CN110938712A - 基于实时荧光定量pcr技术检测人乳头瘤病毒的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明基于实时荧光PCR技术提供一种检测人乳头瘤病毒的引物、探针、试剂盒及方法。其中，引物包括正向引物和逆向引物，如SEQ ID NO:1～28所示；探针：SEQ ID NO:29～42所示；QPCR模板如SEQ ID NO:43～56所示。本发明通过对NCBI数据库中14种高风险亚型HPV所有分离株的基因组DNA做同源性比对，选择出每种亚型高度保守的序列设计出正逆向引物以及探针，能够敏感、准确地检测出高风险型HPV每个亚型所有分离株的基因组DNA，且能进行准确分型，特别适用于生物制品，尤其是细胞中HPV污染的分型检测。
Description
技术领域
本发明所属生物检测领域，特别是涉及一种利用实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种无包膜包裹的双链闭环小DNA病毒，属于多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，具有普遍传染性，易引发妇女宫颈癌。目前，每年约有20万妇女死于该种疾病，且年轻化趋势越发明显，从而引发社会各界普遍关注。依据WHO国际癌症研究机构以及其他研究机构研究成果，将与宫颈癌发生有关的HPV亚型分为三种类型，分别为高风险型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82)、假定的高风险型(HPV26、53、66)以及低风险型(HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81)。持续感染高风险型HPV被视为引发宫颈癌的必要原因，因此生物制品中高风险型HPV的污染会给患者带来严重的健康风险。为减少HPV污染，各国药品管理法规都要求人源细胞用于生物制品的生产时必须进行HPV病毒的检测。生物制药公司非常需要一种具有良好专一性、灵敏性并能涵盖14种高风险型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的检测方法。
目前HPV的检测方法主要包括HPV细胞学检测、HPV蛋白检测、HPV DNA检测以及HPV感染的血清学检测。其中用PCR检测HPV DNA的方法因其灵敏准确，是理想的检测生物制品污染的方法。目前商业化的HPV PCR检测试剂/试剂盒主要用于临床检测，检材为微量人体宫颈组织，主要用于宫颈癌筛查。为了减少宫颈癌筛查的假阳性，这些检测方法的灵敏度都不高，大约在1000个HPV基因组DNA拷贝的水平，且基本没有验证过大量细胞DNA是否会干扰检测。
不仅如此，目前文献报道的HPV病毒检测方法大多不能完全涵盖14种高危亚型，或能涵盖但不能完全区分这些亚型，且没有任何一个方法能够保证检测到这些亚型中的每一个分离株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种能涵盖且能完全区分14种高危亚型的检测HPV的qPCR检测方法，其能够区分14种高风险型HPV，具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点。
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的引物组合，包括：
HPV 16正向引物：TGACACAGAAAATGCTAGTGCT(如SEQ ID NO:1所示)，
HPV 16逆向引物：TCACCTGGATTTACTGCAACAT(如SEQ ID NO:2所示)；
HPV 18正向引物：AATGTCTGCAGATCCTTATGGG(如SEQ ID NO:3所示)，
HPV 18逆向引物：CTTGGAGAGGGAGAATACACAC(如SEQ ID NO:4所示)；
HPV 31正向引物：GACCGTTGTGTCCAGAAGAA(如SEQ ID NO:5所示)，
HPV 31逆向引物：ACGCATGTTTACACTTGGGT(如SEQ ID NO:6所示)；
HPV 33正向引物：GCTCAGATGAGGATGAAGGC(如SEQ ID NO:7所示)，
HPV 33逆向引物：ATGGTTCGTAGGTCACTTGC(如SEQ ID NO:8所示)；
HPV 35正向引物：ACCCGTCCATTTTAGAGGATTG(如SEQ ID NO:9所示)，
HPV 35逆向引物：TTGACAAGTTACAGCCTGTGAT(如SEQ ID NO:10所示)；
HPV 39正向引物：TGTTACACGCACAGGCATATAT(如SEQ ID NO:11所示)，
HPV 39逆向引物：TATTAGGATCGGGCAATGTCAC(如SEQ ID NO:12所示)；
HPV 45正向引物：CGAGTCAGAGGAGGAAAACG(如SEQ ID NO:13所示)，
HPV 45逆向引物：TGCCGAGCTCTCTACTGTAA(如SEQ ID NO:14所示)；
HPV 51正向引物：GGACTCCCGGATCCAAATTTAT(如SEQ ID NO:15所示)，
HPV 51逆向引物：ATCTTGTTGTGCATTGCCATTT(如SEQ ID NO:16所示)；
HPV 52正向引物：CAATACTGCCACTGTACAAAGC(如SEQ ID NO:17所示)，
HPV 52逆向引物：ACTGTGACAAACAACTGATTGC(如SEQ ID NO:18所示)；
HPV 56正向引物：ACGGATTCCTATGTAAAACGCA(如SEQ ID NO:19所示)，
HPV 56逆向引物：GGAAGCCCAAACTTATTAGGGT(如SEQ ID NO:20所示)；
HPV 58正向引物：GGATGGTGCTGATTTTATGTTGC(如SEQ ID NO:21所示)，
HPV 58逆向引物：CAGTGCTTACAACCTTAGACAC(如SEQ ID NO:22所示)；
HPV 59正向引物：AGCTGTGTATTATTGGCTGTGT(如SEQ ID NO:23所示)，
HPV 59逆向引物：TCCTGTGTCTACCATATCACCA(如SEQ ID NO:24所示)；
HPV 66正向引物：GTTTGGTGCAATGGACTTTAAG(如SEQ ID NO:25所示)，
HPV 66逆向引物：ATGTCTGGCAAACAATTGTTCC(如SEQ ID NO:26所示)；
HPV 68正向引物：GTAGTTATGTGTATGCCCCCTC(如SEQ ID NO:27所示)，
HPV 68逆向引物：AATACCATTGTTGTGTCCCTGT(如SEQ ID NO:28所示)。
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的探针组合，包括：
HPV 16探针：AGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCC(如SEQ ID NO:29所示)；
HPV 18探针：CAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCA(如SEQ ID NO:30所示)；
HPV 31探针：AGGAGGAAGGTGGACAGGACGTTGCA(如SEQ ID NO:31所示)；
HPV 33探针：TGGACCGGCCAGATGGACAAGCACA(如SEQ ID NO:32所示)；
HPV35探针：TGGCCTTACACCACCGCCTTCTGGT(如SEQ ID NO:33所示)；
