CN105907894B - 一种检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其应用。所述试剂盒包括一对引物海外一条荧光探针，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的试剂盒能够特异性的检测仔猪脐带血中的圆环病毒Ⅱ型，并具有较高的灵敏度，重复性优，可以实现大通量样品的检测。同时本发明的试剂盒检测结果快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。

Description

一种检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR 试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其应用。
背景技术
脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，由两条动脉和一条静脉构成，是连接母体和子体的天然通道。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，在胎盘屏障的作用下大分子物质通常不能从母体进入脐带血中，因此健康仔猪脐带血中不含有任何抗体，但病毒、内毒素等小分子颗粒能够透过胎盘屏障进入脐带血中，从而垂直传播给仔猪。大量实验及临床样品结果证明，脐带血中可检测出猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)。
猪圆环病毒是圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一，含有一个1.76kb左右的单链环状DNA基因组。PCV具有圆环病毒Ⅰ型(PCV1)和圆环病毒Ⅱ型(PCV2)两种血清型。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒，易感然猪。可自感染猪鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪，可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PNDS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪繁殖系统障碍等疾病及初生仔猪先天性震颤等疾病。
近些年，PCV2对全球养猪业造成了严重的经济损失，引起养猪业认识的普遍关注。国内外学者建立了病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、间接免疫荧光(IFA)、免疫组化(IHA)、酶联免疫试验(ELISA)、原位杂交等多种方法用于PCV2的检测。目前应用最为广泛的检测方法为PCR检测方法。实时荧光PCR技术(real-time fluorescence quantitativePCR，QPCR)是在常规PCR技术的基础上发展起来的一种较新的核酸检测技术，具备灵敏度高、快速便捷、抗污染能力强、安全系数好等优点。2-3小时便能得出结果。
结合仔猪脐带血检测的优势，实时荧光PCR检测结果可同时反映母、仔猪PCV2带毒状况，有益于对群体PCV2感染和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。因此，研制一种检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR方法，以及基于此方法开发检测试剂盒显得很有必要，且应用前景广阔。
发明内容
本发明的目的在于提出一种检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪PCV2带毒状况，评估母猪圆环疫苗的免疫效果，有益于对群体PCV2感染和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。
基于上述目的，一种检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：
上游扩增引物：5’-GTTACCGGAGAAGAAGAC-3’，其为SEQ ID NO:1序列；
下游扩增引物：5’-GTGTTGAGGATGCCATTT-3’，其为SEQ ID NO:2序列；
特异性荧光探针：TAMARA-5’-TCCTTCTCCAGCGGTAACGG-3’-FAM，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。
在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为1:1:1。
在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为5～10μM。
在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×qPCRmix及说明书。
在本发明中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有圆环病毒Ⅱ型ORF2序列的克隆质粒T-PCV-121，克隆质粒T-PCV-12的终浓度为1.4×105copies/μl～1.4×107copies/μl。
在本发明中，优选的，所述圆环病毒Ⅱ型ORF2序列的核苷酸序列如下所示：
5’-GTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTAGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACAC-3’，其为SEQ ID NO:4所示。
在本发明中，优选的，所述克隆质粒T-PCV-121采用以下方法制备得到：利用SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增圆环病毒Ⅱ型ORF2序列，圆环病毒Ⅱ型ORF2序列酶切后与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为T-PCV-121。
克隆质粒T-PCV-121的构建步骤具体如下：
(1)按照柱式血液DNAout试剂盒操作说明书提取PCV2灭活疫苗基因组DNA；以SEQID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物扩增圆环病毒Ⅱ型ORF2序列，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸10min，4℃保温5min；PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；
(2)PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AxyPrep DNA GelExcractionKit胶回收试剂盒回收，然后酶切后与同样酶切的pEASY-T1克隆载体进行连接，连接后转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h；经蓝白斑筛选后，用Plasmid Mini Kit 1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名T-PCV-121。
在本发明中，优选的，所述试剂盒中各组分的配比为：
a.2×QPCR mix：25μL；
b.10μM的上游引物：0.5～1μL，10μM的下游引物：0.5～1μL，10μM的荧光探针：0.5μL～1μL；
c.阳性对照T-PCV-121克隆质粒：5～10μL；
d.阴性对照无DNA酶的ddH2O：5～10μL；
e.ddH2O：12.5μL。
在本发明中，优选的，用于检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型时，实时荧光PCR的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，共45个循环；25℃再延伸10s。
进一步的，本发明还提供了上述试剂盒在制备检测仔猪脐带血中圆环病 毒Ⅱ型试剂中的用途。
本发明还提供了一种脐带血的采集方法，具体步骤如下：
(1)取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；
(2)当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可；若母猪分娩出现木乃伊、死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；
(3)脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；
(4)将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。
本发明脐带血的采集方法克服现有常规采血技术的耗时长、采血困难、对猪只应激大等问题，能够快速、简便地进行脐带血的采集。
与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下有益效果：
(1)本发明的检测方法克服了常规检测技术耗时长、敏感度低、安全系数低、抗污染能力差和不能准确定量等问题，检测快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。
(2)本发明的检测方法准确度高，灵敏度高，特异性强，重复性优，可以实现大通量样品的检测。
