℃；B09：58℃；A11：59℃)。
图4为N-sgRNA退火温度优化结果图(A01：54℃；A03：55℃；C05：56℃；A07：57℃；B09：58℃；A11：59℃)。
图5为E-sgRNA引物和探针浓度优化结果图(A01：引物浓度400nM+探针浓度100nM；C01：引物浓度400nM+探针浓度200nM；E01：引物浓度400nM+探针浓度400nM；H01：引物浓度400nM+探针浓度500nM；A02：引物浓度600nM+探针浓度100nM；C02：引物浓度600nM+探针浓度200nM；E02：引物浓度600nM+探针浓度400nM；G02：引物浓度600nM+探针浓度500nM；A03：引物浓度800nM+探针浓度100nM；C03：引物浓度800nM+探针浓度200nM；F03：引物浓度800nM+探针浓度400nM；H03：引物浓度800nM+探针浓度500nM；A04：引物浓度900nM+探针浓度100nM；C04：引物浓度900nM+探针浓度200nM；E04：引物浓度900nM+探针浓度400nM；H04：引物浓度900nM+探针浓度500nM)。
图6为N-sgRNA引物和探针浓度优化结果图(B01：引物浓度400nM+探针浓度100nM；D01：引物浓度400nM探针浓度200nM；F01：引物浓度400nM+探针浓度400nM；H01：引物浓度400nM+探针浓度500nM；B02：引物浓度600nM+探针浓度100nM；D02：引物浓度600nM+探针浓度200nM；F02：引物浓度600nM+探针浓度400nM；H02：引物浓度600nM+探针浓度500nM；B03：引物浓度800nM+探针浓度100nM；D03：引物浓度800nM+探针浓度200nM；F03：引物浓度800nM+探针浓度400nM；H03：引物浓度800nM+探针浓度500nM；B04：引物浓度900nM+探针浓度100nM；D04：引物浓度900nM+探针浓度200nM；F04：引物浓度900nM+探针浓度400nM；H04：引物浓度900nM+探针浓度500nM)。
图7为E-sgRNA检测不同水平样本得到的线性方程。
图8为N-sgRNA检测不同水平样本得到的线性方程。
图9为N-sgRNA基因检测不同样本特异性扩增结果图(A04：N-sgRNA基因+假病毒RNA；C04：假病毒RNA；E04：N-sgRNA基因+基因组RNA；H04：基因组RNA；A05：N-sgRNA基因+4个基因片段；C05：4个基因片段)。
图10为E-sgRNA基因检测不同样本特异性扩增结果图(A05：E-sgRNA基因+假病毒RNA；C05：假病毒RNA；E05：E-sgRNA基因+基因组RNA；G05：基因组RNA；A06：E-sgRNA基因+4个基因片段；D06：4个基因片段)。
图11为N-sgRNA基因特异性扩增结果图(B01：N-sgRNA基因检测N-sgRNA样本；D01：N-sgRNA基因检测E-sgRNA样本；F01：N-sgRNA基因检测N-sgRNA和E-sgRNA混合样本；B03：N-sgRNA和E-sgRNA基因检测N-sgRNA样本；E03：N-sgRNA和E-sgRNA基因检测E-sgRNA样本；G03：N-sgRNA和E-sgRNA基因检测N-sgRNA和E-sgRNA混合样本)。
图12为E-sgRNA基因特异性扩增结果图(B02：E-sgRNA基因检测E-sgRNA样本；E02：E-sgRNA基因检测N-sgRNA样本；G02：E-sgRNA基因检测E-sgRNA和N-sgRNA混合样本；B03：E-sgRNA和N-sgRNA基因检测N-sgRNA样本；E03：E-sgRNA和N-sgRNA基因检测E-sgRNA样本；G03：E-sgRNA和N-sgRNA基因检测E-sgRNA和E-sgRNA混合样本)。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
本发明人经过长期而深入的研究，发现采用dPCR扩增技术，设计特异性的新冠病毒亚基因组检测引物和探针，从而对传染性新冠病毒进行准确检测，能够极大程度地排除假阴性和假阳性的情况，从而能更准确的判断是否为传染性的新冠病毒。基于上述发现，发明人完成了本发明。
具体的，本发明人进行了如下研究工作：
一、设计了两对特异性扩增新冠病毒亚基因组的引物和探针
根据新冠病毒亚基因组的存在形式，分别针对E基因和N基因序列以及前导序列(见图2)，采用PrimerExpress3.0设计了两对特异性引物和探针。并采用Blast进行了比对，发现其结合新型冠状病毒的基因特异性高，无潜在非特异性扩增区。所述特异性引物和探针包括用于特异性扩增新冠病毒的E基因的亚基因组的特异性引物1和引物2以及特异性探针1；和用于特异性扩增新冠病毒的N基因的亚基因组的特异性引物3和引物4以及特异性探针2；所述引物1、引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述引物3和引物4的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
序列编号 名称 核苷酸序列
SEQ ID No.1 E-sgF CCCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC
SEQ ID No.2 E-sgR ATATTGCAGCAGTACGCACACAGA
SEQ ID No.3 E-sgP-VIC ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGG
SEQ ID No.4 N-sgF CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCT
SEQ ID No.5 N-sgR TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTGG
SEQ ID No.6 N-sgP-FAM FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BH1
二、优化了两对特异性扩增新冠病毒亚基因组的引物和探针扩增条件
将E-sgRNA的引物的终浓度固定在600nM，探针浓度固定在200nM条件下(图3)，分别设置退火温度为54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。