HPV 39探针：TGGTGGTCGCAAGCAGGACATTCCAAAGG(如SEQ ID NO:34所示)；
HPV 45探针：CTACCAGCCCGACGAGCCGAACCAC(如SEQ ID NO:35所示)；
HPV 51探针：TGGGCGTTGAGGTGGGCAGAGGAC(如SEQ ID NO:36所示)；
HPV 52探针：ACTGGTTACAACGTGCGCAGGGCCA(如SEQ ID NO:37所示)；
HPV 56探针：AGGCAGTTCACGATTGCTTGCCGTAGG(如SEQ ID NO:38所示)；
HPV 58探针：CCACTGTGTACCTGCCTCCTGTGCC(如SEQ ID NO:39所示)；
HPV 59探针：TGTGGTTCAGGGCGATTGTCCTCCACT(如SEQ ID NO:40所示)；
HPV 66探针：AATCAAAGGCTGAGGTGCCATTGGACA(如SEQ ID NO:41所示)；
HPV 68探针：TCTATGGTGTCCTCTGACTCCCAGTTATT(如SEQ ID NO:42所示)。
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的QPCR模板，包括：
HPV 16基因组DNA模板：
5’-TTGGATGACACAGAAAATGCTAGTGTTTATGCAGCAAATGCAGGTGTGGATAATAGAGAATGTATATCTATGGATTACAAACAAACACAATTGTGTTTAATTGGTTGCAAACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCCCATGTACCAATGGTGCAGTAAATCCAGGTGATTGTC-3’(如SEQ ID NO:43所示)；
HPV 18基因组DNA模板：
5’-TTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCCTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCT-3’(如SEQ ID NO:44所示)；
HPV 31基因组DNA模板：
5’-TCAAAGACCGTTGTGTCCAGAAGAAAAACAAAGACATTTGGATAAAAAGAAACGATTCCACAACATAGGAGGAAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCATGTTGGAGAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTAAACATGCGTGGAGA-3’(如SEQ ID NO:45所示)；
HPV 33基因组DNA模板：
5’-TGACAGCTCAGATGAGGATGAAGGCTTGGACCGGCCAGATGGACAAGCACAACCAGCCACAGCTGATTACTACATTGTAACCTGTTGTCACACTTGTAACACCACAGTTCGTTTATGTGTCAACAGTACAGCAAGTGACCTACGAACCATACAGC-3’(如SEQ ID NO:46所示)；
HPV 35基因组DNA模板：
5’-TATGAACCCGTCCATTTTAGAGGATTGGAATTTTGGCCTTACACCACCGCCTTCTGGTACCTTAGAGGACACATATCGCTATGTAACATCACAGGCTGTAACTTGTCAAAAACC-3’(如SEQ ID NO:47所示)；
HPV 39基因组DNA模板：
5’-GATTATGTTACACGCACAGGCATATATTATTATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACAGTAGGACATCCATATTTTAAAGTGGGTATGAATGGTGGTCGCAAGCAGGACATTCCAAAGGTGTCTGCATATCAATATAGGGTATTTCGCGTGACATTGCCCGATCCTAATAAATTC-3’(如SEQ ID NO:48所示)；
HPV 45基因组DNA模板：
5’-TTAAGCGAGTCAGAGGAGGAAAACGATGAAGCAGATGGCGTTAGTCATGCACAACTACCAGCCCGACGAGCCGAACCACAGCGTCACAAAATTTTGTGTGTATGTTGTAAGTGTGACGGCAGAATTGAGCTTACAGTAGAGAGCTCGGCAGATGA-3’(如SEQ ID NO:49所示)；
HPV 51基因组DNA模板：
5’-AGTTTGGACTCCCGGATCCAAATTTATATAATCCAGACACAGATAGGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGGCGTTGAGGTGGGCAGAGGACAGCCCCTTGGTGTTGGCCTTAGTGGTCATCCCTTATTTAATAAATATGATGACACAGAAAATTCACGCATAGCAAATGGCAATGCACAACAAGATGTTAG-3’(如SEQ ID NO:50所示)；
HPV 52基因组DNA模板：
5’-TCTGGCAATACTGCCACTGTACAAAGCAGTGCTTTTTTTCCTACTCCTAGTGGTTCTATGGTAACCTCAGAATCCCAATTATTTAATAAACCGTACTGGTTACAACGTGCGCAGGGCCACAATAATGGCATATGTTGGGGCAATCAGTTGTTTGTCACAGTTGTGG-3’(如SEQ ID NO:51所示)；
HPV 56基因组DNA模板：
5’-TGGCAACGGATTCCTATGTAAAACGCACTAGTATATTTTATCATGCAGGCAGTTCACGATTGCTTGCCGTAGGACATCCCTATTACTCTGTAACTAAGGACAATACCAAAACAAACATTCCCAAAGTTAGTGCATATCAATATAGGGTATTTAGGGTACGGTTGCCCGACCCTAATAAGTTTGGGCTTCCAGATA-3’(如SEQ ID NO:52所示)；
HPV 58基因组DNA模板：
5’-ATCCTGGATGGTGCTGATTTTATGTTGCACCCTAGCTATTTTATTTTGCGTCGCAGACGTAAACGTTTTCCATATTTTTTTGCAGATGTCCGTGTGGCGGCCTAGTGAGGCCACTGTGTACCTGCCTCCTGTGCCTGTGTCTAAGGTTGTAAGCACTGATGAA-3’(如SEQ ID NO:53所示)；
HPV 59基因组DNA模板：
5’-AACTCAGCTGTGTATTATTGGCTGTGTACCTGCCATTGGAGAACACTGGACAAAGGGCACTGCTTGTAAGCCTACTACTGTGGTTCAGGGCGATTGTCCTCCACTAGAATTAATAAATACACCAATTGAAGATGGTGATATGGTAGACACAGGATATGG-3’(如SEQ ID NO:54所示)；
HPV 66基因组DNA模板：
5’-ACCGGGTTTGGTGCAATGGACTTTAAGCTATTACAGGAATCAAAGGCTGAGGTGCCATTGGACATTGTACAATCTACATGTAAATATCCTGATTATTTAAAAATGTCTGCAGATGCCTATGGGGATTCTATGTGGTTTTACTTACGCAGGGAACAATTGTTTGCCAGACATTACTT-3’(如SEQ ID NO:55所示)；
HPV 68基因组DNA模板：
