CN106957925A - 一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测试剂盒及引物和探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测试剂盒及引物和探针。所述引物和探针如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12所示。本发明还公开了快速、准确、使用方便的同时检测和鉴别伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV‑2)的一步法多重荧光PCR检测试剂盒。本发明的检测方法可以实现一次采样，一次分析，可同时检测和区分3种重要猪病的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防治赢得时间。

Description

一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病 毒的检测试剂盒及引物和探针
技术领域
本发明涉及一种可同时检测和鉴别伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的一步法多重荧光PCR检测试剂盒及引物和探针，可实现一次采样，一次分析，同时检测和区分3种猪病毒的目的，属于检验检疫领域。
背景技术
伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)是引起猪多系统疾病的常见病原，经常混合感染，诊断和防治比较困难，是危害养猪业最为严重的几种病原，是世界各国的重点防控疫病，也是我国养猪场检疫净化的主要对象。
目前，针对上述几种猪病病原建立了多种分子检测技术，如PCR和荧光PCR技术等，在这些疫病的诊断和防控中发挥了重要作用。但目前所建立的方法多是针对一种病原的单目标检测，在实际检测中需要重复多次，才能完成检测不同病原的目的，检测工作量大且时间长，不能满足大批量动物检疫快速通关的实际需要。且难以实现实际样品中大量存在的混合感染以及症状相似疫病的鉴别诊断。在建立单目标病原检测技术的同时，各国兽医机构也相继研制了可同时检测牛常见病毒的多重PCR，但传统PCR技术灵敏度低、结果不易判定等缺点限制了其在多重检测中的应用。
本研究利用荧光PCR技术在核酸检测方面具有的特异、敏感等特性，建立了PRV、PPV和PCV-2三种猪病毒一步法多重荧光PCR检测和鉴别方法并组装成试剂盒，可以实现一次采样，一次分析，可同时检测和鉴别3种重要猪病的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防治赢得时间。
发明内容
本发明的第一个目的是提供特异性强、灵敏度高的同时检测和鉴别伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的多重荧光PCR引物和探针。
本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的同时检测和鉴别伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的一步法多重荧光PCR检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
在序列比对分析的基础上，针对伪狂犬病毒gE基因、猪细小病毒NS1基因和猪圆环病毒2型ORF2基因，分别设计并筛选出能覆盖大部分分离株又适合多重检测并能进行鉴别的引物和探针(序列见表1)。伪狂犬病毒(PRV)引物对由1条正向引物、1条反向引物和1条探针组成，猪细小病毒(PPV)引物对由1条正向引物、1条反向引物和1条探针组成，猪圆环病毒2型(PCV-2)引物对由1条正向引物、3条反向引物和2条探针组成，多重反应体系中引物混合物是这7条引物组成的混合物，探针混合物是这4条探针组成的探针混合物，经过多重荧光PCR反应，可以实现三种病原的同时检测和鉴别。
表1 伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型一步法多重荧光PCR检测引物和探针
注：胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)。简并碱基W代表A或T，简并碱基Y代表C或T，简并碱基R代表G或A，简并碱基K代表G或T。探针5‘端标记有发光基团，探针3‘端标记有淬灭基团。
我们采用多重荧光PCR技术建立了同时检测和鉴别伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的检测方法并组装了试剂盒。
检测和鉴别伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的一步法多重荧光PCR检测试剂盒，包括上述多重荧光PCR检测引物和探针。进一步地，该试剂盒还包括完成多重荧光PCR反应所需的材料和试剂，例如，反应缓冲液、酶、阳性对照、阴性对照等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述反应缓冲液为IQ Powermix PCR反应缓冲液；所述阴性对照为无核酸灭菌水；所述阳性对照分别为伪狂犬病毒(PRV)gE基因的体外DNA标准品；PPV阳性对照为猪细小病毒(PPV)NS1基因的体外DNA标准品；PCV-2阳性对照为猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因的体外DNA标准品。