将N-sgRNA的引物的终浓度固定在800nM，探针浓度固定在400nM条件下(图4)，分别设置退火温度为54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。
从扩增结果(图3和图4)一维散点图看，四个退火温度下均得到了较好的扩增，54℃时阳性微滴和阴性微滴两簇微滴分散的最好，但从定量结果重复性看，58℃条件下的重复性最好，因此确定了58℃为最佳退火温度。
然后进行引物和探针浓度优化，引物浓度分别设定了400nM、600nM、800nM、900nM，探针浓度分别设定了100nM、200nM、400nM、500nM，进行优化(图5和图6)。引物浓度不变时，探针浓度由100nM增加至500nM时，阴性微滴和阳性微滴荧光强度都在增加，而且阴性和阳性微滴的分离程度增加，当探针浓度不变时，引物从400nM增加到900nM时，阴性微滴的荧光强度没有变化，而阳性微滴的荧光强度在增加，所以导致阴性和阳性微滴的分离程度在增加，但随着探针浓度的增加，阳性微滴的分散的范围越来越大，结合定量结果的重复性因素综合考虑后确定了E-sgRNA探针的浓度为400nM，引物浓度在800nM；N-sgRNA探针的浓度为200nM，引物浓度在800nM。最终确定的微滴数字PCR反应的体系为：2×ddPCR mastermix 10μL，E基因亚基因组引物上下游1.6μL，探针0.8μL，N基因亚基因组引物上下游1.6μL，探针0.4μL，DNA模板4μL，ddH2O补足20μL。PCR反应程序：45℃60min,95℃10min，94℃30s，58℃60s，40cycles，98℃10min。
三、对E-sgRNA和N-sgRNA数字PCR检测方法的线性范围进行了研究
在利用数字PCR方法检测核酸浓度时，需要将核酸浓度稀释到数字PCR的检测围内进行检测。将E-sgRNA和N-sgRNA的模板梯度稀释后，进行微滴式数字PCR扩增反应，结果表明，实验所建立的数字PCR方法在至少5个数量级范围内线性关系良好，E-sgRNA和N-sgRNA基因对应的R2分别为1和0.9985(图7和图8)。
继而对N-sgRNA数字PCR检测方法的检出限进行了研究。
根据相关规范的要求，对已经浓度的目标RNA进行梯度稀释，每个浓度重复测定3-6次，统计每个浓度下几次重复对应的变异系数(CV)，根据CV<25％，确定方法的定量限。E-sgRNA和N-sgRNA基因的定量限分别为：10copies/反应和9copies/反应(表1和表2)。
对稀释最低浓度2cp/反应的浓度进行重复检测，检出阳性微滴的结果大于95％，因此确定了两个基因的检出限为2cp/反应。
表1：E-sgRNA的定量限结果
Figure BDA0003381467750000101
表2：N-sgRNA的定量限结果
Figure BDA0003381467750000102
四、利用ddPCR技术检测不同类型的样本(特异性验证)
利用数字PCR对加入和不加入N-sgRNA和E-sgRNA的新冠全序列假病毒提取的RNA、从真病毒提取的RNA基因组，以及N、E、Orf1ab和S基因的片段的样本进行检测。结果显示N-sgRNA方法只有在N-sgRNA模板样本和病毒培养液提取的RNA基因组样本有扩增外，其他的样本中并未出现扩增，病毒培养液提取的RNA基因组样本有扩增是因为该样本可能含有感染性的病毒(图9)。E-sgRNA方法在只有含有E-sgRNA的样本才出现扩增(图10)。同时用单探针和双探针检测单样本和双样本，无交叉反应，两个方法的特异性很好(图11和图12)。
综合上述，本发明技术同现有技术相比，其创新点和优点是：
(1)本发明的方法采用E亚基因组和N亚基因组特异性引物探针，是直接对复制转录中的病毒亚基因组进行检测，可以直接判断该病毒是否具有传染性，这是目前所有其他试剂盒无法实现的。
(2)本发明的检测方法具有较高的灵敏度，最低可检测2拷贝/反应，相当于50拷贝/ml。
(3)本发明的方法采用E亚基因组和N亚基因组特异性引物探针方式进行，两组引物分别结合在不同的亚基因组，从而有效地排除了单一引物探针扩增导致的假阴性结果，具有更高的可靠性和准确性。
(4)在本领域中，本方法具有高灵敏度和重复性，可以判定常规检测方法结果不确定的区域。
(5)本发明中采用了数字PCR，可以直接给出活病毒亚基因组的拷贝数，可以用于疫苗保护效果评价和对病人治疗效果的评价。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国计量科学研究院
<120> 用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字PCR检测试剂及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccgatctct tgtagatctg ttctc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atattgcagc agtacgcaca caga 24
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acactagcca tccttactgc gcttcgg 27
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgatctcttg tagatctgtt ctct 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctggttact gccagttgaa tctgg 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accccgcatt acgtttggtg gacc 24

Claims (10)

1.一种用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字PCR检测试剂，其特征在于，包含用于特异性扩增新冠病毒的E基因的亚基因组的特异性引物1和引物2以及特异性探针1；和用于特异性扩增新冠病毒的N基因的亚基因组的特异性引物3和引物4以及特异性探针2；所述引物1、引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述探针1的核苷酸序列如SEQID No.3所示，所述引物3和引物4的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述探针1、探针2为VIC探针或FAM探针。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于，所述引物1、引物2的反应浓度在800nM，所述探针1的反应浓度在400nM。