5’-TCCTAGTAGTTATGTGTATGCCCCCTCGCCTAGCGGGTCTATGGTGTCCTCTGACTCCCAGTTATTTAACAAGCCCTATTGGCTGCACAAGGCACAGGGACACAACAATGGTATTTGTTG-3’(如SEQ ID NO:56所示)；
本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的探针及引物的组合，包括：
HPV 16正向引物：TGACACAGAAAATGCTAGTGCT(如SEQ ID NO:1所示)，
HPV 16逆向引物：TCACCTGGATTTACTGCAACAT(如SEQ ID NO:2所示)；
HPV 18正向引物：AATGTCTGCAGATCCTTATGGG(如SEQ ID NO:3所示)，
HPV 18逆向引物：CTTGGAGAGGGAGAATACACAC(如SEQ ID NO:4所示)；
HPV 31正向引物：GACCGTTGTGTCCAGAAGAA(如SEQ ID NO:5所示)，
HPV 31逆向引物：ACGCATGTTTACACTTGGGT(如SEQ ID NO:6所示)；
HPV 33正向引物：GCTCAGATGAGGATGAAGGC(如SEQ ID NO:7所示)，
HPV 33逆向引物：ATGGTTCGTAGGTCACTTGC(如SEQ ID NO:8所示)；
HPV 35正向引物：ACCCGTCCATTTTAGAGGATTG(如SEQ ID NO:9所示)，
HPV 35逆向引物：TTGACAAGTTACAGCCTGTGAT(如SEQ ID NO:10所示)；
HPV 39正向引物：TGTTACACGCACAGGCATATAT(如SEQ ID NO:11所示)，
HPV 39逆向引物：TATTAGGATCGGGCAATGTCAC(如SEQ ID NO:12所示)；
HPV 45正向引物：CGAGTCAGAGGAGGAAAACG(如SEQ ID NO:13所示)，
HPV 45逆向引物：TGCCGAGCTCTCTACTGTAA(如SEQ ID NO:14所示)；
HPV 51正向引物：GGACTCCCGGATCCAAATTTAT(如SEQ ID NO:15所示)，
HPV 51逆向引物：ATCTTGTTGTGCATTGCCATTT(如SEQ ID NO:16所示)；
HPV 52正向引物：CAATACTGCCACTGTACAAAGC(如SEQ ID NO:17所示)，
HPV 52逆向引物：ACTGTGACAAACAACTGATTGC(如SEQ ID NO:18所示)；
HPV 56正向引物：ACGGATTCCTATGTAAAACGCA(如SEQ ID NO:19所示)，
HPV 56逆向引物：GGAAGCCCAAACTTATTAGGGT(如SEQ ID NO:20所示)；
HPV 58正向引物：GGATGGTGCTGATTTTATGTTGC(如SEQ ID NO:21所示)，
HPV 58逆向引物：CAGTGCTTACAACCTTAGACAC(如SEQ ID NO:22所示)；
HPV 59正向引物：AGCTGTGTATTATTGGCTGTGT(如SEQ ID NO:23所示)，
HPV 59逆向引物：TCCTGTGTCTACCATATCACCA(如SEQ ID NO:24所示)；
HPV 66正向引物：GTTTGGTGCAATGGACTTTAAG(如SEQ ID NO:25所示)，
HPV 66逆向引物：ATGTCTGGCAAACAATTGTTCC(如SEQ ID NO:26所示)；
HPV 68正向引物：GTAGTTATGTGTATGCCCCCTC(如SEQ ID NO:27所示)，
HPV 68逆向引物：AATACCATTGTTGTGTCCCTGT(如SEQ ID NO:28所示)；
HPV 16探针：AGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCC(如SEQ ID NO:29所示)；
HPV 18探针：CAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCA(如SEQ ID NO:30所示)；
HPV 31探针：AGGAGGAAGGTGGACAGGACGTTGCA(如SEQ ID NO:31所示)；
HPV 33探针：TGGACCGGCCAGATGGACAAGCACA(如SEQ ID NO:32所示)；
HPV35探针：TGGCCTTACACCACCGCCTTCTGGT(如SEQ ID NO:33所示)；
HPV 39探针：TGGTGGTCGCAAGCAGGACATTCCAAAGG(如SEQ ID NO:34所示)；
HPV 45探针：CTACCAGCCCGACGAGCCGAACCAC(如SEQ ID NO:35所示)；
HPV 51探针：TGGGCGTTGAGGTGGGCAGAGGAC(如SEQ ID NO:36所示)；
HPV 52探针：ACTGGTTACAACGTGCGCAGGGCCA(如SEQ ID NO:37所示)；
HPV 56探针：AGGCAGTTCACGATTGCTTGCCGTAGG(如SEQ ID NO:38所示)；
HPV 58探针：CCACTGTGTACCTGCCTCCTGTGCC(如SEQ ID NO:39所示)；
HPV 59探针：TGTGGTTCAGGGCGATTGTCCTCCACT(如SEQ ID NO:40所示)；
HPV 66探针：AATCAAAGGCTGAGGTGCCATTGGACA(如SEQ ID NO:41所示)；
HPV 68探针：TCTATGGTGTCCTCTGACTCCCAGTTATT(如SEQ ID NO:42所示)。
本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物为：
HPV 16正向引物：TGACACAGAAAATGCTAGTGCT(如SEQ ID NO:1所示)，
HPV 16逆向引物：TCACCTGGATTTACTGCAACAT(如SEQ ID NO:2所示)；
HPV 18正向引物：AATGTCTGCAGATCCTTATGGG(如SEQ ID NO:3所示)，
HPV 18逆向引物：CTTGGAGAGGGAGAATACACAC(如SEQ ID NO:4所示)；
HPV 31正向引物：GACCGTTGTGTCCAGAAGAA(如SEQ ID NO:5所示)，
HPV 31逆向引物：ACGCATGTTTACACTTGGGT(如SEQ ID NO:6所示)；
HPV 33正向引物：GCTCAGATGAGGATGAAGGC(如SEQ ID NO:7所示)，
HPV 33逆向引物：ATGGTTCGTAGGTCACTTGC(如SEQ ID NO:8所示)；
HPV 35正向引物：ACCCGTCCATTTTAGAGGATTG(如SEQ ID NO:9所示)，
HPV 35逆向引物：TTGACAAGTTACAGCCTGTGAT(如SEQ ID NO:10所示)；
HPV 39正向引物：TGTTACACGCACAGGCATATAT(如SEQ ID NO:11所示)，
HPV 39逆向引物：TATTAGGATCGGGCAATGTCAC(如SEQ ID NO:12所示)；
HPV 45正向引物：CGAGTCAGAGGAGGAAAACG(如SEQ ID NO:13所示)，
HPV 45逆向引物：TGCCGAGCTCTCTACTGTAA(如SEQ ID NO:14所示)；
HPV 51正向引物：GGACTCCCGGATCCAAATTTAT(如SEQ ID NO:15所示)，
HPV 51逆向引物：ATCTTGTTGTGCATTGCCATTT(如SEQ ID NO:16所示)；
HPV 52正向引物：CAATACTGCCACTGTACAAAGC(如SEQ ID NO:17所示)，
