CN101851630A - 人乳头瘤病毒dna片段、特异性引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供人乳头瘤病毒DNA片段、用于人乳头瘤病毒DNA检测和/或分型的混合引物及其应用。所述混合引物能特异性的扩增出一种或多种来源自HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV83的DNA序列,可用于人乳头瘤病毒DNA的检测和/或分型,该混合引物还可制成PCR试剂盒。本发明能一次检测出常见类型的HPV,大大提高了HPV的检测效率,克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染产生漏检的缺陷,实现对有关HPV疾病的早期诊断,适用于临床HPV基因检测及分型,以指导宫颈癌的防治。
Description
技术领域
本发明属于生物技术,涉及人乳头瘤病毒DNA的检测和/或分型。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种小的DNA双链病毒,目前已分出100余种HPV DNA,其中40多种与宫颈的感染和病变有关。根据HPV致病力的大小分为高危型和低危型两种,低危型主要引起生殖道、肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CIN I);高危型主要导致CIN II、III级病变和宫颈癌的发生。持续高危HPV感染是CIN进一步发展为宫颈癌的必经过程,从感染高危HPV开始至发展为宫颈癌的时间间隔为15年,故宫颈癌是可预防的特殊癌症。目前,经流行病学和生物学证明,HPV感染是引起宫颈癌及其癌前病变的首要原因。因此,对HPV进行检测及分型是一种有效的、可靠的宫颈癌筛查手段。
传统的HPV检测方法有巴氏涂片法、液基层细胞学检查、阴道镜检查、组织病理学检查、电镜直接观察、放射免疫沉淀法检查、酶联免疫吸附法检查等,这些检测方法的灵敏度和准确率均不够理想,且不能够对HPV进行分型。传统的HPV分型方法有PCR、原位杂交、探针分析等,这些方法操作复杂,准确率不高,且价格昂贵,难以推广。
最近几年,为了克服传统检测方法的不足,采用新的分子生物学检测方法对HPV进行检测,这些方法有核酸杂交法、聚合酶链反应PCR法、荧光免疫检测法等,但是这些方法仍然操作繁琐,且价格昂贵。因此,开发一种简单、易行、成本较低的检测方法就显得尤为重要。
美国Qiagen公司推出的杂交捕获二代(HC-II)检测技术是获FDA唯一批准的可在临床使用的一种检测HPV DNA的技术,是目前最流行的HPV分子生物技术检测试剂盒,但是该试剂盒只能同时检测13种高危型HPV(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68),不能做到具体的分型。因此,仍然需要改进的HPV检测分型系统。
发明内容
因此,本发明的目的在于,提供一组人乳头瘤病毒DNA片段。
本发明的另一个目的在于,提供一组用于检测和/或分型人乳头瘤病毒的混合引物及其应用。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。
一方面,本发明提供了一组人乳头瘤病毒DNA片段组合,所述DNA片段组合包括如SEQ ID NO:1-31所示的DNA序列,其分别来源自HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83。
另一方面,本发明提供了能特异性扩增出前述DNA片段组合中的至少一种DNA片段的引物,所述引物包括选自下列的一种或多种引物对:
1)HPV6的引物对:如SEQ ID NO:32-33、SEQ ID NO:34-35、SEQ IDNO:36-37或SEQ ID NO:38-39所示的序列;
2)HPV11的引物对:如SEQ ID NO:40-41、SEQ ID NO:42-43、SEQ IDNO:44-45或SEQ ID NO:46-47所示的序列;
3)HPV16的引物对:如SEQ ID NO:48-49、SEQ ID NO:50-51、SEQ IDNO:52-53或SEQ ID NO:54-55所示的序列;
4)HPV18的引物对:如SEQ ID NO:56-57、SEQ ID NO:58-59、SEQ IDNO:60-61或SEQ ID NO:62-63所示的序列;
5)HPV26的引物对:如SEQ ID NO:64-65、SEQ ID NO:66-67、SEQ IDNO:68-69或SEQ ID NO:70-71所示的序列;
6)HPV31的引物对:如SEQ ID NO:72-73、SEQ ID NO:74-75、SEQ IDNO:76-77或SEQ ID NO:78-79所示的序列;
7)HPV33的引物对:如SEQ ID NO:80-81、SEQ ID NO:82-83、SEQ IDNO:84-85或SEQ ID NO:86-87所示的序列;
8)HPV35的引物对:如SEQ ID NO:88-89、SEQ ID NO:90-91、SEQ IDNO:92-93或SEQ ID NO:94-95所示的序列;
9)HPV39的引物对:如SEQ ID NO:96-97、SEQ ID NO:98-99、SEQ IDNO:100-101或SEQ ID NO:102-103所示的序列;
10)HPV40的引物对:如SEQ ID NO:104-105、SEQ ID NO:106-107、SEQ ID NO:108-109或SEQ ID NO:110-111所示的序列;
11)HPV42的引物对:如SEQ ID NO:112-113、SEQ ID NO:114-115、SEQID NO:116-117或SEQ ID NO:118-119所示的序列;
12)HPV43的引物对:如SEQ ID NO:120-121、SEQ ID NO:122-123、SEQ ID NO:124-125或SEQ ID NO:126-127所示的序列;
13)HPV44的引物对:如SEQ ID NO:128-129、SEQ ID NO:130-131、SEQ ID NO:132-133或SEQ ID NO:134-135所示的序列;
14)HPV45的引物对:如SEQ ID NO:136-137、SEQ ID NO:138-139、SEQ ID NO:140-141或SEQ ID NO:142-143所示的序列;
15)HPV51的引物对:如SEQ ID NO:144-145或SEQ ID NO:146-147所示的序列;
16)HPV52的引物对:如SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:150-151、SEQ ID NO:152-153或SEQ ID NO:154-155所示的序列;
17)HPV53的引物对:如SEQ ID NO:156-157、SEQ ID NO:158-159、SEQ ID NO:160-161或SEQ ID NO:162-163所示的序列;
18)HPV54的引物对:如SEQ ID NO:164-165、SEQ ID NO:166-167、SEQ ID NO:168-169或SEQ ID NO:170-171所示的序列;
19)HPV55的引物对:如SEQ ID NO:172-173、SEQ ID NO:174-175、SEQ ID NO:176-177或SEQ ID NO:178-179所示的序列;
20)HPV56的引物对:如SEQ ID NO:180-181、SEQ ID NO:182-183、SEQ ID NO:184-185或SEQ ID NO:186-187所示的序列;
21)HPV58的引物对:如SEQ ID NO:188-189、SEQ ID NO:190-191、SEQ ID NO:192-193或SEQ ID NO:194-195所示的序列;
22)HPV59的引物对:如SEQ ID NO:196-197、SEQ ID NO:198-199、SEQ ID NO:200-201或SEQ ID NO:202-203所示的序列;
23)HPV61的引物对:如SEQ ID NO:204-205、SEQ ID NO:206-207、SEQ ID NO:208-209或SEQ ID NO:210-211所示的序列;
24)HPV66的引物对:如SEQ ID NO:212-213、SEQ ID NO:214-215、SEQ ID NO:216-217或SEQ ID NO:218-219所示的序列;
25)HPV68的引物对:如SEQ ID NO:220-221、SEQ ID NO:222-223、SEQ ID NO:224-225或SEQ ID NO:226-227所示的序列;
26)HPV70的引物对:如SEQ ID NO:228-229、SEQ ID NO:230-231、SEQ ID NO:232-233或SEQ ID NO:234-235所示的序列;
27)HPV72的引物对:如SEQ ID NO:236-237、SEQ ID NO:238-239、SEQ ID NO:240-241或SEQ ID NO:242-243所示的序列;
28)HPV73的引物对:如SEQ ID NO:244-245、SEQ ID NO:246-247、SEQ ID NO:248-249或SEQ ID NO:250-251所示的序列;
29)HPV81的引物对:如SEQ ID NO:252-253、SEQ ID NO:254-255、SEQ ID NO:256-257或SEQ ID NO:258-259所示的序列;
30)HPV82的引物对:如SEQ ID NO:260-261、SEQ ID NO:262-263、SEQ ID NO:264-265或SEQ ID NO:266-267所示的序列;以及
31)HPV83的引物对:如SEQ ID NO:268-269、SEQ ID NO:270-271、SEQ ID NO:272-273或SEQ ID NO:274-275所示的序列。
优选地,所述的引物,其包括能特异性扩增出前述DNA片段组合中至少分别源自HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59和HPV68的DNA序列的引物对。
优选地,所述的引物,其包括能特异性扩增出前述DNA片段组合中至少分别源自HPV 6、HPV 11、HPV 26、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV44、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 61、HPV 66、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV83的DNA序列的引物对。
优选地,所述的引物,其包括能特异性扩增出前述DNA片段组合中分别源自HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV83的DNA序列的全部31种引物对。
又一方面,本发明还提供了将前述的混合引物在制备用于检测和/或分型人乳头瘤病毒的产品中的应用。
优选地,所述的引物用于检测和/或分型人乳头瘤病毒的试剂盒。优选地,该试剂盒还包括细胞裂解液、核酸结合缓冲液、核酸洗涤液和PCR反应液。
再一方面,本发明还提供了一种在体外对HPV进行分型的方法,其包括以下步骤:1)提取样本DNA;2)使用前述的引物进行多重PCR反应;3)检测反应产物,其中步骤1)所述的样本,包括人或其他生物的体液或组织样本。
综上所述,本发明选取31种常见类型的HPV稳定存在的DNA片段,针对各DNA片段设计出多对特异性引物,选取两种或两种以上DNA片段的引物混合后组成的混合引物,能一次检测出样本中所含有的HPV,甚至是全部31种HPV。可见,本发明提供的用于检测和/或分型人乳头瘤病毒DNA的31种HPV DNA片段,其应用包括由针对该31种DNA片段而分别设计出的两种或多种特异性引物混合而成的混合引物,由两种或多种混合引物制成的试剂盒等工具,都具有检测和/或分型HPV DNA的用途。本发明具有以下有益效果:
(1)本发明基于聚合酶链反应PCR法,具有该方法简单、易行、技术成熟、结果稳定且成本低的优点;
(2)已有的分析方法只能检测13种以内的重型HPV感染,对于13种重型感染意外的HPV病毒感染均认为是阴性,而本发明不但可以实现对31种HPV感染均一一分型,还能纠正以往的分析方法中假阴性的误断,将混合感染患者所感染的各型HPV病毒一一检测出,更准确的对HPV病毒感染作出体外检测和分型;
(3)本发明能一次同时检测31种不同类型HPV DNA,大大提高了HPV的检测效率,克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染产生漏检的缺陷,实现对有关HPV疾病的早期诊断,适用于临床检测HPV基因及分型,以指导宫颈癌的防治;
(4)本发明所采用的方法属于一个HPV分型的基础研究,也可将此技术用于其他分型的检测。不仅为进一步研究HPV的分型提供了有力的基础技术支持,还对其他病毒的分型检测提供了借鉴。
附图说明
图1为使用MEGA4.0软件制作的本发明31种HPV病毒的进化树模型。
图2A至图2E为用31对单引物分别扩增HPV DNA片段的电泳图。
图3A至图3E为用含31对引物的混合引物扩增HPV DNA片段的电泳图。
图4A至图4E为用31对单引物分别扩增HPV DNA片段作为对照,验证含31对引物的混合引物扩增HPV DNA片段的电泳图,其中A1~A7、B1~B6、C1~C7、D1~D7、E1~E4为混合引物扩增,A1’~A7’、B1’~B6’、C1’~C7’、D1’~D7’、E1’~E4’为作为对照的单引物扩增。
图5A至图5D为临床样本验证电泳图,其中图5A为用含31对引物的混合引物扩增临床样本1~3的电泳图;图5B为用31对单引物扩增临床样本1的电泳图;图5C为用31对单引物扩增临床样本2的电泳图;图5D为用31对单引物扩增临床样本3的电泳图。
下表将附图中的代码与其所对应的病毒类型说明如下:
病毒型号 代码 病毒型号 代码
HPV 58 A1、A1’ HPV 43 C4、C4’
HPV 35 A2、A2’ HPV 44 C5、C5’
HPV 33 A3、A3’ HPV 11 C6、C6’
HPV 68 A4、A4’ HPV 40 C7、C7’
HPV 45 A5、A5’ HPV 82 D1、D1’
HPV 31 A6、A6’ HPV 81 D2、D2’
HPV 18 A7、A7’ HPV 83 D3、D3’
HPV 16 B1、B1’ HPV 66 D4、D4’
HPV 39 B2、B2’ HPV 70 D5、D5’
HPV 51 B3、B3’ HPV 61 D6、D6’
HPV 52 B4、B4’ HPV 53 D7、D7’
HPV 56 B5、B5’ HPV 72 E1、E1’
HPV 59 B6、B6’ HPV 54 E2、E2’
HPV 6 C1、C1’ HPV 26 E3、E3’
HPV 73 C2、C2’ HPV 42 E4、E4’
HPV 55 C3、C3’
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明,而不用于限定本发明的范围。
以下实施例中所使用的技术,除非特别说明,均为本领域的技术人员已知的常规技术;所使用的仪器设备、试剂等,除非是本说明书特别说明,均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1:31种HPV基因DNA片段的选择
将GenBank上公布的31种HPV病毒的基因组全部进行基因比较,对比同源性,选择出本发明所提供的31种HPV基因DNA片段。
31种HPV病毒的基因登录号分别如下(见括号内所示):HPV6[X00203]、HPV 11[M14119]、HPV 16[K02718]、HPV 18[X05015]、HPV 26[X74472]、HPV 31[J04353]、HPV 33[M12732]、HPV 35[X74477]、HPV 39[M62849]、HPV 40[X74478]、HPV 42[M73236]、HPV 43[AJ620205]、HPV 44[U31788]、HPV 45[X74479]、HPV 51[M62877]、HPV 52[X74481]、HPV 53[X74482]、HPV 54[U37488]、HPV 55[U31791]、HPV 56[X74483]、HPV 58[D90400]、HPV 59[X77858]、HPV 61[U31793]、HPV 66[U31794]、HPV 68[X67161]、HPV 70[U21941]、HPV 72[X94164]、HPV 73[X94165]、HPV 81[AJ620209]、HPV 82[AB027021]和HPV 83[AF151983]。
根据同源性比较结果,使用MEGA4.0软件制作出各亚型HPV病毒的进化树模型,如图1所示,其原理是通过各个HPV亚型之间的基因比较,推导得出各亚型之间的进化距离,构建一个进化距离矩阵,基于该矩阵中的进化距离关系构建出进化树模型。
最终选择出本发明的31种HPV基因DNA片段序列,为SEQ ID NO:1-31所示的DNA序列,其分别来源自HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83。其中,所选取31种不同分型的HPV DNA片段同源性最低,大小不同,以便电泳区分检测结果。
实施例2:设计出31种HPV基因DNA片段多对不同的引物
设计引物之前,分析待测靶序列的性质,选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。寡核苷酸引物长度为15~30bp。引物的Tm值一般控制在55~60℃,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2℃。有效引物中(G+C)的比例一般为40~60%。
本发明用primer软件进行设计,并根据每个引物的得分多少进行挑选。每个片段选择了10对得分最高的引物进行试验,扩增不出目的条带的引物被删除,重新进行选择。
根据上述方法所设计出的实施例1所述全部31种人乳头瘤病毒DNA片段的特异性引物如下,括号内为被扩增序列起止位点:
1)HPV6的引物对:如SEQ ID NO:32-33(278-403)、SEQ ID NO:34-35(7-108)、SEQ ID NO:36-37(278-592)或SEQ ID NO:38-39(836-950)所示的序列;
2)HPV11的引物对:如SEQ ID NO:40-41(114-454)、SEQ ID NO:42-43(354-751)、SEQ ID NO:44-45(8-347)或SEQ ID NO:46-47(453-834)所示的序列;
3)HPV16的引物对:如SEQ ID NO:48-49(38-434)、SEQ ID NO:50-51*(117-505)、SEQ ID NO:52-53(120-553)或SEQ ID NO:54-55(232-647)所示的序列;
4)HPV18的引物对:如SEQ ID NO:56-57(39-243)、SEQ ID NO:58-59(252-457)、SEQ ID NO:60-61(439-642)或SEQ ID NO:62-63(405-694)所示的序列;
5)HPV26的引物对:如SEQ ID NO:64-65(65-265)、SEQ ID NO:66-67(417-616)、SEQ ID NO:68-69(705-905)或SEQ ID NO:70-71(1228-1427)所示的序列;