本发明还提供了一种检测和鉴别伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的一步法多重荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取病毒总核酸；
(2)配制PCR反应体系，其中，所述反应体系中包含上述的多重荧光PCR引物和探针；
(3)进行一步法多重荧光PCR反应；
(4)结果判定；
①质控标准：
阳性对照均有S形扩增曲线，CT值大约在20左右，阴性对照无扩增信号。
满足此条件，视为此次试验有效。
②结果判断：
有扩增曲线，且CT值在30以下的判定为阳性；
有扩增曲线，但30<CT值<35的，属于疑似区间，需要重新确认；
没有扩增曲线或者CT值大于35的，判定为阴性。
本发明的优点是：1)多重性：可同时检测并区分伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型，节约了检测时间和成本，有利于疫病特别是混合感染的及时诊断。2)灵敏：此多重荧光PCR体系可以同时检测三种病原，其特异性与单个荧光PCR相当。3)特异：设计引物和探针时充分考虑了病原之间可能存在的干扰，经过筛选保证了引物和探针的特异性和排他性。3)涵盖性和通用性好：本发明中设计的引物和探针都分别针对伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型最保守的基因设计，可以实现每种病毒不同亚型或血清型之间的通用检测。对于每个病毒，其引物和探针都是多条，而且包含了简并引物，基本上覆盖了Genebank中现有该种病毒的所有序列。4)简便、易自动化：所有引物和探针的设计都是从可以进行多重检测考虑，不管是DNA或RNA病毒，都可以使用该一步法程序，省却了反转录过程，省时省力。
附图说明
图1：PRV单荧光PCR标准曲线。
图2：PPV单荧光PCR标准曲线。
图3：PCV-2单荧光PCR标准曲线。
图4：PRV,PPV和PCV-2多重荧光PCR标准曲线。
图5：PRV单荧光PCR与多重荧光PCR的比较。
图6：PPV单荧光PCR与多重荧光PCR的比较。
图7：PCV-2单荧光PCR与多重荧光PCR的比较。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1试剂盒的组成和使用
1.试剂盒的配制组成
表2 试剂盒的组成
组份(50Tests/kit) 数量
2×IQ Powermix PCR缓冲液 600μL×1管
引物混合物 90μL×1管
PRV探针 25μL×1管
PPV探针 15μL×1管
PCV-2探针 15μL×1管
PRV阳性对照 60μL×1管
PPV阳性对照 60μL×1管
PCV-2阳性对照 60μL×1管
阴性对照 60μL×1管
DEPC处理水 500μL×1管
其中2×IQ Powermix PCR缓冲液购自BioRad公司产品IQ Mulitiplex PowermixKit。
引物混合物包括PRV的1条正向引物、1条反向引物，PPV的1条正向引物、1条反向引物以及PCV-2的1条正向引物和3条反向引物，引物序列如表1，混合引物的工作浓度为400nM，引物委托大连宝生物公司合成。
PRV探针有1条、PPV探针有1条，PCV-2探针包括2条，探针序列如表1，浓度分别为200nM，探针委托大连宝生物公司合成。
阴性对照为无核酸灭菌水。
PRV阳性对照为伪狂犬病毒(PRV)gE基因的体外DNA标准品；PPV阳性对照为猪细小病毒(PPV)NS1基因的体外DNA标准品；PCV-2阳性对照为猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因的体外DNA标准品。
伪狂犬病毒(PRV)gE基因体外DNA标准品的制备：
通过BioEdit基因分析软件对GenBank上登录的PRV各毒株gE基因序列进行比对分析，利用PrimerPrimer3.0软件设计特异性引物，从PRV南阳株中扩增PRV-gE基因序列(长度为399bp。将获得的特异性PCR产物连接于pGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取白色菌落，提取质粒，经PCR和酶切鉴定为阳性后，获得包含PRV-gE基因的阳性重组质粒，命名为PRV-gE-DNA，并经过序列测定确认，保存于-20℃备用。伪狂犬病毒南阳株gE基因序列如序列表中SEQ ID NO：13所示。
猪细小病毒(PPV)NS1基因体外DNA标准品的制备：
通过BioEdit基因分析软件对GenBank上登录的PPV各毒株NS1基因序列进行比对分析，利用PrimerPrimer3.0软件设计特异性引物，扩增PPV-NS1基因序列(长度为500bp)。将获得的特异性PCR产物连接于pGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取白色菌落，提取质粒，经PCR和酶切鉴定为阳性后，获得包含PPV-NS1基因的阳性重组质粒，命名为PPV-NS1-DNA，并经过序列测定确认，保存于-20℃备用。猪细小病毒PPV-NS1基因序列如序列表中SEQ ID NO：14所示。