HPV 52逆向引物：ACTGTGACAAACAACTGATTGC(如SEQ ID NO:18所示)；
HPV 56正向引物：ACGGATTCCTATGTAAAACGCA(如SEQ ID NO:19所示)，
HPV 56逆向引物：GGAAGCCCAAACTTATTAGGGT(如SEQ ID NO:20所示)；
HPV 58正向引物：GGATGGTGCTGATTTTATGTTGC(如SEQ ID NO:21所示)，
HPV 58逆向引物：CAGTGCTTACAACCTTAGACAC(如SEQ ID NO:22所示)；
HPV 59正向引物：AGCTGTGTATTATTGGCTGTGT(如SEQ ID NO:23所示)，
HPV 59逆向引物：TCCTGTGTCTACCATATCACCA(如SEQ ID NO:24所示)；
HPV 66正向引物：GTTTGGTGCAATGGACTTTAAG(如SEQ ID NO:25所示)，
HPV 66逆向引物：ATGTCTGGCAAACAATTGTTCC(如SEQ ID NO:26所示)；
HPV 68正向引物：GTAGTTATGTGTATGCCCCCTC(如SEQ ID NO:27所示)，
HPV 68逆向引物：AATACCATTGTTGTGTCCCTGT(如SEQ ID NO:28所示)；
所述探针为：
HPV 16探针：AGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCC(如SEQ ID NO:29所示)；
HPV 18探针：CAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCA(如SEQ ID NO:30所示)；
HPV 31探针：AGGAGGAAGGTGGACAGGACGTTGCA(如SEQ ID NO:31所示)；
HPV 33探针：TGGACCGGCCAGATGGACAAGCACA(如SEQ ID NO:32所示)；
HPV35探针：TGGCCTTACACCACCGCCTTCTGGT(如SEQ ID NO:33所示)；
HPV 39探针：TGGTGGTCGCAAGCAGGACATTCCAAAGG(如SEQ ID NO:34所示)；
HPV 45探针：CTACCAGCCCGACGAGCCGAACCAC(如SEQ ID NO:35所示)；
HPV 51探针：TGGGCGTTGAGGTGGGCAGAGGAC(如SEQ ID NO:36所示)；
HPV 52探针：ACTGGTTACAACGTGCGCAGGGCCA(如SEQ ID NO:37所示)；
HPV 56探针：AGGCAGTTCACGATTGCTTGCCGTAGG(如SEQ ID NO:38所示)；
HPV 58探针：CCACTGTGTACCTGCCTCCTGTGCC(如SEQ ID NO:39所示)；
HPV 59探针：TGTGGTTCAGGGCGATTGTCCTCCACT(如SEQ ID NO:40所示)；
HPV 66探针：AATCAAAGGCTGAGGTGCCATTGGACA(如SEQ ID NO:41所示)；
HPV 68探针：TCTATGGTGTCCTCTGACTCCCAGTTATT(如SEQ ID NO:42所示)。
具体的，所述试剂盒还包括预混液。所述预混液优选为TaqMan Universal MasterMix。
具体的，所述试剂盒还包括14种QPCR模板。所述14种QPCR模板分别如SEQ ID NO:43～56所示。
具体的，所述试剂盒还包括HEK293细胞基因组DNA，可作为检测时的背景DNA使用。
本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的反应体系，所述反应体系包括以下成分：
预混液：TaqMan Universal Master Mix(2×)；以及
选自以下组合中任意一组的引物、探针及相应的模板：
如SEQ ID NO:1～2所示的引物，如SEQ ID NO:29所示的探针及如SEQ ID NO:43所示的模板；
SEQ ID NO:3～4所示的引物，如SEQ ID NO:30所示的探针及如SEQ ID NO:44所示的模板；
SEQ ID NO:5～6所示的引物，如SEQ ID NO:31所示的探针及如SEQ ID NO:45所示的模板；
SEQ ID NO:7～8所示的引物，如SEQ ID NO:32所示的探针及如SEQ ID NO:46所示的模板；
SEQ ID NO:9～10所示的引物对，如SEQ ID NO:33所示的探针及如SEQ ID NO:47所示的模板；
SEQ ID NO:11～12所示的引物，如SEQ ID NO:44所示的探针及如SEQ ID NO:48所示的模板；
SEQ ID NO:13～14所示的引物，如SEQ ID NO:35所示的探针及如SEQ ID NO:49所示的模板；
SEQ ID NO:15～16所示的引物，如SEQ ID NO:36所示的探针及如SEQ ID NO:50所示的模板；
SEQ ID NO:17～18所示的引物，如SEQ ID NO:37所示的探针及如SEQ ID NO:51所示的模板；
SEQ ID NO:19～20所示的引物，如SEQ ID NO:38所示的探针及如SEQ ID NO:52所示的模板；
SEQ ID NO:21～22所示的引物，如SEQ ID NO:39所示的探针及如SEQ ID NO:53所示的模板；
SEQ ID NO:23～24所示的引物，如SEQ ID NO:40所示的探针及如SEQ ID NO:54所示的模板；
SEQ ID NO:25～26所示的引物，如SEQ ID NO:41所示的探针及如SEQ ID NO:55所示的模板；
SEQ ID NO:27～28所示的引物，如SEQ ID NO:42所示的探针及如SEQ ID NO:56所示的模板。
具体的，所述模板是以质粒的形式存在。所述质粒使用时经梯度稀释后成为每5μl含有1x105,1x104,1x103,1x102及10个靶序列拷贝的标准样品。
具体的，在干扰实验中，0.5μg HEK293细胞基因组DNA作为背景DNA加入反应体系中。
本发明还提供基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的方法，包括步骤：
1)提取待测样品总DNA；可将总DNA的浓度调整为0.1μg/μL；
2)制备14份反应体系，每份反应体系包括预混液、一对引物及相应的探针；所述预混液为TaqMan Universal Master Mix；所述引物包括正向引物和逆向引物，所述正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27所示，与所述各正向引物相对应的逆向引物的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28所示；与所述各正向引物相对应的的探针的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:29～42所示；
3)将14种模板分别梯度稀释制成标准曲线样品；与所述各正向引物相对应的14种模板的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:43～56所示；
4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；
5)QPCR反应；
6)绘制标准曲线，分析待测样品的检测结果。
具体的，所述步骤3)中，标准样品的浓度梯度为每5μl含有1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝。