6)HPV31的引物对:如SEQ ID NO:72-73(24-382)、SEQ ID NO:74-75(40-306)、SEQ ID NO:76-77(127-366)或SEQ ID NO:78-79(351-690)所示的序列;
7)HPV33的引物对:如SEQ ID NO:80-81(28-219)、SEQ ID NO:82-83(129-337)、SEQ ID NO:84-85(317-512)或SEQ ID NO:86-87(339-525)所示的序列;
8)HPV35的引物对:如SEQ ID NO:88-89(28-302)、SEQ ID NO:90-91(53-321)、SEQ ID NO:92-93(46-699)或SEQ ID NO:94-95(1294-1460)所示的序列;
9)HPV39的引物对:如SEQ ID NO:96-97(4-439)、SEQ ID NO:98-99(34-461)、SEQ ID NO:100-101(145-582)或SEQ ID NO:102-103(554-887)所示的序列;
10)HPV40的引物对:如SEQ ID NO:104-105(10-595)、SEQ ID NO:106-107(22-613)、SEQ ID NO:108-109(137-733)或SEQ ID NO:110-111(440-1044)所示的序列;
11)HPV42的引物对:如SEQ ID NO:112-113(15-267)、SEQ ID NO:114-115(23-273)、SEQ ID NO:116-117(127-371)或SEQ ID NO:118-119(243-495)所示的序列;
12)HPV43的引物对:如SEQ ID NO:120-121(44-271)、SEQ ID NO:122-123(125-360)、SEQ ID NO:124-125(102-335)或SEQ ID NO:126-127(458-687)所示的序列;
13)HPV44的引物对:如SEQ ID NO:128-129(1-288)、SEQ ID NO:130-131(54-339)、SEQ ID NO:132-133(133-420)或SEQ ID NO:134-135(341-636)所示的序列;
14)HPV45的引物对:如SEQ ID NO:136-137(135-363)、SEQ ID NO:138-139(440-686)、SEQ ID NO:140-141(613-819)或SEQ ID NO:142-143(794-1130)所示的序列;
15)HPV51的引物对:如SEQ ID NO:144-145(10-335)或SEQ ID NO:146-147(19-344)所示的序列;
16)HPV52的引物对:如SEQ ID NO:148-149(37-221)、SEQ ID NO:150-151(64-254)、SEQ ID NO:152-153(209-390)或SEQ ID NO:154-155(608-795)所示的序列;
17)HPV53的引物对:如SEQ ID NO:156-157(37-221)、SEQ ID NO:158-159(65-242)、SEQ ID NO:160-161(328-498)或SEQ ID NO:162-163(742-938)所示的序列;
18)HPV54的引物对:如SEQ ID NO:164-165(82-262)、SEQ ID NO:166-167(259-452)、SEQ ID NO:168-169(534-711)或SEQ ID NO:170-171(563-753)所示的序列;
19)HPV55的引物对:如SEQ ID NO:172-173(1-193)、SEQ ID NO:174-175(50-242)、SEQ ID NO:176-177(146-341)或SEQ ID NO:178-179(450-634)所示的序列;
20)HPV56的引物对:如SEQ ID NO:180-181(19-188)、SEQ ID NO:182-183(58-227)、SEQ ID NO:184-185(79-249)或SEQ ID NO:186-187(180-300)所示的序列;
21)HPV58的引物对:如SEQ ID NO:188-189(36-140)、SEQ ID NO:190-191(97-203)、SEQ ID NO:192-193(108-212)或SEQ ID NO:194-195(651-756)所示的序列;
22)HPV59的引物对:如SEQ ID NO:196-197(1-114)、SEQ ID NO:198-199(34-148)、SEQ ID NO:200-201(25-134)或SEQ ID NO:202-203(248-357)所示的序列;
23)HPV61的引物对:如SEQ ID NO:204-205(20-471)、SEQ ID NO:206-207(42-512)、SEQ ID NO:208-209(62-538)或SEQ ID NO:210-211(243-700)所示的序列;
24)HPV66的引物对:如SEQ ID NO:212-213(11-242)、SEQ ID NO:214-215(48-281)、SEQ ID NO:216-217(200-443)或SEQ ID NO:218-219(223-467)所示的序列;
25)HPV68的引物对:如SEQ ID NO:220-221(12-141)、SEQ ID NO:222-223(34-163)、SEQ ID NO:224-225(193-310)或SEQ ID NO:226-227(1298-1427)所示的序列;
26)HPV70的引物对:如SEQ ID NO:228-229(8-258)、SEQ ID NO:230-231(18-269)、SEQ ID NO:232-233(215-465)或SEQ ID NO:234-235(398-649)所示的序列;
27)HPV72的引物对:如SEQ ID NO:236-237(14-142)、SEQ ID NO:238-239(39-177)、SEQ ID NO:240-241(120-261)或SEQ ID NO:242-243(254-383)所示的序列;
28)HPV73的引物对:如SEQ ID NO:244-245(24-199)、SEQ ID NO:246-247(33-207)、SEQ ID NO:248-249(104-277)或SEQ ID NO:250-251(323-502)所示的序列;
29)HPV81的引物对:如SEQ ID NO:252-253(14-130)、SEQ ID NO:254-255(115-229)、SEQ ID NO:256-257(147-261)或SEQ ID NO:258-259(203-322)所示的序列;
30)HPV82的引物对:如SEQ ID NO:260-261(1-102)、SEQ ID NO:262-263(19-121)、SEQ ID NO:264-265(103-205)或SEQ ID NO:266-267(379-480)所示的序列;以及
31)HPV83的引物对:如SEQ ID NO:268-269(17-306)、SEQ ID NO:270-271(55-344)、SEQ ID NO:272-273(84-269)或SEQ ID NO:274-275(205-489)所示的序列。
实施例3:用31对单引物分别扩增31个HPV DNA模板
用根据实施例2所设计的31对特异性引物分别对其相应的31个HPVDNA模板单独进行PCR扩增。所用引物对为SEQ ID NO:32-33、SEQ IDNO:40-41、SEQ ID NO:48-49、SEQ ID NO:56-57、SEQ ID NO:64-65、SEQ ID NO:72-73、SEQ ID NO:80-81、SEQ ID NO:88-89、SEQ ID NO:96-97、SEQ ID NO:104-105、SEQ ID NO:112-113、SEQ ID NO:120-121、SEQ ID NO:128-129、SEQ ID NO:136-137、SEQ ID NO:144-145、SEQID NO:148-149、SEQ ID NO:156-157、SEQ ID NO:164-165、SEQ ID NO:172-173、SEQ ID NO:180-181、SEQ ID NO:188-189、SEQ ID NO:196-197、SEQ ID NO:204-205、SEQ ID NO:212-213、SEQ ID NO:220-221、SEQID NO:228-229、SEQ ID NO:236-237、SEQ ID NO:244-245、SEQ ID NO:252-253、SEQ ID NO:262-261和SEQ ID NO:268-269。
1)单引物PCR扩增:
a)在200μL Eppendorf管内配制25μL反应体系:
其中的2×buffer包括MgCl2 5mmol/L、Tris-HCl(pH 8.8,25℃)20mmol/L、KCl 30mmol/L、(NH4)2SO4 20mmol/L、dNTP 20mM、Taq DNA多聚酶0.08U/μL。
b)PCR条件:
第一阶段94℃,2分钟;
第二阶段94℃,20秒;60℃,30秒;72℃,45秒;共30个循环;
第三阶段72℃,2分钟。
2)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的正确性:
a)制备2%的琼脂糖凝胶
将0.8g琼脂糖中加入1×TAE 40mL,煮沸使其溶解后,冷却至50℃,加入染料0.5μL,混匀后倒胶。
b)电泳
设置:电压150V,时间20min;
点样:10μL样品+1μL 6×loading buffer(上海生工),marker1(上海生工,片段大小为分别为:100、200、300、400、500、600、700bp)4μL;电泳结束后在紫外仪下观察结果,如图2A至图2E所示,为用31对单引物分别扩增HPV DNA模板的电泳图,表明使用所设计的引物均能扩增出HPV DNA片段。
实施例4:用混合引物分别扩增31个HPV DNA模板
单引物验证结果正确后,将实施例3所使用的31对引物以1∶1的比例混合(单引物的终浓度稀释了3倍)形成混合引物,用于本实施例中。
1)混合引物PCR扩增
a)在200μL Eppendorf管内配制25μL反应体系:
其中的2×buffer包括MgCl2 5mmol/L、Tris-HCl(pH 8.8,25℃)20mmol/L、KCl 30mmol/L、(NH4)2SO4 20mmol/L、dNTP 20mM、Taq DNA多聚酶0.08U/μL。
b)PCR条件:
第一阶段94℃,2分钟;
第二阶段94℃,20秒;60℃,30秒;72℃,45秒;共30个循环;
第三阶段72℃,2分钟。
2)聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶(PAGE)电泳检测PCR产物的正确性
a)制备5%的PAGE凝胶
b)电泳
用混合引物PCR扩增的片段大小、亮度必须与单独引物扩增的结果一致且没有杂带。
设置:电压100V,时间30min;
点样:10μL样品+1μL 6×loading buffer(上海生工),marker1(上海生工,片段大小为分别为:100、200、300、400、500、600、700bp)4μL;洗胶
蒸馏水洗→10%乙醇洗→1%HNO3洗→蒸馏水洗→0.2%AgNO3于脱色摇床上脱色30min→双蒸水10s/次洗2次→3%Na2CO3+0.15%甲醛于脱色摇床上显色5min→蒸馏水洗→3%乙酸10min停止显色。
电泳结束后在紫外仪下观察结果,如图3A至图3E所示,为用含31对引物的混合引物扩增HPV DNA片段的电泳图。从图中可以看出,使用所设计的混合引物能扩增出对应的HPV DNA片段。
实施例5:用混合引物分别扩增31个HPV DNA模板,以单引物扩增的31个PCR产物做为对照品进行电泳验证
将实施例3中单引物扩增的31个PCR产物做为对照品(可用凝胶纯化试剂盒回收并浓缩),验证用混合引物分别扩增31个HPV DNA模板(样品)的准确性。
测序胶电泳验证对照品和样品的操作方法如下:
a)用去污剂溶液清洗玻璃板和间隔条,用自来水彻底冲洗后,再用蒸馏水冲洗,最后用乙醇冲洗板并晾干(必须彻底洗净玻璃板,以确保灌胶时不会产生气泡)。
b)测序板的硅化处理
长板(亲和硅烷):1mL涂满长板,涂匀,5min后用95%乙醇洗3次,去多余的亲和硅烷;
短板(剥离硅烷):更换手套,避免与亲和硅烷交叉污染;1.5mL涂满短板,涂匀,10min后用干净镜头纸檫去多余的剥离硅烷。
c)装板与封边
将板的两侧及底边封严,在灌胶时不至于漏胶。将板的两侧放置好0.4mm的塑料间隔边条,安装固定用夹板,底用透明胶带封好,防止渗漏。
d)测序凝胶的灌制制备(60mL 5%的PAGE胶)
混匀后倒入夹板中,不要留有气泡。测序凝胶的银染染色过程要求凝胶浸在塑料盘中,大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
e)电泳
设置:电压1500V,时间30min;
点样:10μL样品+2μL6×loading buffer(上海生工),marker1(上海生工,片段大小为分别为:100、200、300、400、500、600、700bp)4μL;
电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板,凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
f)洗胶
蒸馏水洗→10%乙醇洗→1%HNO3洗→蒸馏水洗→0.2%AgNO3于脱色摇床上脱色30min→双蒸水10s/次洗2次→3%Na2CO3+0.15%甲醛于脱色摇床上显色5min→蒸馏水洗→3%乙酸10min停止显色。
将混合引物的31个PCR扩增产物和对照品(31个模板DNA)与marker 进行对照,检测混合引物扩增产物的准确性,结果如图4A至图4E所示,表明混合引物能够准确的扩增出对应单引物扩增的HPV DNA片段。
实施例6:多重PCR扩增试剂盒的组成
本发明所提供的试剂盒成分如下:
试剂盒由一个拭子,一个10mL试管,一个200μL PCR管,A、B、C、D四瓶试剂组成,各试剂分别详述如下:
A液:细胞裂解液,52mL,每次用1mL,设计用量50次;
B液:核酸结合缓冲液,52mL,每次用1mL,设计用量50次;
C液:核酸洗涤液,52mL,每次用1mL,设计用量50次;
D液:PCR反应液,0.8mL,每次用13.5uL,设计用量50次。
其中的2×buffer包括MgCl2 5mmol/L、Tris-HCl(pH 8.8,25℃)20mmol/L、KCl 30mmol/L、(NH4)2SO4 20mmol/L、dNTP 20mM、Taq DNA多聚酶0.08U/μL。
实施例7:PCR扩增试剂盒的操作步骤
本发明实施例6所提供的多重PCR扩增试剂盒的操作步骤如下:
a)使用拭子刮取适量的待测细胞,加入10mL试管中,试管中已加入了5mL细胞洗涤液和5ml生理盐水,轻轻转动拭子,将待测细胞洗下;
b)低速离心后细胞沉入管底,抽出上清,加入A液,室温条件下作用10分钟,裂解掉待测细胞,释放DNA;
c)加入B液和核酸吸附填料,混合均匀,微微振动,在合适的离子强度下,核酸结合到填料上;
d)加入溶液C洗掉多余的不结合杂质,即成为待检测的细胞样品;
e)将细胞样品1μL溶于10.5μL蒸馏水中,与D液混合后进行PCR扩增反应;
实施例8:对临床样本的验证
使用混合引物对3个临床样本进行PCR扩增,并分别使用31对单引物对这3个临床样本分别进行扩增作为对照,验证混合引物的扩增结果。
使用实施例6所提供的多重PCR扩增试剂盒,分别扩增3个临床样本,具体操作方法如下:
a)样本的制备:用一次性宫颈拭子取病人子宫颈组织表面细胞,溶于10ml生理盐水中,混合均匀后,取1ml于灭菌的1.5ml离心管中,12000r/min离心2min,去上清。
b)裂解:将细胞液低速离心,1000r/min,15min。抽出上清液,加入A液1ml,室温条件下裂解10min。
c)吸附:加入核酸吸附填料和B液1ml,微微振动,混合均匀,使核酸结合到填料上,抽出上清液。
d)冲洗:在吸附填料上加入C液1ml,洗掉多余的不结合杂质,抽出上清液。
e)DNA原位提取:在吸附填料上加入D液1管,溶膜释放DAN。
f)PCR反应:将25μL上清液加入EP管中,进行PCR反应,反应条件为:第一阶段94℃,2分钟;第二阶段94℃,20秒;50℃,30秒;72℃,45秒;共30个循环;第三阶段72℃,2分钟。
参照实施例5所提供的方法对PCR扩增产物进行测序胶电泳验证,结果如图5A至图5D所示。
用混合引物扩增临床样本1、2和3的电泳图,如图5A所示。从图5A可以看出,样本1扩增出一条片段,样本2扩增出两条目标片段,样本3可见三条目标片段,以上扩增出的目标片段,分别表明该临床患者至少感染的HPV病毒分型数。
用31对单引物扩增临床样本1的电泳图,如图5B所示。由图可知,从临床样本1中扩增出E1片段,与混合引物扩增结果相同,表明临床样本1中感染的HPV病毒为HPV26。
用31对单引物扩增临床样本2的电泳图,如图5C所示。由图可知,从临床样本中扩增出D2和D3片段,与混合引物扩增结果相同,表明临床样本2中感染的HPV病毒为HPV81和HPV 83。
用31对单引物扩增临床样本3的电泳图,如图5D所示。由图可知,从临床样本中扩增出E2、E3和E4片段,与混合引物扩增结果相同,表明临床样本3中感染的HPV病毒为HPV54、HPV26和HPV42。
以上结果表明,采用本发明所提供的混合引物及其试剂盒可以有效的扩增出临床样本中的HPV病毒片段并对其进行分型。
序列表
<110>白向阳
宁波基内生物技术有限公司
<120>人乳头瘤病毒DNA片段、特异性引物及其应用
<130>DIC08110160
<160>275
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1503
<212>DNA
<213>HPV6片段
<400>1
atgtggcggc ctagcgacag cacagtatat gtgcctcctc ctaaccctgt atccaaagtt 60
gttgccacgg atgcttatgt tactcgcacc aacatatttt atcatgccag cagttctaga 120
cttcttgcag tgggtcatcc ttatttttcc ataaaacggg ctaacaaaac tgttgtgcca 180
aaggtgtcag gatatcaata cagggtattt aaggtggtgt taccagatcc taacaaattt 240
gcattgcctg actcgtctct ttttgatccc acaacacaac gtttggtatg ggcatgcaca 300
ggcctagagg tgggcagggg acagccatta ggtgtgggtg taagtggaca tcctttccta 360
aataaatatg atgatgttga aaattcaggg agtggtggta accctggaca ggataacagg 420
gttaatgttg gtatggatta taaacaaaca caattatgca tggttggatg tgccccccct 480
ttgggcgagc attggggtaa aggtaaacag tgtactaata cacctgtaca ggctggtgac 540