猪圆环病毒(PCV-2)ORF2基因体外DNA标准品的制备：
通过BioEdit基因分析软件对GenBank上登录的PCV-2各毒株ORF-2基因序列进行比对分析，利用PrimerPrimer3.0软件设计特异性引物，扩增PCV2-ORF2基因序列(长度为666bp)。将获得的特异性PCR产物连接于pGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取白色菌落，提取质粒，经PCR和酶切鉴定为阳性后，获得包含PCV2-ORF2基因的阳性重组质粒，命名为PCV2-ORF2-DNA，并经过序列测定确认，保存于-20℃备用。猪圆环病毒PCV2-ORF2基因序列如序列表中SEQ ID NO：15所示。
2.试剂盒的使用方法
1)提取病毒总核酸(RNA/DNA)
病毒核酸的提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(TIANamp Virus DNA/RNAKit)，步骤如下：
Carrier RNA溶液的配制：
(1)Carrier RNA储存液：向装有310μg Carrier RNA冻干粉的管子中加入310μLRNase-Free ddH2O，将Carrier RNA彻底溶解，得到终浓度为1μg/μL的溶液，并分装、置于-20℃储存。
(2)Carrier RNA工作液：根据样品的数量计算所需缓冲液GB和Carrier RNA溶液的体积(计算公式如下)，将缓冲液GB与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液；为避免溶液出现起泡现象，请勿使用涡旋振荡。
计算公式：
n×0.22mL＝y mL
y mL×28μL/mL＝zμL
式中n＝同时提取的样品个数，y＝需要加入缓冲液GB的体积，z＝需要加入Carrier RNA溶液的体积。
病毒总核酸的提取：
(1)用移液器将20μL Proteinase K加入一个干净的1.5ml离心管中。
(2)向离心管中加入200μL血浆/血清/淋巴液或25mg磨碎的组织(样品需平衡至室温)，如果样本体积小于200μL，可加入0.9％NaCl溶液补充。
(3)加入200μL Carrier RNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀。
(4)56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
(5)加入250μL无水乙醇，涡旋振荡15sec，彻底混匀，在室温(15-25℃)放置5min。
(6)简短离心，以收集附着在管壁及管盖的液体。
(7)将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
(8)小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
(9)小心打开吸附柱盖子，加入600μL溶液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，静置2min，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
(10)重复步骤(9)。
(11)小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液。
(12)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。
(13)将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管(1.5ml)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150μLRNase-FreeddH2O，盖上盖子，室温放置5min。
(14)12,000rpm(～13,400×g)离心1min，收集到的即为病毒总核酸(DNA或RNA)。
2)荧光PCR检测
分别取检测样品、阳阴性对照，按照下表3配制反应体系：
表3 一步法多重荧光PCR反应体系：总体积20uL
混合液组份 体积(uL) 终浓度(nM)
2×IQ Powermix PCR缓冲液 10 1×
引物混合物 0.8 400
PRV探针 0.4 200
PPV探针 0.2 200
PCV-2探针 0.2 200
模板DNA 1
DEPC处理水 7.4
反应总体积 20
将混合液充分混合后，最后加入模板，简短离心，按照下列反应程序，进行一步法荧光PCR反应，见表4：
表4 多重荧光PCR反应程序
3)结果描述及判定
①质控标准：
阳性对照均有S形扩增曲线，CT值大约在20左右，阴性对照无扩增信号。
满足此条件，视为此次试验有效。
②结果判断：
有扩增曲线，且CT值在30以下的判定为阳性；
有扩增曲线，但30<CT值<35的，属于疑似区间，需要重新确认；
没有扩增曲线或者CT值大于35的，判定为阴性。
实施例2、试剂盒的敏感性试验
1、材料
伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型均由本实验室保存。