具体的，所述步骤5)中，采用ABI 7500实时PCR系统进行QPCR反应。
具体的，所述步骤5)中，QPCR反应程序为：
Step1：95℃，10min；
Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；
Step2执行40cycles。
具体的，所述方法用于细胞库中的人乳头瘤病毒污染检测。
本发明通过对NCBI数据库中14种高风险亚型HPV所有分离株的基因组DNA做同源性比对，选择出每种亚型高度保守的序列设计出正逆向引物以及探针，能够敏感、准确地检测出高风险型HPV每个亚型所有分离株的基因组DNA，且能进行准确分型，特别适用于生物制品，尤其是细胞中HPV污染的分型检测。
本发明提供的引物、探针、模板及试剂盒能够检测出NCBI数据库中HPV 14个高危亚型现有的所有病毒分离株的基因组DNA。这同时也说明我们选择的扩增检测区域是HPV各亚型基因组中非常保守的区域，将来新出现的变异株被该方法检测到的几率很高
本发明的引物、探针、模板、试剂盒及检测方法能够检测出低至10～100个病毒基因组拷贝(附图1，附表1)，且所有引物和探针用293DNA和试剂作对照时，均为阴性。该方法的高特异性和高灵敏度可确保14种高风险型HPV被准确检测，能够更好地保证生物制品的安全性。
细胞库的生物安全检测需要检测到大量细胞中的微量病毒污染。用PCR方法做检测时，检测样本DNA中也包含大量的细胞DNA与微量的病毒DNA(如果病毒污染存在)。大量的细胞DNA常常会抑制PCR反应。该检测不被细胞基因组DNA所干扰，特别适合于检测含细胞的样品中的病毒污染。
附图说明
图1为用HPV16引物探针扩增模板的扩增曲线图。图中数字(10-105)为模板拷贝数。结果表示检测体系可检测到10拷贝。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.取1x107 HEK293细胞，5000rpm离心5分钟收集细胞。
2.用0.5mL PBS重悬细胞。用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit提取细胞DNA。
3.用Nanodrop检测DNA OD260及OD280吸收值，计算细胞DNA浓度，并将浓度调整为0.1μg/μL
4.分别梯度稀释DNA模板至每5μl含有1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝
5.分别为每种HPV亚型制备反应体系，包括：
TaqMan Universal Master Mix预混液(终浓度1x)
正向引物(终浓度0.5μM)
反向引物(终浓度0.5μM)
探针(每种终浓度0.25μM)
6.在样品孔中分别加入：
水(试剂对照)
HEK293细胞DNA 0.5μg(阴性对照)
模板 1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝，
模板 1x103拷贝+HEK293细胞DNA 0.1μg
模板 1x102拷贝+HEK293细胞DNA 0.1μg
7.采用ABI 7500实时PCR系统进行QPCR反应
QPCR反应程序为：
Step1：95℃，10min；
Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；
Step2执行40cycles。
8.结果分析
结果表明，QPCR能够检测出低至10个拷贝的模板DNA(如附图1，HPV16梯度模板扩增曲线)。每个HPV亚型的检测灵敏度如附表1。细胞基因组DNA不产生任何阳性信号，且不影响目的DNA的检出。
附表1.HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的LOD如下。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 苏州药明检测检验有限责任公司
<120> 基于实时荧光定量PCR技术检测人乳头瘤病毒的引物、探针、试剂盒及方法
<130> CPC-NP-19-101755
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 16正向引物
<400> 1
tgacacagaa aatgctagtg ct 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 16逆向引物
<400> 2
tcacctggat ttactgcaac at 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 18正向引物
<400> 3
aatgtctgca gatccttatg gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 18逆向引物
<400> 4
cttggagagg gagaatacac ac 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV 31正向引物
<400> 5
gaccgttgtg tccagaagaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV 31逆向引物
<400> 6
acgcatgttt acacttgggt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV 33正向引物
<400> 7
gctcagatga ggatgaaggc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV 33逆向引物
<400> 8
atggttcgta ggtcacttgc 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 35正向引物
<400> 9
acccgtccat tttagaggat tg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 35逆向引物
<400> 10
ttgacaagtt acagcctgtg at 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 39正向引物
<400> 11
tgttacacgc acaggcatat at 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 39逆向引物
<400> 12
tattaggatc gggcaatgtc ac 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV 45正向引物
<400> 13
cgagtcagag gaggaaaacg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> HPV 45逆向引物
<400> 14
tgccgagctc tctactgtaa 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 51正向引物
<400> 15
ggactcccgg atccaaattt at 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 51逆向引物
<400> 16
atcttgttgt gcattgccat tt 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 52正向引物
<400> 17