(3)本发明的检测方法适用于待检猪的脾脏、淋巴结、血清及血浆等样品，同时还适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。
附图说明
图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度标准曲线；
图2为本发明临床样本检测结果图；
图3为本发明敏感性检测结果图；
图4为本发明特异性检测结果图；
图5为本发明重复性检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
1.脐带血的采集
a.取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；
b.当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可，将其“脐带血”挤到青霉素瓶，密封；
注意事项：①必须要采集同窝母猪产的所有的仔猪，避免同窝母猪所产仔猪的个体差异造成漏检；②可以双人操作，也可以单独操作，若仔猪脐带血不便挤出，可以将脐带剪成几段再操作即可；③若母猪分娩出现木乃伊，死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；④弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；
c.脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；
d.将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。
根据常规核酸提取的方式进行待检脐带血中DNA提取或者用实验室常用的试剂盒进行DNA提取，备用。
2.引物和荧光探针的设计和制备
在GenBank基因库中查找20株PCVⅡ型毒株的基因序列，经序列比对选取其读码框ORF2保守区域，并设计一对特异性扩增引物和一条特异性荧光探针，序列如下：
上游扩增引物：5’-GTTACCGGAGAAGAAGAC-3’(SEQ IDNO:1)；
下游扩增引物：5’-GTGTTGAGGATGCCATTT-3’(SEQ ID NO:2)；
特异性荧光探针：TAMARA-5’-TCCTTCTCCAGCGGTAACGG-3’-FAM，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因(SEQ IDNO:3)。
上述引物由华大基因合成并进行标记。
3.阳性对照质粒的构建与制备
(1)按照天恩泽柱式血液DNAout试剂盒操作说明书提取PCV2灭活疫苗基因组DNA；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物扩增圆环病毒Ⅱ型ORF2序列，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸10min，4℃保温5min。PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；
(2)PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA GelExcraction Kit胶回收试剂盒回收，然后酶切后与同样酶切的pEASY-T1克隆载体进行连接，连接后转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h。经蓝白斑筛选后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名T-PCV-121。
克隆质粒T-PCV-121用质粒小提试剂盒进行提纯，获得定量标准质粒。根据紫外分光光度计测定0D260和OD280值计算质粒浓度，并换算为质粒拷贝数，克隆质粒T-PCV-121终浓度为1.4×105copies/μl～1.4×107copies/μl。
4.标准曲线的制作
对T-PCV-121克隆质粒进行10倍梯度稀释，使其为：109-101copies/μl，每个梯度重复三次进行实时荧光定量PCR。根据扩增结果从中选取105、104、103、102copies/μl四个点制作标准曲线。图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度制作标准曲线图，其中该标准曲线的参数如下：斜率：-3.50367，截距：46.63667，相关系数：-0.99960，扩增效率：0.92937。制作标准曲线的相关系数R2大于0.98，斜率位于-3.3－-3.6之间，PCR扩增效率E位于0.9－1.1之间。
5.试剂盒中各组分的配比为：
a.2×QPCR mix：25μL；
b.10μM的上游引物：0.5～1μL，10μM的下游引物：0.5～1μL，10μM的荧光探针：0.5μL～1μL；
c.阳性对照T-PCV-121克隆质粒：5～10μL；
d.阴性对照无DNA酶的ddH2O：5～10μL；
e.ddH2O：12.5μL。
6.用上述试剂盒检测仔猪脐带血中的圆环病毒Ⅱ型
(1)荧光PCR反应体系的优化：为了得到扩增稳定可靠、重复性好的荧光PCR反应体系，对影响荧光PCR的4个因素(引物和探针)分别进行单因子多水平的优化试验。荧光PCR反应的主要因素水平见表1。
表1荧光PCR反应的因素与水平
Figure BDA0001040568020000071
根据扩增结果，确定荧光PCR单个反应体系(50μL)为：2×QPCR mix25μL；10μM的上游引物：1μL，10μM的下游引物：1μL，10μM的荧光探针：0.5μL；从待检脐带血中提取的DNA模板10μL；使用ddH2O补足至50μL。同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照T-PCV-121克隆质粒：10μL，其余组分相同；阴性对照无DNA酶的ddH2O：10μL，其余组分相同。
(2)荧光PCR反应步骤：按照上述配比将各组分加入到0.2ml荧光PCR扩增管中，瞬时离心(3000rpm)10秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：94℃预变性2min；94℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，共45个循环；25℃再延伸10s。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
7.结果分析
根据扩增结果判定：每次试验的过程都要加入阳性对照及阴性对照。在阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值<30时，则结果判定成立，即阳性结果出现典型的扩增曲线；并且制作的标准曲线如图1所示，相关系数R2大于0.98，斜率位于-3.3－-3.6之间，PCR扩增效率E位于0.9－1.1之间。
扩增曲线成明显S型，且Ct值≤35，则判断为阳性；扩增曲线成明显S型，且35<Ct值≤40，表明病毒载量低，并标注可疑，并进行重复检测，若重 复检测结果仍为35<Ct值≤40，则判断为阴性；Ct值≤35，则判断为阳性。本发明临床样本检测结果如图2所示。
实施例2灵敏度研究
以阳性对照T-PCV-121克隆质粒评价本发明的试剂盒的灵敏度，将T-PCV-121克隆质粒进行10倍梯度稀释，检测范围为109-101copies/μl。结果表明，该方法的检测范围为109-101copies/μl，在此范围的病毒含量可以得到可靠的结果，即该方法的灵敏度可以检测到10个拷贝的病毒含量的样品。检测结果见图3。
实施例3特异性研究
为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测猪细小病毒，猪伪狂犬病毒，猪瘟病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪流行性腹泻病毒，猪繁殖与呼吸综合征变异株和经典株，轮状病毒等8种病毒。
检测结果表明：本发明的试剂盒仅对仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性扩增圆环病毒Ⅱ型，而不与其它核酸发生交叉反应。检测结果见图4。
实施例4准确性研究
同时采用本发明的试剂盒以及普通PCR对36份仔猪脐带血样品进行检测以及5份健康的仔猪脐带血样品进行了检测，结果见表2。
表2采用本发明试剂盒以及普通PCR对临床样品进行检测结果的比较
Figure BDA0001040568020000081
从表2中可以看出：本发明实时荧光PCR检测阳性样品与普通PCR检测阳性样品的结果100％符合，但实时荧光PCR检测比普通PCR检测更敏感，且临床症状表现是一致的。
实施例5重复性研究
选用阳性对照T-PCV-121克隆质粒107、106、105个copies/μl,对每个浓度的样本做3个重复，结果不同核酸浓度的检测Ct值标准差≤0.04和≤0.21，变异系数≤10％，具有较好的重复性。检测结果见表3和图5。
表3荧光定量PCR检测圆环病毒的重复性试验
Figure BDA0001040568020000091
综上可见，本发明设计的一对特异性引物和一条荧光探针以及构成的试剂盒可以快速鉴定仔猪脐带血中的圆环病毒Ⅱ型，而且该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、重复性优，检测结果真实可靠。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure 1