2、方法
1)阳性标准品的制备
如实施例1所述的方法。
2)标准品定量测定
取制备好的体外DNA标准品用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，用紫外分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值(OD260和OD280)，计算待测样品的浓度与纯度。纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存)。DNA样品的浓度(μg/μL)：OD260×稀释倍数×50/1000。同时根据测序结果，按以下公式计算拷贝数(Copies/μL)：
标准曲线绘制：
将PRV体外标准品进行10倍梯度稀释后进行荧光PCR，用模板浓度倒数与对应的荧光CT值做浓度标准曲线，PCR扩增效率E值、相关系数R2值和曲线斜率Slope值都落在可接受范围内，说明扩增效率良好。见图1。
将PPV体外标准品进行10倍梯度稀释后进行荧光PCR，用模板浓度倒数与对应的荧光CT值做浓度标准曲线，PCR扩增效率E值、相关系数R2值和曲线斜率Slope值都落在可接受范围内，说明扩增效率良好。见图2。
将PCV-2体外标准品进行10倍梯度稀释后进行荧光PCR，用模板浓度倒数与对应的荧光CT值做浓度标准曲线，PCR扩增效率E值、相关系数R2值和曲线斜率Slope值都落在可接受范围内，说明扩增效率良好。见图3。
将PRV、PPV和PCV-2体外标准品等量混合后，再进行10倍梯度稀释，进行多重荧光PCR，用模板浓度倒数与对应的荧光CT值做浓度标准曲线，PCR扩增效率E值、相关系数R2值和曲线斜率Slope值都落在可接受范围内，说明多重PCR之间没有互相干扰，扩增效率良好。见图4。
3)一步法多重荧光PCR方法检测极限的确定
将上述定量的DNA溶液调整为浓度大致相当，每种各取10μL，充分混匀后，制成阳性标准品。将该标准品10倍梯度稀释后，按最佳条件进行荧光PCR检测，最高稀释倍数所能检测出的CT值所对应的的浓度即为最低检测限。
3、结果
1)DNA溶液拷贝数测定结果
将制备好的体外DNA标准品，分别用紫外分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值并推算出拷贝数，详见下表5。
表5 DNA纯度及含量测定
2)多重荧光RT-PCR方法检测限的确定
利用建立的多重荧光PCR检测方法，对10倍系列稀释的阳性标准品进行检测，结果该方法可稳定检测到的最高CT值为35，所对应的的标准品浓度达到1-10拷贝数/反应。
实施例3、试剂盒的特异性试验
1材料
本试验中所用到的病毒如表6。
表6 特异性试验研究过程中应用到的病毒和核酸
2、方法
2.1分别用伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的引物和探针对表格中的其他8种病毒核酸进行荧光PCR检测，以验证引物和探针的特异性。
2.2利用建立的多重荧光PCR检测方法对表格中的9种病毒进行检测，验证多重荧光PCR方法的特异性。
2.3进行多重荧光PCR和单荧光PCR比较。
3、结果
3.1每种病毒的引物和探针只能从自己的病毒核酸中扩增出曲线，其他病毒模板的扩增均为阴性，表明所设计的引物和探针特异性良好。
3.2利用建立的多重荧光PCR方法对表格6中的病毒进行检测，结果伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型有扩增曲线，其它病毒均无特异性的扩增信号，表明所建立的方法特异性良好。
表7 特异性检测结果
3.3将PRV、PPV和PCV-2体外标准品等量混合后，再进行10倍梯度稀释，分别进行多重荧光PCR和PRV单荧光PCR，将相同模板浓度对应的荧光CT值进行比较，求解回归方程，二者之间相关系数R2值达到了0.9997，说明单荧光PCR和多重荧光PCR之间符合性良好，多重荧光PCR没有产生干扰，没有影响扩增效率。见图5。
将PRV、PPV和PCV-2体外标准品等量混合后，再进行10倍梯度稀释，分别进行多重荧光PCR和PPV单荧光PCR，将相同模板浓度对应的荧光CT值进行比较，求解回归方程，二者之间相关系数R2值达到了0.9905，说明单荧光PCR和多重荧光PCR之间符合性良好，多重荧光PCR没有产生干扰，没有影响扩增效率。见图6。
将PRV、PPV和PCV-2体外标准品等量混合后，再进行10倍梯度稀释，分别进行多重荧光PCR和PCV-2单荧光PCR，将相同模板浓度对应的荧光CT值进行比较，求解回归方程，二者之间相关系数R2值达到了0.9937，说明单荧光PCR和多重荧光PCR之间符合性良好，多重荧光PCR没有产生干扰，没有影响扩增效率。见图7。
实施例4：试剂盒对临床样品检测的实验报告
1、材料
实验室收集的已知PRV阳性组织样品21份，PPV阳性组织样品42份，PCV-2阳性组织样品41份。
2、方法
对实验室收集的已知阳性样品进行多重荧光PCR检测，用实际样品验证方法的敏感性和特异性。
3、结果