caatactgcc actgtacaaa gc 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 52逆向引物
<400> 18
actgtgacaa acaactgatt gc 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 56正向引物
<400> 19
acggattcct atgtaaaacg ca 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 56逆向引物
<400> 20
ggaagcccaa acttattagg gt 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> HPV 58正向引物
<400> 21
ggatggtgct gattttatgt tgc 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 58逆向引物
<400> 22
cagtgcttac aaccttagac ac 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 59正向引物
<400> 23
agctgtgtat tattggctgt gt 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 59逆向引物
<400> 24
tcctgtgtct accatatcac ca 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 66正向引物
<400> 25
gtttggtgca atggacttta ag 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 66逆向引物
<400> 26
atgtctggca aacaattgtt cc 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 68正向引物
<400> 27
gtagttatgt gtatgccccc tc 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> HPV 68逆向引物
<400> 28
aataccattg ttgtgtccct gt 22
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> HPV 16探针
<400> 29
aggggaacac tggggcaaag gatccc 26
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> HPV 18探针
<400> 30
caggtactat gggtgacact gtgcctca 28
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> HPV 31探针
<400> 31
aggaggaagg tggacaggac gttgca 26
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> HPV 33探针
<400> 32
tggaccggcc agatggacaa gcaca 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> HPV 35探针
<400> 33
tggccttaca ccaccgcctt ctggt 25
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> HPV 39探针
<400> 34
tggtggtcgc aagcaggaca ttccaaagg 29
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> HPV 45探针
<400> 35
ctaccagccc gacgagccga accac 25
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> HPV 51探针
<400> 36
tgggcgttga ggtgggcaga ggac 24
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> HPV 52探针
<400> 37
actggttaca acgtgcgcag ggcca 25
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> HPV 56探针
<400> 38
aggcagttca cgattgcttg ccgtagg 27
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> HPV 58探针
<400> 39
ccactgtgta cctgcctcct gtgcc 25
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> HPV 59探针
<400> 40
tgtggttcag ggcgattgtc ctccact 27
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> HPV 66探针
<400> 41
aatcaaaggc tgaggtgcca ttggaca 27
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> HPV 68探针
<400> 42
tctatggtgt cctctgactc ccagttatt 29
<210> 43
<211> 181
<212> DNA
<213> HPV 16基因组DNA模板
<400> 43
ttggatgaca cagaaaatgc tagtgtttat gcagcaaatg caggtgtgga taatagagaa 60
tgtatatcta tggattacaa acaaacacaa ttgtgtttaa ttggttgcaa accacctata 120
ggggaacact ggggcaaagg atccccatgt accaatggtg cagtaaatcc aggtgattgt 180
c 181
<210> 44
<211> 190
<212> DNA
<213> HPV 18基因组DNA模板
<400> 44
ttacaaatgt ctgcagatcc ttatggggat tccatgtttt tttgcttacg gcgtgagcag 60
ctttttgcta ggcatttttg gaatagagca ggtactatgg gtgacactgt gcctcaatcc 120
ttatatatta aaggcacagg tatgcctgct tcacctggca gctgtgtgta ttctccctct 180
ccaagtggct 190
<210> 45
<211> 146
<212> DNA
<213> HPV 31基因组DNA模板
<400> 45
tcaaagaccg ttgtgtccag aagaaaaaca aagacatttg gataaaaaga aacgattcca 60
caacatagga ggaaggtgga caggacgttg catagcatgt tggagaagac ctcgtactga 120
aacccaagtg taaacatgcg tggaga 146