tgcccgccct tagaacttat taccagtgtt atacaggatg gcgatatggt tgacacaggc 600
tttggtgcta tgaattttgc tgatttgcag accaataaat cagatgttcc tatttacata 660
tgtggcacta catgtaaata tccagattat ttacaaatgg ctgcagaccc atatggtgat 720
agattatttt tttttctacg gaaggaacaa atgtttgcca gacatttttt taacagggct 780
ggcgaggtgg gggaacctgt gcctgatact cttataatta agggtagtgg aaatcgaacg 840
tctgtaggga gtagtatata tgttaacacc ccaagcggct ctttggtgtc ctctgaggca 900
caattgttta ataagccata ttggctacaa aaagcccagg gacataacaa tggtatttgt 960
tggggtaatc aactgtttgt tactgtggta gataccacac gcagtaccaa catgacatta 1020
tgtgcatccg taactacatc ttccacatac accaattctg attataaaga gtacatgcgt 1080
catgtggaag agtatgattt acaatttatt tttcaattat gtagcattac attgtctgct 1140
gaagtaatgg cctatattca cacaatgaat ccctctgttt tggaagactg gaactttggg 1200
ttatcgcctc ccccaaatgg tacattagaa gatacctata ggtatgtgca gtcacaggcc 1260
attacctgtc aaaagcccac tcctgaaaag gaaaagccag atccctataa gaaccttagt 1320
ttttgggagg ttaatttaaa agaaaagttt tctagtgaat tggatcagta tcctttggga 1380
cgcaagtttt tgttacaaag tggatatagg ggacggtcct ctattcgtac cggtgttaag 1440
cgccctgctg tttccaaagc ctctgctgcc cctaaacgta agcgcgccaa aaccaaaagg 1500
taa 1503
<210>2
<211>1506
<212>DNA
<213>HPV11片段
<400>2
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gttgccacgg atgcgtatgt taaacgcacc aacatatttt atcacgccag cagttctaga 120
ctccttgctg tgggacatcc atattactct atcaaaaaag ttaacaaaac agttgtacca 180
aaggtgtctg gatatcaata tagagtgttt aaggtagtgt tgccagatcc taacaagttt 240
gcattacctg attcatctct gtttgacccc actacacagc gtttagtatg ggcgtgcaca 300
gggttggagg taggcagggg tcaaccttta ggcgttggtg ttagtgggca tccattgcta 360
aacaaatatg atgatgtaga aaatagtggt gggtatggtg gtaatcctgg tcaggataat 420
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ccgttaggtg aacattgggg taagggtaca caatgttcaa atacctctgt acaaaatggt 540
gactgccccc cgttggaact tattaccagt gttatacagg atggggacat ggttgataca 600
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ctatgtgcat ctgtgtctaa atctgctaca tacactaatt cagattataa ggaatacatg 1080
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gcagaagtca tggcctatat acacacaatg aatccttctg ttttggagga ctggaacttt 1200
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<210>3
<211>1596
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<400>3
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caattgtgtt taattggttg caaaccacct ataggggaac actggggcaa aggatcccca 600
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<210>4
<211>1707
<212>DNA
<213>HPV18片段
<400>4
atgtgcctgt atacacgggt cctgatatta cattaccatc tactacctct gtatggccca 60
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atttgtggcc attatattat tttattccta agaaacgtaa acgtgttccc tatttttttg 180
cagatggctt tgtggcggcc tagtgacaat accgtatatc ttccacctcc ttctgtggca 240
agagttgtaa ataccgatga ttatgtgact cccacaagca tattttatca tgctggcagc 300
tctagattat taactgttgg taatccatat tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag 360
caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa tatagagtat ttagggtgca gttacctgac 420
ccaaataaat ttggtttacc tgatactagt atttataatc ctgaaacaca acgtttagtg 480
tgggcctgtg ctggagtgga aattggccgt ggtcagcctt taggtgttgg ccttagtggg 540
catccatttt ataataaatt agatgacact gaaagttccc atgccgccac gtctaatgtt 600
tctgaggacg ttagggacaa tgtgtctgta gattataagc agacacagtt atgtattttg 660
ggctgtgccc ctgctattgg ggaacactgg gctaaaggca ctgcttgtaa atcgcgtcct 720
ttatcacagg gcgattgccc ccctttagaa cttaaaaaca cagttttgga agatggtgat 780
atggtagata ctggatatgg tgccatggac tttagtacat tgcaagatac taaatgtgag 840
gtaccattgg atatttgtca gtctatttgt aaatatcctg attatttaca aatgtctgca 900
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tatttgcaaa tgtctgctga tccctatggg gattctatgt ttttttgcct acgccgtgaa 840
caactgtttg caagacattt ttggaatagg gcaggtgtta tgggtgacac agtacctacg 900
gacctatata ttaaaggcac tagcgctaat atgcgtgaaa cccctggcag ttgtgtgtat 960
tccccttctc ccagtggctc tattattact tctgattctc aattatttaa taagccatat 1020
tggttacata aggcccaggg ccataacaat ggtatttgtt ggcataatca gttgtttgtt 1080
actgtagtgg acactacccg cagtactaat ttaacattat gtgcctctac acaaaatcct 1140
gtgccaagta catatgaccc tactaagttt aagcagtata gtagacatgt ggaggaatat 1200
gatttacagt ttatttttca gttgtgcact attactttaa ctgcagaggt tatgtcatat 1260
atccatagta tgaatagtag tatattagaa aattggaatt ttggtgtccc tccaccacct 1320
actacaagtt tggtggatac atatcgtttt gtgcaatcag ttgctgttac ctgtcaaaag 1380
gatactacac ctccagaaaa gcaggatcca tatgataaat taaagttttg gactgttgac 1440
ctaaaggaaa aattttcctc cgatttggat caatatcccc ttggtcgaaa gtttttagtt 1500
caggctgggt tacgtcgtag gcctaccata ggacctcgta agcgtcctgc tgcttccacg 1560
tctactgcat ctactgcatc taggcctgcc aaacgtgtac gtatacgtag taagaaataa 1620
<210>15
<211>453
<212>DNA
<213>HPV51片段
<400>15
gcgcagggtc acaataatgg catttgctgg aacaatcagc tttttattac ctgtggtaga 60
tactaccaga agtacaaatt taactattag cactgccact gctgcggttt ccccaacatt 120
tactccaagt aactttaagc aatatattag gcatggggaa gaatatgatt tgcaatttat 180
ttttcaatta tgtaaaatta ctttaactac agaggtaatg gcttatttac acacaatgga 240
tcctaccatt cttgaacagt ggaattttgg attaacatta cctccgtctg ctagtttgga 300
ggatgcatat aggtttgtta gaaatgcagc tactagctgt caaaaggata cccctccaca 360
ggctaagcca gatcctttgg ccaaatataa attttgggat gttgatttaa aggaacgatt 420
ttctttagat ttagaccaat ttgcattggg tcg 453
<210>16
<211>1590
<212>DNA
<213>HPV52片段
<400>16
atggtacaga ttttatttta catcctagtt attttttact acgtcgcagg cgtaaacgtt 60
ttccatattt ttttacagat gtccgtgtgg cggcctagtg aggccactgt gtacctgcct 120
cctgtacctg tctctaaggt tgtaagcact gatgagtatg tgtctcgcac aagcatctat 180
tattatgcag gcagttctcg attactaaca gtaggacatc cctatttttc tattaaaaac 240
accagtagtg gtaatggtaa aaaagtttta gttcccaagg tgtctggcct gcaatacagg 300
gtatttagaa ttaaattgcc ggaccctaat aaatttggtt ttccagatac atctttttat 360
aacccagaaa cccaaaggtt ggtgtgggcc tgtacaggct tggaaattgg taggggacag 420
cctttaggtg tgggtattag tgggcatcct ttattaaaca agtttgatga tactgaaacc 480
agtaacaaat atgctggtaa acctggtata gataataggg aatgtttatc tatggattat 540
aagcagactc agttatgcat tttaggatgc aaacctccta taggtgaaca ttggggtaag 600
ggaacccctt gtaataataa ttcaggaaat cctggggatt gtcctcccct acagctcatt 660
aacagtgtaa tacaggatgg ggacatggta gatacaggat ttggttgcat ggattttaat 720
accttgcaag ctagtaaaag tgatgtgccc attgatatat gtagcagtgt atgtaagtat 780
ccagattatt tgcaaatggc tagcgagcca tatggtgaca gtttgttctt ttttcttaga 840
cgtgagcaaa tgtttgttag acactttttt aatagggccg gtaccttagg tgaccctgtg 900
ccaggtgatt tatatataca agggtctaac tctggcaata ctgccactgt acaaagcagt 960
gctttttttc ctactcctag tggttctatg gtaacctcag aatcccaatt atttaataaa 1020
ccgtactggt tacaacgtgc gcagggccac aataatggca tatgttgggg caatcagttg 1080
tttgtcacag ttgtggatac cactcgtagc actaacatga ctttatgtgc tgaggttaaa 1140
aaggaaagca catataaaaa tgaaaatttt aaggaatacc ttcgtcatgg cgaggaattt 1200
gatttacaat ttatttttca attgtgcaaa attacattaa cagctgatgt tatgacatac 1260
attcataaga tggatgccac tattttagag gactggcaat ttggccttac cccaccaccg 1320
tctgcatctt tggaggacac atacagattt gtcacttcta ctgctataac ttgtcaaaaa 1380
aacacaccac ctaaaggaaa ggaagatcct ttaaaggact atatgttttg ggaggtggat 1440
ttaaaagaaa agttttctgc agatttagat cagtttcctt taggtaggaa gtttttgtta 1500
caggcagggc tacaggctag gcccaaacta aaacgccctg catcatcggc cccacgtacc 1560
tccacaaaga agaaaaaggt taaaaggtaa 1590
<210>17
<211>1500
<212>DNA
<213>HPV53片段
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atggcggtgt ggcggcctag tgacagcaag gtttatctgc ctcctacccc tgtatcaaag 60
gtcattacaa cggatgccta tgtaaaacgc accactatat tttatcatgc tggaagctct 120
cgcttgctta ccgtgggaca tccttattac cccatttcta aatctggtaa agcagacatc 180
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agtagggata atgtttcagt ggatcctaaa caaacacagt tatgcattat tggctgtgca 480
cccgctacag gtgaacactg gacaaagggt acggcctgtc gttccacacc tactacagcg 540
ggcgactgcc ccccattgga acttatcaat tcacctattg aggatggaga catggtggac 600
acaggttttg gtgcattaaa ctttaaagct ttgcaggaat ctaaatctga tgtgccattg 660
gatattgtac aatccacatg taaatatccc gattatttga aaatgagtgc agatgcctat 720
ggggattcta tgtggtttta tttacgtagg gaacagttgt ttaccagaca tttttttaat 780
agggcaggcg ttattggtga ggaaatacct aatgacttat atattaaggg tagtaatggc 840
agggacccgc cccctagctc tgtatatgtt gctacaccta gtgggtctat gataacttca 900
gaggctcaat tgtttaataa gccatattgg ctgcaacgtg cccagggaca taataatggc 960
atctgttgga acaatcagtt atttgtaact gttgtggata ccaccaggaa tacaaacatg 1020
actctttccg caaccacaca gtctatgtct acatataatt caaagcaaat taaacagtat 1080
gttagacatg cagaggaata tgaattacaa tttgtgtttc aactatgtaa aatatccctg 1140
tctgctgagg ttatggccta tttacatact atgaattcta ccttactgga agactggaat 1200
ataggtttgt cgcctcctgt tgccactagc ttagaggaca aatacagata tgtgaaaagt 1260
gcagctataa cctgtcaaaa ggatcagccc cctcctgaaa agcaggaccc actatctaaa 1320