临床样品的检测结果如表8。由表8可知，用多重荧光PCR进行检测时，已知21份PRV阳性全部为PRV阳性，42份PPV阳性样品全部为PPV阳性，41份PCV-2阳性样品全部为PCV-2阳性。有趣的是，由于这些已知样品原来只做了单目标检测，其他病毒感染情况未知，但是通过本发明描述的多重荧光PCR检测，发现在这共计104份样品中，有14份为PRV和PPV都是阳性，有27份PPV和PCV-2都为阳性，有12份PRV和PCV-2都为阳性，有8份为PRV、PPV和PCV-2全部阳性，这说明伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型混合感染现象非常普遍，多重荧光PCR可以检测到原来靠单一荧光PCR没有进行筛查的非目标病原，检出了混合感染，避免了漏检。
表8 临床样品的检测结果
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测试剂盒
及引物和探针
<130>
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 1
cggtgcctgc tgtactacg 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 2
ggcgaggtga agctgca 17
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<400> 3
cgagccctgc atctaccacc 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 4
agcgagccaa caacacca 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 5
caccaaagca ggctcttatg tc 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<400> 6
accaacctgc acttaactcc aaca 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 7
acggatattg taktcctggt cgt 23
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 8
cttccaaccm aayaacaaaa graatca 27
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 9
acttccaacc aaataacaaa agaaatcag 29
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 10
ccaaccaaac aacaaaagaa acca 24
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<400> 11
cagtgccgag gcctacgtg 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<400> 12
cagtgccgag gcctacrtg 19
<210> 13
<211> 399
<212> DNA
<213> PRV的gE基因序列
<400> 13
ggccacgccc aacgacacgg gcctctacac gctgcacgac gcctcggggc cgcgggccgt 60
gttctttgtg gcggtgggcg accggccgcc cgcgccggcg gacccggtgg gccccgcgcg 120
ccacgagccc cgcttccacg cgctcggctt ccactcgcag ctcttctcgc ccggggacac 180
gttcgacctg atgccgcgcg tggtctcgga catgggcgac tcgcgcgaga actttaccgc 240
cacgctggac tggtactacg cgcgcgcgcc cccgcggtgc ctgctgtact acgtgtacga 300
gccctgcatc taccacccgc gcgcgcccga gtgcctgcgc ccggtggacc cggcgtgcag 360
cttcacctcg ccggcgcgcg cgcggctggt ggcgcgccg 399
<210> 14
<211> 500
<212> DNA
<213> PPV的NS1基因序列
<400> 14
aaagaccaga acatacacaa ccaataagag acagaatgtt aaacataaac ctaaccagaa 60
aactgccagg tgattttgga cttttagaag aaactgaatg gccactaata tgtgcttggt 120
tggtaaagaa aggttaccaa gcaacaatgg ctagctatat gcatcattgg ggaaatgtac 180
ctgattggtc agaaaaatgg gaggagccaa aaatgcaaac cccaataaat acaccaacag 240
actctcagat ttccacatca gtgaaaactt cgccagcgga caacaactac gcagcaactc 300