<210> 46
<211> 155
<212> DNA
<213> HPV 33基因组DNA模板
<400> 46
tgacagctca gatgaggatg aaggcttgga ccggccagat ggacaagcac aaccagccac 60
agctgattac tacattgtaa cctgttgtca cacttgtaac accacagttc gtttatgtgt 120
caacagtaca gcaagtgacc tacgaaccat acagc 155
<210> 47
<211> 114
<212> DNA
<213> HPV 35基因组DNA模板
<400> 47
tatgaacccg tccattttag aggattggaa ttttggcctt acaccaccgc cttctggtac 60
cttagaggac acatatcgct atgtaacatc acaggctgta acttgtcaaa aacc 114
<210> 48
<211> 174
<212> DNA
<213> HPV 39基因组DNA模板
<400> 48
gattatgtta cacgcacagg catatattat tatgctggca gctctagatt attaacagta 60
ggacatccat attttaaagt gggtatgaat ggtggtcgca agcaggacat tccaaaggtg 120
tctgcatatc aatatagggt atttcgcgtg acattgcccg atcctaataa attc 174
<210> 49
<211> 155
<212> DNA
<213> HPV 45基因组DNA模板
<400> 49
ttaagcgagt cagaggagga aaacgatgaa gcagatggcg ttagtcatgc acaactacca 60
gcccgacgag ccgaaccaca gcgtcacaaa attttgtgtg tatgttgtaa gtgtgacggc 120
agaattgagc ttacagtaga gagctcggca gatga 155
<210> 50
<211> 187
<212> DNA
<213> HPV 51基因组DNA模板
<400> 50
agtttggact cccggatcca aatttatata atccagacac agataggttg gtgtggggtt 60
gtgtgggcgt tgaggtgggc agaggacagc cccttggtgt tggccttagt ggtcatccct 120
tatttaataa atatgatgac acagaaaatt cacgcatagc aaatggcaat gcacaacaag 180
atgttag 187
<210> 51
<211> 166
<212> DNA
<213> HPV 52基因组DNA模板
<400> 51
tctggcaata ctgccactgt acaaagcagt gctttttttc ctactcctag tggttctatg 60
gtaacctcag aatcccaatt atttaataaa ccgtactggt tacaacgtgc gcagggccac 120
aataatggca tatgttgggg caatcagttg tttgtcacag ttgtgg 166
<210> 52
<211> 195
<212> DNA
<213> HPV 56基因组DNA模板
<400> 52
tggcaacgga ttcctatgta aaacgcacta gtatatttta tcatgcaggc agttcacgat 60
tgcttgccgt aggacatccc tattactctg taactaagga caataccaaa acaaacattc 120
ccaaagttag tgcatatcaa tatagggtat ttagggtacg gttgcccgac cctaataagt 180
ttgggcttcc agata 195
<210> 53
<211> 163
<212> DNA
<213> HPV 58基因组DNA模板
<400> 53
atcctggatg gtgctgattt tatgttgcac cctagctatt ttattttgcg tcgcagacgt 60
aaacgttttc catatttttt tgcagatgtc cgtgtggcgg cctagtgagg ccactgtgta 120
cctgcctcct gtgcctgtgt ctaaggttgt aagcactgat gaa 163
<210> 54
<211> 159
<212> DNA
<213> HPV 59基因组DNA模板
<400> 54
aactcagctg tgtattattg gctgtgtacc tgccattgga gaacactgga caaagggcac 60
tgcttgtaag cctactactg tggttcaggg cgattgtcct ccactagaat taataaatac 120
accaattgaa gatggtgata tggtagacac aggatatgg 159
<210> 55
<211> 176
<212> DNA
<213> HPV 66基因组DNA模板
<400> 55
accgggtttg gtgcaatgga ctttaagcta ttacaggaat caaaggctga ggtgccattg 60
gacattgtac aatctacatg taaatatcct gattatttaa aaatgtctgc agatgcctat 120
ggggattcta tgtggtttta cttacgcagg gaacaattgt ttgccagaca ttactt 176
<210> 56
<211> 120
<212> DNA
<213> HPV 68基因组DNA模板
<400> 56
tcctagtagt tatgtgtatg ccccctcgcc tagcgggtct atggtgtcct ctgactccca 60
gttatttaac aagccctatt ggctgcacaa ggcacaggga cacaacaatg gtatttgttg 120
Claims (15)
1.一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的引物组合，其特征在于，包括：
HPV 16正向引物：如SEQ ID NO:1所示，HPV 16逆向引物：如SEQ ID NO:2所示；
HPV 18正向引物：如SEQ ID NO:3所示，HPV 18逆向引物：如SEQ ID NO:4所示；
HPV 31正向引物：如SEQ ID NO:5所示，HPV 31逆向引物：如SEQ ID NO:6所示；
HPV 33正向引物：如SEQ ID NO:7所示，HPV 33逆向引物：如SEQ ID NO:8所示；
HPV 35正向引物：如SEQ ID NO:9所示，HPV 35逆向引物：如SEQ ID NO:10所示；
HPV 39正向引物：如SEQ ID NO:11所示，HPV 39逆向引物：如SEQ ID NO:12所示；
HPV 45正向引物：如SEQ ID NO:13所示，HPV 45逆向引物：如SEQ ID NO:14所示；
HPV 51正向引物：如SEQ ID NO:15所示，HPV 51逆向引物：如SEQ ID NO:16所示；
HPV 52正向引物：如SEQ ID NO:17所示，HPV 52逆向引物：如SEQ ID NO:18所示；
HPV 56正向引物：如SEQ ID NO:19所示，HPV 56逆向引物：如SEQ ID NO:20所示；