tataaatttt gggaggtcaa tttgcaaaac agtttttctg ctgatttgga tcagtttcct 1380
cttggcagga agtttttaat gcaggttggg gtccgtacta aaccgcctgt atcctctaaa 1440
aaacgctctg cttctactac atctacctca gccccctcct ccaagcgcaa acgcaaatag 1500
<210>18
<211>1494
<212>DNA
<213>HPV54片段
<400>18
atgtggcggc ctagcgaaaa caaagtatac ctgcctccta ccccagtttc taaggttgtc 60
agcacggatg aatatgtgac tcgcacaagc atatactatc atgcaagcag ctctagatta 120
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ggactgcctg atcctagttt atataatcct gagacacaac gcttagtatg ggcatgcaca 300
ggtgtggagg ttggtagggg ccagccattg ggtcttggcc taagtggtca tccattatta 360
aataaattgg atgatactga aaatgcacct aaatatgttg gtgcaggagc tgacaatagg 420
gaaaatgtta gcatggacta taaacaaaca cagttatgta ttttgggctg cacaccacct 480
ataggtgaac actgggctaa aggcaaccta tgtacaccta atacattggc tgctggtgac 540
tgtcctcctt tggaattagt aaattcatat atacaggatg gtgatatggt agatatagga 600
tttggggcta tggattttaa aaccctacaa acctcaaaaa gtgaggtacc ccttgatgta 660
gctacctcaa tttgtaaata tcctgattac cttaaaatgg ctgcagaggc atatggggac 720
agtttatttt tttacttaag gcgggaacaa atgtttgtta ggcatatgtt aaatagggca 780
ggtaccatgg gtgagcctgt acctaatgac ttatacatta agaaatcctc aggtaacctt 840
gacagttcta tttatgctgc aactcctagt ggctctatgg taacatctga ataccaaata 900
tttaataagc catactggtt acaacgggcc cagggtcaaa acaatggtat ttgttggggc 960
aatcaggtgt ttttaacagt tgtagatacc acccgtagta ctaacctaac attgtgtgct 1020
acagcatcca cgcaggatag ctttaataat tctgacttta gggagtatat tagacatgtg 1080
gaggaatatg atttacagtt tatatttcag ttatgtacca taacccttac agcagatgtt 1140
atggcctata ttcatggaat gaatcccact attctagagg actggaactt tggtataacc 1200
cccccagcta caagtagttt ggaggacaca tataggtttg tacagtcaca ggccattgca 1260
tgtcaaaaga ataatgcccc tgcaaaggaa aaggaggatc cttacagtaa atttaatttt 1320
tggactgttg accttaagga acgattttca tctgaccttg accagtttcc cttgggtcgc 1380
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<210>19
<211>1506
<212>DNA
<213>HPV55片段
<400>19
atgtggcggc ctagtgaaaa ccaggtatat gtgcctcctc ccgccccagt atccaaagta 60
ataactacgg atgcctatgt caaacgcacc aacatagttt accatgctag cagttctaga 120
cttcttgctg taggcaaccc ttattttgcc atacgaccag caaacaagac acttgtgcct 180
aaagtttcag gatttcaata tagggttttt aaggtggtat tgccagaccc taataaattt 240
gcattacctg acacatctat atatgaccct actacgcaac gcctggtatg ggcctgcatt 300
gggttggaag tgggtagagg ccagcccctg ggtgttggta ttagtgggca tccattatta 360
aacaaattgg atgatgtgga aaattctgct agttatgcag ccagtccagg tcaggacaac 420
agggtaaatg tggccatgga ctataaacaa acacaattat gtttagttgg ctgtgcaccc 480
ccattggggg agcattgggg taagggcaag ccatgtaata atggtagtgt aaatagcgga 540
gactgccctc ccctggaatt aattactagt gttatcgaag atggtgatat ggtggacact 600
ggttttggag ccatgaattt cgctgaattg caaccaaata aatctgatgt tcccttagat 660
atatgcactg ctacatgcaa atatcctgac tatttacaaa tggctgctga tccatatggg 720
gacagattgt ttttttactt acgaaaggaa caaatgtttg caagacattt ttttaatagg 780
gcgggaacgg ttggagagga cattccacag gatttggttt ttaaaggtgc tactaaaagt 840
acagttccta atgccatata ctttaataca cccagtgggt ctcttgtatc ttctgaaacc 900
caattattta ataagccttt ttggttgcaa agggcgcagg gccacaataa tggtatttgt 960
tgggggaatc agttatttgt tactgttgta gatactacac gtagtacaaa catgacaata 1020
tgtgctgcta caactcagtc tccatctaca acatataata gtacagaata taaacaatac 1080
atgcgacatg ttgaggagtt tgacttacag tttatgtttc aattatgtag tattacctta 1140
actgctgagg taatggccta tttacatacc atgaatcctg gtattttgga acagtggaac 1200
tttgggttgt cgccaccccc aaatggtacc ttagaagaca aatacagata tgtgcagtca 1260
caggccatta catgtcaaaa gcctccccct gaaaaggcaa agcaggaccc ctatgcaaaa 1320
ttaagttttt gggaggtaga tctcagagaa aagttttcta gtgagttaga tcaatatccc 1380
cttggtagga aatttttatt gcaaacgggt gtgcaggccc ggtcctctgt tcgtgtgggt 1440
agaaaacgtc ctgcatctgc agccacttca tcctccagta aacccaaacg gtctaggaag 1500
aagtag 1506
<210>20
<211>1605
<212>DNA
<213>HPV56片段
<400>20
atgatgttac ccatgatgta tatatacagg gatcctcctt tgcattatgg cctgtgtatt 60
tttttagacg taggcgccgt aaacgtattc cctatttttt tgcagatggc gacgtggcgg 120
cctagtgaaa ataaggtgta tctacctcca acacctgttt caaaggttgt ggcaacggat 180
tcctatgtaa aacgcactag tatattttat catgcaggca gttcacgatt gcttgccgta 240
ggacatccct attactctgt gactaaggac aataccaaaa caaacattcc caaagttagt 300
gcatatcaat atagggtatt tagggtacgg ttgcccgacc ctaataagtt tgggcttcca 360
gatactaata tttataatcc ggaccaggaa cggttagtgt gggcatgtgt aggtttggag 420
gtaggccgcg gacagccttt aggtgctggg ctaagtggcc atccattgtt taataggctg 480
gatgatactg aaagttccaa tttagcaaat aataatgtta tagaagatag tagggacaat 540
atatcagttg atggcaagca aacacagttg tgtattgttg gatgtactcc cgctatgggt 600
gaacattgga ctaaaggtgc tgtgtgtaag tccacacaag ttaccacagg ggactgcccg 660
cctcttgcat taattaatac acctatagag gatggggaca tgatagacac aggatttggc 720
gctatggact ttaaggtgtt gcaggaatct aaggctgagg tacctttaga cattgtacaa 780
tccacctgta aatatcctga ctatttaaaa atgtctgcag atgcctatgg tgattctatg 840
tggttttact tacgcaggga acaattattt gccagacatt attttaatag ggctggtaaa 900
gttggggaaa caatacctgc agagttatat ttaaagggta gcaatggtag agaaccccct 960
ccgagttctg tatatgttgc tacgcctagt gggtctatga ttacgtctga ggcacagtta 1020
tttaataaac cttattggtt gcaacgtgcc caaggccata ataatggcat ttgctggggt 1080
aatcaattat ttgttactgt agtagatact actagaagta ctaacatgac tattagtact 1140
gctacagaac agttaagtaa atatgatgca cgaaaaatta atcagtacct tagacatgtg 1200
gaggaatatg aattacaatt tgtttttcaa ttatgcaaaa ttactttgtc tgcagaggtt 1260
atggcatatt tacataatat gaatgctaac ctactggagg actggaatat tgggttatcc 1320
ccgccagtgg ccaccagcct agaagataaa tatagatatg ttagaagcac agctataaca 1380
tgtcaacggg aacagccacc aacagaaaaa caggacccat tagctaaata taaattttgg 1440
gatgttaact tacaggacag tttttctaca gacctggatc aatttccact gggtagaaaa 1500
tttttaatgc aactgggcac taggtcaaag cctgctgtag ctacctctaa aaagcgatct 1560
gctcctacct ccacctctac accagcaaaa cgtaaaaggc ggtag 1605
<210>21
<211>1575
<212>DNA
<213>HPV58片段
<400>21
atggtgctga ttttatgttg caccctagct atcttatttt gcgtcgcaga cgtaaacgtt 60
ttccatattt ttttgcagat gtccgtgtgg cggcctagtg aggccactgt gtacctgcct 120
cctgtgcctg tgtctaaggt tgtaagcact gatgaatatg tgtcacgcac aagcatttat 180
tattatgctg gcagttccag acttttggct gttggcaatc catatttttc catcaaaagt 240
cccaataaca ataaaaaagt attagttccc aaggtatcag gcttacagta tagggtcttt 300
agggtgcgtt tacctgatcc caataaattt ggttttcctg atacatcttt ttataaccct 360
gatacacaac gtttggtctg ggcatgtgta ggccttgaaa taggtagggg acagccattg 420
ggtgttggcg taagtggtca tccttattta aataaatttg atgacactga aaccagtaac 480
agatatcccg cacagccagg gtctgataac agggaatgct tatctatgga ttataaacaa 540
acacaattat gtttaattgg ctgtaaacct cccactggtg agcattgggg taaaggtgtt 600
gcctgtaaca ataatgcagc tgctactgat tgtcctccat tggaactttt taattctatt 660
attgaggatg gtgacatggt agatacaggg tttggatgca tggactttgg tacattgcag 720
gctaataaaa gtgatgtgcc tattgatatt tgtaacagta catgcaaata tccagattat 780
ttaaaaatgg ccagtgaacc ttatggggat agtttgttct tttttcttag acgtgagcag 840
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cgtgcacaag gtcataacaa tggcatttgc tggggcaatc agttatttgt taccgtggtt 1080
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aaaaatgata attttaagga atatgtacgt catgttgaag aatatgactt acagtttgtt 1200
tttcagcttt gcaaaattac actaactgca gagataatga catatataca tactatggat 1260
tccaatattt tggaggactg gcaatttggt ttaacacctc ctccgtctgc cagtttacag 1320
gacacatata gatttgttac ctcccaggct attacttgcc aaaaaacagc accccctaaa 1380
gaaaaggaag atccattaaa taaatatact ttttgggagg ttaacttaaa ggaaaagttt 1440
tctgcagatc tagatcagtt tcctttggga cgaaagtttt tattacaatc aggccttaaa 1500
gcaaagccca gactaaaacg ttcggcccct actacccgtg caccatccac caaacgcaaa 1560
aaggttaaaa aataa 1575
<210>22
<211>1527
<212>DNA
<213>HPV59片段
<400>22
atggctctat ggcgttctag tgacaacaag gtgtatctac ctccaccttc ggtagctaag 60
gttgtcagca ctgatgagta tgtcacccgt accagtattt tctaccacgc aggcagttcc 120
agacttctta cagttggaca tccatatttt aaagtaccta aaggtggtaa tggtagacag 180
gatgttccta aggtgtctgc atatcaatac agagtattta gggttaagtt acctgatccc 240
aataaatttg gccttccaga taacacagta tatgatccta actctcaacg cttggtctgg 300
gcctgtgtag gtgttgaaat cggtcggggc caacctttag gggtaggact cagtggtcat 360
ccattatata ataaattgga tgacactgaa aactctcatg tagcatctgc tgttgatacc 420
aaagatacac gtgataatgt atctgtggat tataaacaaa ctcagctgtg tattattggc 480
tgtgtacctg ccattggaga acactggaca aagggcactg cttgtaagcc tactactgtg 540
gttcagggcg attgtcctcc actagaatta ataaatacac caattgaaga tggtgatatg 600
gtagacacag gatatggggc tatggacttt aaattgttgc aggataacaa aagtgaagta 660
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tggaatagat ctggtactat gggtgatcaa cttcctgaat cactatatat taaaggtact 840
gacatacgtg ccaacccagg cagttattta tattcccctt ccccaagtgg gtctgtggtt 900
acttctgatt cacaattatt taataaacca tattggctgc acaaggctca gggtttaaac 960
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aatctttctg tgtgtgcttc tactacttct tctattccta atgtatacac acctaccagt 1080