caatacagga ggacctggat ttagctttag ccttggagcc gtggagcgag ccaacaacac 360
caactttcac caacctgcac ttaactccaa caccgccaga ttcagcaata cggacaccaa 420
gtccaacttg gtcggaaata gaaaccgaca taagagcctg ctttggtgaa aactgtgcac 480
ccacaacaaa ccttgaataa 500
<210> 15
<211> 666
<212> DNA
<213> PCV-2的ORF2基因序列
<400> 15
tctgaattgt acatacatgg ttacacggat attgtattcc tggtcgtata tactgttttc 60
gaacgcagtg ccgaggccta cgtggtctac atttccagca gtttgtagtc tcagccacag 120
ctgatttctt ttgttgtttg gttggaagta atcaatagtg gaatctagga caggtttggg 180
ggtaaagtag cgggagtggt aggagaaggg ctgggttatg gtatggcggg aggagtagtt 240
tacatagggg tcataggtga gggctgtggc ctttgttaca aagttatcat ctagaataac 300
agcactggag cccactcccc tgtcaccctg ggtgatcggg gagcagggcc agaattcaac 360
cttaaccttt cttattctgt agtattcaaa gggcacagag cgggggtttg agccccctcc 420
tgggggaaga aagtcattaa tattgaatct catcatgtcc accgcccagg agggcgtttt 480
gactgtggtt cgcttgatag tatatccgaa ggtgcgggag aggcgggtgt tgaagatgcc 540
atttttcctt ctccagcggt aacggtggcg ggggtggacg agccaggggc ggcggcggag 600
gatctggcca agatggctgc gggggcggtg tcttcttctc cggtaacgcc tccttggata 660
cgtcat 666

Claims (7)

1.一组用于同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的一步法多重荧光PCR检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针分别为：
用于检测伪狂犬病毒的1条正向引物，如序列表SEQ ID NO：1所示，1条反向引物，如序列表SEQ ID NO：2所示，和1条探针，如序列表SEQ ID NO：3所示；
用于检测猪细小病毒的1条正向引物，如序列表SEQ ID NO：4所示，1条反向引物，如序列表SEQ ID NO：5所示，和1条探针，如序列表SEQ ID NO：6所示；
用于检测猪圆环病毒2型的1条正向引物，如序列表SEQ ID NO：7所示，3条反向引物，如序列表SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：10所示，和2条探针，如序列表SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12所示。
2.根据权利要求1所述的一步法多重荧光PCR检测引物和探针，其特征在于，所述用于检测伪狂犬病毒的探针的5‘端标记Cy5，3‘端标记BHQ2；所述用于检测猪细小病毒的探针的5‘端标记HEX，3‘端标记BHQ1；所述用于检测猪圆环病毒2型的探针的5‘端标记FAM，3‘端标记BHQ1。
3.一种同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的一步法多重荧光PCR检测引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液、酶、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照分别为伪狂犬病毒(PRV)gE基因的体外DNA标准品；PPV阳性对照为猪细小病毒(PPV)NS1基因的体外DNA标准品；PCV-2阳性对照为猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因的体外DNA标准品。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，反应缓冲液为IQ Powermix PCR反应缓冲液。
7.一种同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测方法，其特征在于：该方法包括：
(1)提取病毒总核酸；
(2)配制PCR反应体系，其中，所述反应体系中包含权利要求1或2所述的多重荧光PCR检测引物和探针；
(3)进行一步法多重荧光PCR反应；
(4)结果判定。
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