HPV 58正向引物：如SEQ ID NO:21所示，HPV 58逆向引物：如SEQ ID NO:22所示；
HPV 59正向引物：如SEQ ID NO:23所示，HPV 59逆向引物：如SEQ ID NO:24所示；
HPV 66正向引物：如SEQ ID NO:25所示，HPV 66逆向引物：如SEQ ID NO:26所示；
HPV 68正向引物：如SEQ ID NO:27所示，HPV 68逆向引物：如SEQ ID NO:28所示。
2.一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的探针组合，其特征在于，包括：
HPV 16探针：如SEQ ID NO:29所示；HPV 18探针：如SEQ ID NO:30所示；
HPV 31探针：如SEQ ID NO:31所示；HPV 33探针：如SEQ ID NO:32所示；
HPV35探针：如SEQ ID NO:33所示；HPV 39探针：如SEQ ID NO:34所示；
HPV 45探针：如SEQ ID NO:35所示；HPV 51探针：如SEQ ID NO:36所示；
HPV 52探针：如SEQ ID NO:37所示；HPV 56探针：如SEQ ID NO:38所示；
HPV 58探针：如SEQ ID NO:39所示；HPV 59探针：如SEQ ID NO:40所示；
HPV 66探针：如SEQ ID NO:41所示；HPV 68探针：如SEQ ID NO:42所示。
3.一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的探针及引物的组合，其特征在于，包括：
正向引物和逆向引物：如SEQ ID NO:1～28所示；和
探针：SEQ ID NO:29～42所示。
4.一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
正向引物和逆向引物：如SEQ ID NO:1～28所示；和
探针：SEQ ID NO:29～42所示。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预混液，所述预混液优选为TaqMan Universal Master Mix。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括QPCR模板，所述QPCR模板如SEQ ID NO:43～56所示。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括作为检测时的背景DNA使用的HEK293细胞基因组DNA。
8.一种基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的反应体系，所述反应体系包括以下成分：
预混液：TaqMan Universal Master Mix(2×)；以及
选自以下组合中任意一组的引物、探针及相应的模板：
如SEQ ID NO:1～2所示的引物，如SEQ ID NO:29所示的探针及如SEQ ID NO:43所示的模板；
SEQ ID NO:3～4所示的引物，如SEQ ID NO:30所示的探针及如SEQ ID NO:44所示的模板；
SEQ ID NO:5～6所示的引物，如SEQ ID NO:31所示的探针及如SEQ ID NO:45所示的模板；
SEQ ID NO:7～8所示的引物，如SEQ ID NO:32所示的探针及如SEQ ID NO:46所示的模板；
SEQ ID NO:9～10所示的引物对，如SEQ ID NO:33所示的探针及如SEQ ID NO:47所示的模板；
SEQ ID NO:11～12所示的引物，如SEQ ID NO:44所示的探针及如SEQ ID NO:48所示的模板；
SEQ ID NO:13～14所示的引物，如SEQ ID NO:35所示的探针及如SEQ ID NO:49所示的模板；
SEQ ID NO:15～16所示的引物，如SEQ ID NO:36所示的探针及如SEQ ID NO:50所示的模板；
SEQ ID NO:17～18所示的引物，如SEQ ID NO:37所示的探针及如SEQ ID NO:51所示的模板；
SEQ ID NO:19～20所示的引物，如SEQ ID NO:38所示的探针及如SEQ ID NO:52所示的模板；
SEQ ID NO:21～22所示的引物，如SEQ ID NO:39所示的探针及如SEQ ID NO:53所示的模板；
SEQ ID NO:23～24所示的引物，如SEQ ID NO:40所示的探针及如SEQ ID NO:54所示的模板；
SEQ ID NO:25～26所示的引物，如SEQ ID NO:41所示的探针及如SEQ ID NO:55所示的模板；
SEQ ID NO:27～28所示的引物，如SEQ ID NO:42所示的探针及如SEQ ID NO:56所示的模板。
9.如权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述模板是以质粒的形式存在。
10.如权利要求9所述的反应体系，其特征在于，所述质粒包含如SEQ ID NO:43～56所示的模板靶序列。
11.一种非诊断目的的基于实时荧光PCR技术检测人乳头瘤病毒的方法，其特征在于，包括步骤：
1)提取待测样品总DNA；
2)制备14份反应体系，每份反应体系包括预混液、一对引物及相应的探针；所述预混液为TaqMan Universal Master Mix；所述引物包括正向引物和逆向引物，所述正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27所示，与所述各正向引物相对应的所述逆向引物的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ IDNO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ IDNO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28所示；与所述各正向引物相对应的所述探针的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:29～42所示；
3)将14种模板分别梯度稀释制成标准曲线样品；与所述各正向引物相对应的14种模板的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:43～56所示；
4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；
5)QPCR反应；
6)绘制标准曲线，分析待测样品的检测结果。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，标准样品的浓度梯度为每5μl含有1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，采用ABI 7500实时PCR系统进行QPCR反应。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，QPCR反应程序为：
Step1：95℃，10min；
Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；
Step2执行40cycles。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法用于细胞库中的人乳头瘤病毒污染检测。
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