tttaaagaat atgccagaca tgtggaggaa tttgatttgc agtttatatt tcaactgtgt 1140
aaaataacat taactacaga ggtaatgtca tacattcata atatgaatac cactattttg 1200
gaggattgga attttggtgt tacaccacct cctactgcta gtttagttga cacataccgt 1260
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ccttatgaca aactaaagtt ttggcctgta gatcttaagg aaaggttttc tgcagatctt 1380
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ataggcccac gcaaacgtgc agcgcctgcc cctacctcta ccccatcacc aaaacgtgtt 1500
aagcgtcgca agtcttccag aaaatag 1527
<210>23
<211>1518
<212>DNA
<213>HPV61片段
<400>23
atggctttgt ggcggcctgg tgacggcaag gtatacctgc ctcccactcc tgtgtctaaa 60
gttatcagta ctgaccgtta tgtgcaacgc accaacttat tttattatgg tggcagttcc 120
cgtctgctta ctgtaggaca tccctattgt agtttgcagc ttgatgggct gcagggcaag 180
aaaaacacta tccccaaggt gtctggctat caatataggg tgtttagggt acagcttcct 240
gaccctaata aatttgcttt gcctgatggc accttgtata atcctgatac tgagcgcatg 300
gtgtgggcct gcaggggcat tgaggttggt agggggcagc cattgggggt tggtactagt 360
ggtcacccgc tgtacaatcg cctggatgac actgaaaaca ccacattact tgttgcagag 420
tcctctgaca gtcgtgacaa tgtgtctgtt gattataagc agacccagct acttattgta 480
ggttgcaaac cccctattgg ggaacactgg acaaagggta ctgcttgtgc taaccccgcg 540
ccccggccca ctgactgtcc tccattggaa tttacaaata ccaccataca ggatggcgat 600
atggtggaaa caggctatgg ggccattgat tttgctgcat tgcaggaaaa taaatctgaa 660
gtgccattgg atatttgcac cactatatgc aagtatcctg attatttaca aatggctgct 720
gaaccatatg gagactgtat gtttttttgt ttacgcaggg aacaaatgtt tgctcgccac 780
tttttcaatc gccagggtgt catgggtgag gcactgcctg actcttatta tcttaagggt 840
gcgaatgaca aggcggcccc tggtagttat atttattccc ctacgcctag tggctctatg 900
gtgtcctctg attcccaatt atttaataag ccatattggc tgcaacgtgc ccagggccac 960
aacaatggta tttgttggtt taatgaattg tttgtaaccg ttgtggatac cacccgcagt 1020
actaatttaa ccatttgtac tgctacatcc ccccctgtat ctgaatataa agccacaagc 1080
tttagggaat atttgcgcca tacagaggag tttgatttgc aatttatttt tcagttatgt 1140
aaaatacatt taacccctga aattatggcc tacctacata atatgaataa ggccttgttg 1200
gatgactgga actttggtgt ggtaccacca ccctctacca gtttagaaga cacatatagg 1260
tttttgcagt ccagagctat tacatgtcag aagggtgctg ctgccccgcc gcccaaggag 1320
gatcgctatg ccaagttatc cttttggact gttgatttac gagacaagtt ttccactgat 1380
ttggatcagt ttcctttggg gcgcaagttt ttattgcagg ccggtccccg ctcagtatct 1440
gtgtcacgca aacgtgctgc ccccagctct acccctacat cctcccctgc tacaaaacgc 1500
aaaaagcgta aacagtag 1518
<210>24
<211>1512
<212>DNA
<213>HPV66片段
<400>24
atggcgatgt ggcggcctag tgacaataag gtgtacctac ctccaacacc tgtttcaaag 60
gttgtggcaa cggatacata tgtaaaacgt accagtatat tttatcatgc aggtagctct 120
aggttgcttg ctgttggcca tccttattac tctgtttcca aatctggtac caaaacaaac 180
atccctaaag ttagtgcata tcagtataga gtgtttaggg tacggttgcc tgatcctaat 240
aagtttggcc ttcctgatcc atctttctat aatcctgacc aggaacgttt ggtatgggcc 300
tgtgtaggtt tggaggtagg ccgaggtcaa cctttaggtg ctgggttaag tggtcatcca 360
ttatttaata ggctggatga cactgaggtc tctaatttag caggtaataa tgttatagaa 420
gatagccggg acaatatatc tgttgattgt aaacaaaccc agttatgtat tgtgggatgt 480
gcaccagcat taggggaaca ttggactaag ggcgcggtgt gtaagtctac accaggtaat 540
acaggggatt gtccacctct tgcattagtt aataccccga tagaggacgg tgacatggtg 600
gacaccgggt ttggtgcaat ggactttaag ctattacagg aatcaaaggc tgaggtgcca 660
ttggacattg tacaatctac atgtaaatat cctgattatt taaaaatgtc tgcagatgcc 720
tatggggatt ctatgtggtt ttacttacgc agggaacaat tgtttgccag acattacttt 780
aatagggcag gtaatgttgg ggaagccatt cctacagatt tgtattggaa gggtggcaat 840
ggcagggacc ctcctcccag ttctgtatat gttgctactc ctagtgggtc catgattacc 900
tctgaggccc aattatttaa taaaccttat tggttgcaac gtgcacaggg ccataataat 960
ggcatatgct ggggtaatca ggtatttgtt actgttgtgg atactaccag aagcaccaac 1020
atgactatta atgcagctaa aagcacatta actaaatatg atgcccgtga aatcaatcaa 1080
taccttcgcc atgtggagga atatgaacta cagtttgtgt ttcaactttg taaaataacc 1140
ttaactgcag aagttatggc atatttgcat aatatgaata atactttatt agacgattgg 1200
aatattggct tatccccacc agttgcaact agcttagagg ataaatatag gtatattaaa 1260
agcacagcta ttacatgtca gagggaacag ccccctgcag aaaagcagga tcccctggct 1320
aaatataagt tttgggaagt taatttacag gacagctttt ctgcagacct ggatcagttt 1380
cctttgggta gaaaattttt aatgcaacta ggccctagac cccctagacc caaggctagt 1440
gtatctgcct ctaaaaggcg ggcggctcct acctcttcct cttcttcacc agctaaacgt 1500
aaaaaacgat ag 1512
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<212>DNA
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atggcattgt ggcgagctag cgacaacatg gtgtatttgc ctcccccctc agtggcgaag 60
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ggcattccta aggtgtctgc atatcaatac agagtgttta gggttacctt acctgatcct 240
aataaattta gtgttcctga gtctacatta tataatccag atacacagcg catggtatgg 300
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ccactatata ataggctgga tgatactgaa aattccccgt tttcctctaa taaaaatcct 420
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caacaagggg actgtccccc attggaattg gtaaatactc ctattgagga tggcgatatg 600
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tcctctgact cccagttatt taacaagccc tattggctgc acaaggcaca gggacacaac 960
aatggtattt gttggcataa tcaattattt cttaccgttg tggatacaac gcgcagtact 1020
aattttacat tgtccactac tacagactct actgtaccag ctgtgtatga ttctaataaa 1080
tttaaggaat atgttaggca tgttgaggaa tatgatttgc agtttatatt tcagttgtgt 1140
actataacat tatccactga tgtaatgtca tatatacata ctatgaatcc tgctattttg 1200
gatgattgga attttggtgt tgcccctcca ccatctgcta gtcttgtaga tacataccgc 1260
tacctacaat cagcagcaat tacatgtcaa aaggacgccc ctgcacctgt taaaaaagat 1320
ccctatgatg gtcttaactt ttggaatgtg gatttaaagg aaaagtttag ttctgaactg 1380
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atggctttgt ggcggtctag tgacaacacg gtgtatttgc cacccccttc tgtggcgaag 60
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aataagtttg gccttccgga tccttccctt tataatcctg acacacaacg cctggtatgg 300
gcctgtatag gtgtggaaat tggtagaggc cagccattgg gcgttggcgt tagtggacat 360
cctttatata atagattgga tgatactgaa aattctcatt tttcctctgc tgttagtaca 420
caggacagta gggacaatgt gtctgtggac tataagcaaa cacagttatg tattataggc 480
tgtgttcctg ctatgggaga gcactgggct aagggcaagg cctgtaagtc cactcaacag 540
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atggctttgt ggcggcctgg tgacggcaag gtatacctgc ctcccaatcc tgtttctaag 60
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tatggcaatt ctatgttttt tcatttacgc agggagcaaa tatttgctag gcattactat 780
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<210>31
<211>1512
<212>DNA
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cctaataagt ttagccttcc tgatacgtcc ctatataatc ctgacacgga acgcatggta 300
tgggcatgcc gcggtataga ggttggtcgt ggtcagcctc ttggcgtggg cactagtggc 360
catcccctat ataatcggct ggatgacact gaaaacacac cattgcttgc tgctgcagac 420
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tgtaagcccc caatagggga acactgggca aagggtactg tgtgttccgg tgtgtccccg 540
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ccatatggtg attgtatgtt cttttgcctc cgtagggaac aaatgtttgc acgacatttt 780
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ctggtatcgt ccgattccca actatttaat aagccctact ggctgcatcg tgcccaggga 960
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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aactctaatg gtggacaatc 20
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<211>20
<212>DNA
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tctactacct ctgtatggcc 20
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<212>DNA
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tcttgccaca gaaggaggag gtg 23
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<212>DNA
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taccgatgat tatgtgactc cc 22
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tataaatact agtatcaggt 20
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cctgatacta gtattta 17
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<211>20
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ctgcttataa tctacagaca 20
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<211>20
<212>DNA
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cctgtgctgg agtggaaatt 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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ctgggagtca gaggtaacaa tag 23
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<212>DNA
<213>人工序列
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tctcgggttg tcaacacgga t 21
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actgtggatc aggcaat 17
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agggacaatg tttcagttga t 21
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<212>DNA
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ctccaaagcc tgtatcaatc 20
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<212>DNA
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<400>68
aatgtctgca gatacatatg ga 22
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<212>DNA
<213>人工序列
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gaagtaacca tagagcca 18
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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gatgctatac ccaccacttt g 21
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<212>DNA
<213>人工序列
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cagataccat tattatgacc ctgt 24
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<212>DNA
<213>人工序列
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aacgaccaca tcaccatcta cga 23
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>73
caaatttatt aataatggat 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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tctacgactc ccacgtgatg caaat 25
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<212>DNA
<213>人工序列
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catagctcca aagcctgtat 20
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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tttgactaga tttagacgtc tt 22
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<212>DNA
<213>人工序列
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tggatgacca ctaataccta cacc 24
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>78
ataatcacca gtaggtaata a 21
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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acaaatagaa ttacaaatgt cca 23
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
acagtgtacc tgcctcctgt acctg 25
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
aaccctatat tgcaagccca at 22
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>82
tgctgttggc catccatat 19
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<211>17
<212>DNA
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gctgccctct acctatt 17
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>84
ttgaaatagg tagagggcag cca 23
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
ccccaatgtt ttacatccaa 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>86
gccttgaaat aggtagaggg 20
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>87
tgtaaactag cagatggagg a 21
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>88
actgtctacc tgcctccagt gtcag 25
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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gcccaaacca aacgctggag ga 22
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<212>DNA
<213>人工序列
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ccagtgtcag tgtctaaggt tgtt 24
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<212>DNA
<213>人工序列
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tacttcaact cctgtacagg ccc 23
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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cctgcctcca gtgtcagtgt c 21
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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tttgcaaatg gaactgcata tatg 24
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<212>DNA
<213>人工序列
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ctctgtggcg gtctaacgaa 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>95
ccattgcacc aaatcctgtg 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>96
tgaatggtgg tcgcaagcag 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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tacgggtagt gtccacaaca gta 23
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<213>人工序列
<400>98
tatttgcctc caccttctgt ggcga 25
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<212>DNA
<213>人工序列
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tgtgtctgtt tataatccac 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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tattttaaag tgggtatgaa 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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aataggggtg tttactagtt cc 22
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>102
ctcctttgga actagtaaac acc 23
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>103
ccgctgggag aggggcagta ta 22
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>104
cttaatgaaa atcaagtata ttta 24
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>105
ccatgtcgcc atcctgaata acctca 26
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>106
tataacaggt acatctggtc ggactc 26
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<213>人工序列
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gaagaggaag acgaggaagg 20
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>108
atccatactt tgagttaaa 19
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>109
ataaactatt tccatacgga gcc 23
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>110
tggattataa acagacaca 19
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggactgtgtg gcagcacata 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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aactactttt accatgccag cagt 24
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<212>DNA
<213>人工序列
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taataccaac gcccaaaggc tg 22
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<212>DNA
<213>人工序列
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atgtgcaacg caccaactac 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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aggctgtcca cgacctactt 20
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>116
acagagtatt tagagttagg ctcc 24
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<213>人工序列
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ataatccata gaaacatt 18
<210>118
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>118
cgtggacagc ctttgggcgt tggt 24
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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taaaactatt ttttaattc 19
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>120
cctcctccag ggcctatagc atctat 26
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<212>DNA
<213>人工序列
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atgtaaccag tgttgtttct ga 22
<210>122
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>122
ttgcagtggg tcacccatat ttc 23
<210>123
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>123
atacggatcc ggacttattc c 21
<210>124
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>124
acctgcggca tgtggaagaa 20
<210>125
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>125
tgcgccctaa gggaaactgg 20
<210>126
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>126
agctgtgtat tgttggctgt acac 24
<210>127
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>127
atatttactt ttactattaa c 21
<210>128
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>128
acgaccagca aacaagacac 20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>129
caccaactgt tccagcccta 20
<210>130
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>130
ggcctatagc atctattgtg agcac 25
<210>131
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>131
accaacacct aagggctgtc ctc 23
<210>132
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>132
ggtcacccat atttccccct ta 22
<210>133
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>133
gttatcctga cccggaccg 19
<210>134
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>134
ttaggtgttg gaataagtgg cca 23
<210>135
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>135
tggctgcaat tcagcaa 17
<210>136
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>136
cagagttgtc agcactgatg a 21
<210>137
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>137
ttcaggatta tatatagtag 20
<210>138
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>138
atccatttta taataaattg gatgat 26
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>139
tccaccatat caccatcct 19
<210>140
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>140
aacctggtga ctgtcctcct 20
<210>141
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>141
acgtaaccca gcctgaacta 20
<210>142
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>142
ctgctgatcc ctatggggat tctat 25
<210>143
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>143
gtagaggcac ataatgttaa att 23
<210>144
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>144
gcatttgctg gaacaatcag ctt 23
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>145
tagtagctgc atttctaac 19
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>146
gcactgccac tgctgcggtt tc 22
<210>147
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>147
gcagacggag gtaatgttaa 20
<210>148
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>148
ataacccaga aacccaaagg 20
<210>149
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>149
gtcctccaaa gatgcagacg 20
<210>150
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>150
tggtagatac taccagaagt acaa 24
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>151
caagaatggt aggatccatt gtg 23
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>152
cagaggtaat ggcttattta cacac 25
<210>153
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>153
tatatttggc caaaggatct ggct 24
<210>154
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>154
cttgtaataa taattcagga a 21
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>155
ttgcaaataa tctggatact taca 24
<210>156
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>156
ataacccaga aacccaaagg
20
<210>157
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>157
gtcctccaaa gatgcagacg 20
<210>158
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>158
tcaaaggtca ttacaacgga tgcct 25
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>159
aacttattag gatctggc 18
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>160
ccgtggacag cctttaggtg ttggt 25
<210>161
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>161
gtgttcacct atagcgggt 19
<210>162
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>162
ttacgtaggg aacagttgtt ta 22
<210>163
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>163
cgttgcagcc aatatggctt at 22
<210>164
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>164
atatgtgact cgcacaagca tata 24
<210>165
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>165
ataaactagg atcaggcagt ccaa 24
<210>166
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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ttatataatc ctgagacaca acgct 25
<210>167
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>167
tgtgtttgtt tatagtccat gctaa 25
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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aactcctagt ggctctatgg taa 23
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<213>人工序列
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aagggaaact ggtcaaggtc 20
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<211>26
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<213>人工序列
<400>170
attcatatat acaggatggt gatatg 26
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<213>人工序列
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catttgttcc cgccttaagt aa 22
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<213>人工序列
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tatgacccta ctacgcaacg c 21
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>173
ctccgctatt tacactacca ttattaca 28
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>174
tatccaaagt aataactacg gatg 24
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>175
gcaaatttat tagggtctgg 20
<210>176
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>176
ttgccatacg accagcaaac aaga 24
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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ataccaacac ccaggggctg 20
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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aacacaatta tgtttagttg gc 22
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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gttgcaattc agcgaaattc a 21
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<212>DNA
<213>人工序列
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tatatataca gggatcctcc tttgc 25
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<212>DNA
<213>人工序列
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cataataata aatgcaacac gcact 25
<210>182
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>182
tacggttgcc cgaccctaat 20
<210>183
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>183
cagacgtaat catagaccca ctag 24
<210>184
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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cgtaggcgcc gtaaacgtat tcc 23
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<212>DNA
<213>人工序列
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ttattgggac ttttgatgga a 21
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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ttcctatgta aaacgcacta gt 22
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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aaagacccta tactgtaagc ct 22
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<213>人工序列
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attgggtgtt ggcgtaagtg 20
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<213>人工序列
<400>190
gtggcggcct agtgaggcca ctgtg 25
<210>191
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>191
gtctggaact gccacgataa taat 24
<210>192
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>192
gtgaggccac tgtgtacctg cctcc 25
<210>193
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>193
cagccaaaag tctggaactg cca 23
<210>194
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>194
tggaactttt taattctatt attga 25
<210>195
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>195
ttacaaagat caataggcac atcac 25
<210>196
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>196
gtgtatctac ctccaccttc g 21
<210>197
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>197
tgccctttgt ccagtgttct ccaa 24
<210>198
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>198
aacaaggtgt atctacctcc accttcg 27
<210>199
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>199
aatatggatg tccaactgta agaag 25
<210>200
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>200
aacaaggtgt atctacctcc acc 23
<210>201
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>201
ctgtaagaag tctggaactg cctgc 25
<210>202
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>202
agataacaca gtatatgatc ctaactct 28
<210>203
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>203
ccactgagtc ctacccctaa ag 22
<210>204
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>204
gtgacggcaa ggtatacctg cctccc 26
<210>205
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>205
tagctgggtc tgcttataat caaca 25
<210>206
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>206
ttatgtgcaa cgcaccaact 20
<210>207
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>207
tgcgctcagt atcaggatta tacaagg 27
<210>208
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>208
gtgtctaaag ttatcagtac tgacc 25
<210>209
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>209
cggggttagc acaagcagta ccctt 25
<210>210
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>210
ccctaataaa tttgctttgc ctgatg 26
<210>211
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>211
caggatactt gcatatagtg gtgca 25
<210>212
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>212
ggcggcctag tgacaataag gtg 23
<210>213
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>213
aaacactcta tactgatatg cacta 25
<210>214
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>214
gcatatcagt atagagtgtt tagggtac 28
<210>215
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>215
tcacgggcat catatttagt t 21
<210>216
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>216
atcagtatag agtgtttagg gt 22
<210>217
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>217
tataacatta ttacctgcta aatta 25
<210>218
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>218
gtttagggta cggttgcctg atcctaa 27
<210>219
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>219
cagatatatt gtcccggcta tcttc 25
<210>220
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>220
gcgagctagc gacaacatgg tgta 24
<210>221
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>221
atggcctaca gttaataacc tagat 25
<210>222
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>222
tatttgcctc ccccctcagt ggcgaa 26
<210>223
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>223
cataggaacc ttaaaatatg gatgg 25
<210>224
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>224
gtgtctgcat atcaatacag agtg 24
<210>225
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>225
accaacacag gcccatacca tgcgc 25
<210>226
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>226
tggctgcaca aggcacaggg 20
<210>227
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>227
ggtagcggta tgtatctaca aga 23
<210>228
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>228
ctttgtggcg gtctagtgac 20
<210>229
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>229
ggatacccta aataccctat actgata 27
<210>230
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>230
tagtgacaac acggtgtatt tgccacc 27
<210>231
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>231
gggaaggatc cggaaggcca aactt 25
<210>232
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>232
tatttagggt atccctacct gat 23
<210>233
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>233
tgtgtttgct tatagtccac agaca 25
<210>234
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>234
atttttcctc tgctgttagt acacagga 28
<210>235
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>235
cacttttggt ttcctgcaat gtacg 25
<210>236
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>236
ggcctggtga cggcaaggta ta 22
<210>237
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>237
gatgtcctac agttagtaga cgaga 25
<210>238
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>238
gctgacaatt ctgacagtcg ggaca 25
<210>239
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>239
tccaaactgg tagaaggagg ag 22
<210>240
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>240
tcgtctacta actgtaggac atcctt 26
<210>241
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>241
aggcaaagca aatttattgg gatca 25
<210>242
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>242
ctttgcctga tggcacactt taca 24
<210>243
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>243
tccaagcgat tatacaaggg gtgac 25
<210>244
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>244
gataaggagc gcctagtatg g 21
<210>245
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>245
tctgggtatt tacaggtagt gttaga 26
<210>246
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>246
aggtatacct gccccctgtg tctgt 25
<210>247
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>247
cctgtattgc aaacctgaaa cttta 25
<210>248
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>248
tattattatg caggtagcac acg 23
<210>249
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>249
tatcaggatt ataaaaggat gcatc 25
<210>250
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>250
gacaaccctt aggtataggt act 23
<210>251
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>251
cccaatgttc ccctaaggga ggcct 25
<210>252
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>252
ggcctggtga cggcaaggta tac 23
<210>253
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>253
taagaaggcg ggaactgccc ccata 25
<210>254
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>254
tattggctac aacgggcaca 20
<210>255
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>255
gcagaaattc cttaaagtta gaggc 25
<210>256
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>256
ttgtacatta actattggta cc 22
<210>257
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>257
aggtaaagca aacttattag ggtca 25
<210>258
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>258
ccgggtgttt cgtgtgaagc tccct 25
<210>259
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>259
cctcaatgcc cctgcaagcc catac 25
<210>260
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>260
tatagggtgt ttagggtaca gttac 25
<210>261
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>261
aacatcctgt tggtcgttgc 20
<210>262
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>262
aatgacagca aagtgtattt accac 25
<210>263
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>263
accttgacgg acgtattatt atata 25
<210>264
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>264
tattatgcag gcagttccag acttatt 27
<210>265
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>265
tgactttccg tctatggaat ccata 25
<210>266
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>266
gatactgaaa actctaggtt tgcca 25
<210>267
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>267
cgtcggatat tacgtattga ctcaa 25
<210>268
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>268
ctggtgacgg caagacgtac ttgcc 25
<210>269
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>269
acgggtatgg tacgcaaggc acagt 25
<210>270
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>270
tctaaggtta tcagtacgga ccgtt 25
<210>271
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>271
ggttctccga ctggtgctgg ttgga 25
<210>272
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>272
gtggctccct ggtatcgtcc 20
<210>273
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>273
tgcgggtagt atctacaact gtaacaaa 28
<210>274
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>274
taccaatata gggtgtttcg catta 25
<210>275
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>275
cccgaatgtg ggttactatt attcg 25
Claims (10)
1.一组人乳头瘤病毒DNA片段组合,其特征在于,所述DNA片段组合包括如SEQ ID NO:1-31所示的31种DNA序列,其分别来源自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83。
2.能特异性扩增出权利要求1所述DNA片段组合中的至少一种DNA片段的引物,所述引物包括选自下列的一种或多种引物对:
1)HPV6的引物对:如SEQ ID NO:32-33、SEQ ID NO:34-35、SEQ IDNO:36-37或SEQ ID NO:38-39所示的序列;
2)HPV11的引物对:如SEQ ID NO:40-41、SEQ ID NO:42-43、SEQ IDNO:44-45或SEQ ID NO:46-47所示的序列;
3)HPV16的引物对:如SEQ ID NO:48-49、SEQ ID NO:50-51、SEQ IDNO:52-53或SEQ ID NO:54-55所示的序列;
4)HPV18的引物对:如SEQ ID NO:56-57、SEQ ID NO:58-59、SEQ IDNO:60-61或SEQ ID NO:62-63所示的序列;
5)HPV26的引物对:如SEQ ID NO:64-65、SEQ ID NO:66-67、SEQ IDNO:68-69或SEQ ID NO:70-71所示的序列;
6)HPV31的引物对:如SEQ ID NO:72-73、SEQ ID NO:74-75、SEQ IDNO:76-77或SEQ ID NO:78-79所示的序列;
7)HPV33的引物对:如SEQ ID NO:80-81、SEQ ID NO:82-83、SEQ IDNO:84-85或SEQ ID NO:86-87所示的序列;
8)HPV35的引物对:如SEQ ID NO:88-89、SEQ ID NO:90-91、SEQ IDNO:92-93或SEQ ID NO:94-95所示的序列;
9)HPV39的引物对:如SEQ ID NO:96-97、SEQ ID NO:98-99、SEQ IDNO:100-101或SEQ ID NO:102-103所示的序列;
10)HPV40的引物对:如SEQ ID NO:104-105、SEQ ID NO:106-107、SEQ ID NO:108-109或SEQ ID NO:110-111所示的序列;
11)HPV42的引物对:如SEQ ID NO:112-113、SEQ ID NO:114-115、SEQID NO:116-117或SEQ ID NO:118-119所示的序列;
12)HPV43的引物对:如SEQ ID NO:120-121、SEQ ID NO:122-123、SEQ ID NO:124-125或SEQ ID NO:126-127所示的序列;
13)HPV44的引物对:如SEQ ID NO:128-129、SEQ ID NO:130-131、SEQ ID NO:132-133或SEQ ID NO:134-135所示的序列;
14)HPV45的引物对:如SEQ ID NO:136-137、SEQ ID NO:138-139、SEQ ID NO:140-141或SEQ ID NO:142-143所示的序列;
15)HPV51的引物对:如SEQ ID NO:144-145或SEQ ID NO:146-147所示的序列;
16)HPV52的引物对:如SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:150-151、SEQ ID NO:152-153或SEQ ID NO:154-155所示的序列;
17)HPV53的引物对:如SEQ ID NO:156-157、SEQ ID NO:158-159、SEQ ID NO:160-161或SEQ ID NO:162-163所示的序列;
18)HPV54的引物对:如SEQ ID NO:164-165、SEQ ID NO:166-167、SEQ ID NO:168-169或SEQ ID NO:170-171所示的序列;
19)HPV55的引物对:如SEQ ID NO:172-173、SEQ ID NO:174-175、SEQ ID NO:176-177或SEQ ID NO:178-179所示的序列;
20)HPV56的引物对:如SEQ ID NO:180-181、SEQ ID NO:182-183、SEQ ID NO:184-185或SEQ ID NO:186-187所示的序列;
21)HPV58的引物对:如SEQ ID NO:188-189、SEQ ID NO:190-191、SEQ ID NO:192-193或SEQ ID NO:194-195所示的序列;
22)HPV59的引物对:如SEQ ID NO:196-197、SEQ ID NO:198-199、SEQ ID NO:200-201或SEQ ID NO:202-203所示的序列;
23)HPV61的引物对:如SEQ ID NO:204-205、SEQ ID NO:206-207、SEQ ID NO:208-209或SEQ ID NO:210-211所示的序列;
24)HPV66的引物对:如SEQ ID NO:212-213、SEQ ID NO:214-215、SEQ ID NO:216-217或SEQ ID NO:218-219所示的序列;
25)HPV68的引物对:如SEQ ID NO:220-221、SEQ ID NO:222-223、SEQ ID NO:224-225或SEQ ID NO:226-227所示的序列;
26)HPV70的引物对:如SEQ ID NO:228-229、SEQ ID NO:230-231、SEQ ID NO:232-233或SEQ ID NO:234-235所示的序列;
27)HPV72的引物对:如SEQ ID NO:236-237、SEQ ID NO:238-239、SEQ ID NO:240-241或SEQ ID NO:242-243所示的序列;
28)HPV73的引物对:如SEQ ID NO:244-245、SEQ ID NO:246-247、SEQ ID NO:248-249或SEQ ID NO:250-251所示的序列;
29)HPV81的引物对:如SEQ ID NO:252-253、SEQ ID NO:254-255、SEQ ID NO:256-257或SEQ ID NO:258-259所示的序列;
30)HPV82的引物对:如SEQ ID NO:260-261、SEQ ID NO:262-263、SEQ ID NO:264-265或SEQ ID NO:266-267所示的序列;以及
31)HPV83的引物对:如SEQ ID NO:268-269、SEQ ID NO:270-271、SEQID NO:272-273或SEQ ID NO:274-275所示的序列。
3.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,其至少包括能特异性扩增出权利要求1所述DNA片段组合中分别来源自HPV 16、HPV 18、HPV31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59和HPV 68的DNA序列的引物对。
4.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,其至少包括能特异性扩增出权利要求1所述DNA片段组合中分别来源自HPV 6、HPV 11、HPV26、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 61、HPV 66、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV83的DNA序列的引物对。
5.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,其包括能特异性扩增出权利要求1所述DNA片段组合中分别来源自HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83的DNA序列的全部31种引物对。
6.权利要求2至5中任一项所述的引物在制备用于检测和/或分型人乳头瘤病毒的产品中的用途。
7.包括权利要求2至5中任一项所述的引物的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,其还包括细胞裂解液、核酸结合缓冲液、核酸洗涤液和PCR反应液。
9.一种在体外对HPV进行分型的方法,其包括以下步骤:
1)提取样本DNA;
2)使用利要求2至5中任一项所述的引物进行多重PCR反应;
3)检测反应产物。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,其中所述的步骤1)的样本,包括人或其他生物的体液或组织样本。
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