Claims (6)

1.检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR试剂盒在制备检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型试剂中的用途，其特征在于，所述试剂盒包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：
上游扩增引物：5’-GTTACCGGAGAAGAAGAC-3’，其为SEQ ID NO:1序列；
下游扩增引物：5’-GTGTTGAGGATGCCATTT-3’，其为SEQ ID NO:2序列；
特异性荧光探针：TAMARA-5’-TCCTTCTCCAGCGGTAACGG-3’-FAM，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因；
所述扩增引物和特异性荧光探针用于扩增圆环病毒Ⅱ型ORF2序列；
所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×qPCR mix及说明书；
所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O，所述阳性对照为含有圆环病毒Ⅱ型ORF2序列的克隆质粒T-PCV-121，克隆质粒T-PCV-121的终浓度为1.4×105copies/μl～1.4×107copies/μl；
所述圆环病毒Ⅱ型ORF2序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为1:1:1。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为5～10μM。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述克隆质粒T-PCV-121采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增圆环病毒Ⅱ型ORF2序列，圆环病毒Ⅱ型ORF2序列酶切后与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为T-PCV-121。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒中各组分的配比为：
a.2×QPCR mix：25μL；
b.10μM的上游引物：0.5～1μL，10μM的下游引物：0.5～1μL，10μM的荧光探针：0.5μL～1μL；
c.阳性对照T-PCV-121克隆质粒：5～10μL；
d.阴性对照无DNA酶的ddH2O：5～10μL；
e.ddH2O：12.5μL。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，用于检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型时，实时荧光PCR的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，共45个循环；25℃再延伸10s。
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脐带血检测技术在产房仔猪腹泻疾病预警及其临床应用;喻正军等;《猪业科学》;20160228;第33卷(第2期);表1 *

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