4.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于，所述引物3、引物4的反应浓度在800nM，所述探针2的反应浓度在200nM。
5.一种用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1-4任一项所述的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)第一容器，以及位于所述容器内的引物1、引物2和探针1；(2)第二容器，以及位于所述容器内的引物3、引物4和探针2；(3)其他试剂及使用说明书。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述其他试剂包括数字PCR反应酶试剂、阳性对照、阴性对照和无RNA酶水。
8.一种用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的检测试剂或权利要求5-7任一项所述的检测试剂盒，对检测样本进行数字PCR检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括步骤：
(1)提供一检测样本，所述的检测样本是咽拭子、鼻拭子、痰液、粪便、肺泡灌洗液样本、新冠病毒感染的细胞培养液中的任一种；
(2)对所述的检测样本进行RNA抽提处理，获得RNA抽提物；
(3)步骤(2)所得到的RNA提取物为模板，采用特异性引物和探针，进行数字PCR反应，获得含E和N亚基因组的扩增产物；
(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出新冠病毒E和N基因亚基因组的拷贝数含量。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述数字PCR反应的反应体系包括：待测基因组：0～100ng，2X RT-ddPCR SuperMix forProbes：5μL，2μL ofreversetranscriptase，1μL of300 mM DTT，引物1和引物2：1.6μL，探针1：0.8μL，引物3和引物4：1.6μL，探针2:0.4μL；
PCR反应条件为：45℃逆转录60min，95℃变性10min；随后94℃变性30sec，58℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。
CN202111434978.5A 2021-11-29 2021-11-29 用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字pcr检测试剂及应用 Pending CN113999938A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111434978.5A CN113999938A (zh) 2021-11-29 2021-11-29 用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字pcr检测试剂及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111434978.5A CN113999938A (zh) 2021-11-29 2021-11-29 用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字pcr检测试剂及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113999938A true CN113999938A (zh) 2022-02-01

Family

ID=79930706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111434978.5A Pending CN113999938A (zh) 2021-11-29 2021-11-29 用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字pcr检测试剂及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113999938A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116769974A (zh) * 2023-08-14 2023-09-19 吉林省药品检验研究院 应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111197112A (zh) * 2020-04-02 2020-05-26 广州安必平医药科技股份有限公司 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒
CN111926115A (zh) * 2020-07-25 2020-11-13 兰州大学 一种用于新型冠状病毒微滴式数字pcr检测的试剂盒
CN112881672A (zh) * 2021-01-11 2021-06-01 南京钟鼎生物技术有限公司 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用
CN113215312A (zh) * 2021-04-28 2021-08-06 山东莱博生物科技有限公司 一种冠状病毒SARS-CoV-2数字PCR多重检测试剂盒及其应用
CN113230395A (zh) * 2020-05-29 2021-08-10 中国科学院微生物研究所 一种β冠状病毒抗原、β冠状病毒二联疫苗及其制备方法和应用
CN113684316A (zh) * 2020-09-07 2021-11-23 四川大学华西医院 基于数字pcr的新型冠状病毒检测试剂盒及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111197112A (zh) * 2020-04-02 2020-05-26 广州安必平医药科技股份有限公司 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒
WO2021196498A1 (zh) * 2020-04-02 2021-10-07 广州安必平医药科技股份有限公司 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒
CN113230395A (zh) * 2020-05-29 2021-08-10 中国科学院微生物研究所 一种β冠状病毒抗原、β冠状病毒二联疫苗及其制备方法和应用
CN111926115A (zh) * 2020-07-25 2020-11-13 兰州大学 一种用于新型冠状病毒微滴式数字pcr检测的试剂盒
CN113684316A (zh) * 2020-09-07 2021-11-23 四川大学华西医院 基于数字pcr的新型冠状病毒检测试剂盒及应用
CN112881672A (zh) * 2021-01-11 2021-06-01 南京钟鼎生物技术有限公司 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用
CN113215312A (zh) * 2021-04-28 2021-08-06 山东莱博生物科技有限公司 一种冠状病毒SARS-CoV-2数字PCR多重检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARCO FAVARO 等: "A new qualitative RT‑PCR assay detecting SARS‑CoV‑2", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
王迪 等: "SARS—CoV一2基因组RNA标准物质的研制", 《计量学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116769974A (zh) * 2023-08-14 2023-09-19 吉林省药品检验研究院 应用数字pcr检测多价疫苗各组分rna比例的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111394519B (zh) 基于数字pcr的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用
CN111500776A (zh) 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法
CN110273027B (zh) 诺如病毒gⅰ、gⅱ和gⅳ型核酸分型检测试剂盒及检测方法
WO2021212523A1 (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN106957925A (zh) 一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测试剂盒及引物和探针
CN113604607A (zh) 快速检测猫疱疹病毒的era核酸试纸条扩增试剂盒及制备方法和检测方法
WO2022068079A1 (zh) 一种基于微滴式数字pcr技术的乙型肝炎病毒t216c突变检测方法
CN113774168A (zh) 2019新型冠状病毒及其德尔塔和拉姆达变异株分型核酸检测试剂盒及检测方法
CN105256074A (zh) 双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测鸭甲肝病毒的试剂盒及方法
CN112695134A (zh) 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法
CN113774169A (zh) 2019新型冠状病毒德尔塔变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法
CN112094944A (zh) 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒
CN112662809A (zh) 一种用于新型冠状病毒covid-19检测的核酸组合物及其应用
CN114634996B (zh) 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、试剂盒及其应用
CN113999938A (zh) 用于检测具有传染性的活新冠病毒的数字pcr检测试剂及应用
WO2022257002A1 (en) Rt-pcr detection reagent for detecting novel coronavirus, kit and detection method thereof
CN113817872A (zh) 2019新型冠状病毒拉姆达变异株核酸检测试剂、试剂盒及检测方法
CN111471800B (zh) 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN112662808A (zh) 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测试剂盒及其检测方法
CN105950788A (zh) 检测18种高危型hpv核酸的引物、探针及试剂盒
CN116254371A (zh) 一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用
CN112266980A (zh) 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
CN111074006B (zh) Salivirus病毒的双通道实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒、方法及应用
CN112280902B (zh) 一种TaqMan探针荧光定量PCR检测软疣病毒的方法及应用
CN113005225B (zh) 一种同时检测oya病毒、lnv和泰纳病毒的核酸组合物、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination