CN101851630A - 人乳头瘤病毒dna片段、特异性引物及其应用 - Google Patents

人乳头瘤病毒dna片段、特异性引物及其应用 Download PDF

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白向阳
赵珊珊
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Abstract

本发明提供人乳头瘤病毒DNA片段、用于人乳头瘤病毒DNA检测和/或分型的混合引物及其应用。所述混合引物能特异性的扩增出一种或多种来源自HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV83的DNA序列,可用于人乳头瘤病毒DNA的检测和/或分型,该混合引物还可制成PCR试剂盒。本发明能一次检测出常见类型的HPV,大大提高了HPV的检测效率,克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染产生漏检的缺陷,实现对有关HPV疾病的早期诊断,适用于临床HPV基因检测及分型,以指导宫颈癌的防治。

Description

人乳头瘤病毒DNA片段、特异性引物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术,涉及人乳头瘤病毒DNA的检测和/或分型。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种小的DNA双链病毒,目前已分出100余种HPV DNA,其中40多种与宫颈的感染和病变有关。根据HPV致病力的大小分为高危型和低危型两种,低危型主要引起生殖道、肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CIN I);高危型主要导致CIN II、III级病变和宫颈癌的发生。持续高危HPV感染是CIN进一步发展为宫颈癌的必经过程,从感染高危HPV开始至发展为宫颈癌的时间间隔为15年,故宫颈癌是可预防的特殊癌症。目前,经流行病学和生物学证明,HPV感染是引起宫颈癌及其癌前病变的首要原因。因此,对HPV进行检测及分型是一种有效的、可靠的宫颈癌筛查手段。
传统的HPV检测方法有巴氏涂片法、液基层细胞学检查、阴道镜检查、组织病理学检查、电镜直接观察、放射免疫沉淀法检查、酶联免疫吸附法检查等,这些检测方法的灵敏度和准确率均不够理想,且不能够对HPV进行分型。传统的HPV分型方法有PCR、原位杂交、探针分析等,这些方法操作复杂,准确率不高,且价格昂贵,难以推广。
最近几年,为了克服传统检测方法的不足,采用新的分子生物学检测方法对HPV进行检测,这些方法有核酸杂交法、聚合酶链反应PCR法、荧光免疫检测法等,但是这些方法仍然操作繁琐,且价格昂贵。因此,开发一种简单、易行、成本较低的检测方法就显得尤为重要。
美国Qiagen公司推出的杂交捕获二代(HC-II)检测技术是获FDA唯一批准的可在临床使用的一种检测HPV DNA的技术,是目前最流行的HPV分子生物技术检测试剂盒,但是该试剂盒只能同时检测13种高危型HPV(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68),不能做到具体的分型。因此,仍然需要改进的HPV检测分型系统。
发明内容
因此,本发明的目的在于,提供一组人乳头瘤病毒DNA片段。
本发明的另一个目的在于,提供一组用于检测和/或分型人乳头瘤病毒的混合引物及其应用。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。
一方面,本发明提供了一组人乳头瘤病毒DNA片段组合,所述DNA片段组合包括如SEQ ID NO:1-31所示的DNA序列,其分别来源自HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83。
另一方面,本发明提供了能特异性扩增出前述DNA片段组合中的至少一种DNA片段的引物,所述引物包括选自下列的一种或多种引物对:
1)HPV6的引物对:如SEQ ID NO:32-33、SEQ ID NO:34-35、SEQ IDNO:36-37或SEQ ID NO:38-39所示的序列;
2)HPV11的引物对:如SEQ ID NO:40-41、SEQ ID NO:42-43、SEQ IDNO:44-45或SEQ ID NO:46-47所示的序列;
3)HPV16的引物对:如SEQ ID NO:48-49、SEQ ID NO:50-51、SEQ IDNO:52-53或SEQ ID NO:54-55所示的序列;
4)HPV18的引物对:如SEQ ID NO:56-57、SEQ ID NO:58-59、SEQ IDNO:60-61或SEQ ID NO:62-63所示的序列;
5)HPV26的引物对:如SEQ ID NO:64-65、SEQ ID NO:66-67、SEQ IDNO:68-69或SEQ ID NO:70-71所示的序列;
6)HPV31的引物对:如SEQ ID NO:72-73、SEQ ID NO:74-75、SEQ IDNO:76-77或SEQ ID NO:78-79所示的序列;
7)HPV33的引物对:如SEQ ID NO:80-81、SEQ ID NO:82-83、SEQ IDNO:84-85或SEQ ID NO:86-87所示的序列;
8)HPV35的引物对:如SEQ ID NO:88-89、SEQ ID NO:90-91、SEQ IDNO:92-93或SEQ ID NO:94-95所示的序列;
9)HPV39的引物对:如SEQ ID NO:96-97、SEQ ID NO:98-99、SEQ IDNO:100-101或SEQ ID NO:102-103所示的序列;
10)HPV40的引物对:如SEQ ID NO:104-105、SEQ ID NO:106-107、SEQ ID NO:108-109或SEQ ID NO:110-111所示的序列;
11)HPV42的引物对:如SEQ ID NO:112-113、SEQ ID NO:114-115、SEQID NO:116-117或SEQ ID NO:118-119所示的序列;
12)HPV43的引物对:如SEQ ID NO:120-121、SEQ ID NO:122-123、SEQ ID NO:124-125或SEQ ID NO:126-127所示的序列;
13)HPV44的引物对:如SEQ ID NO:128-129、SEQ ID NO:130-131、SEQ ID NO:132-133或SEQ ID NO:134-135所示的序列;
14)HPV45的引物对:如SEQ ID NO:136-137、SEQ ID NO:138-139、SEQ ID NO:140-141或SEQ ID NO:142-143所示的序列;
15)HPV51的引物对:如SEQ ID NO:144-145或SEQ ID NO:146-147所示的序列;
16)HPV52的引物对:如SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:150-151、SEQ ID NO:152-153或SEQ ID NO:154-155所示的序列;
17)HPV53的引物对:如SEQ ID NO:156-157、SEQ ID NO:158-159、SEQ ID NO:160-161或SEQ ID NO:162-163所示的序列;
18)HPV54的引物对:如SEQ ID NO:164-165、SEQ ID NO:166-167、SEQ ID NO:168-169或SEQ ID NO:170-171所示的序列;
19)HPV55的引物对:如SEQ ID NO:172-173、SEQ ID NO:174-175、SEQ ID NO:176-177或SEQ ID NO:178-179所示的序列;
20)HPV56的引物对:如SEQ ID NO:180-181、SEQ ID NO:182-183、SEQ ID NO:184-185或SEQ ID NO:186-187所示的序列;
21)HPV58的引物对:如SEQ ID NO:188-189、SEQ ID NO:190-191、SEQ ID NO:192-193或SEQ ID NO:194-195所示的序列;
22)HPV59的引物对:如SEQ ID NO:196-197、SEQ ID NO:198-199、SEQ ID NO:200-201或SEQ ID NO:202-203所示的序列;
23)HPV61的引物对:如SEQ ID NO:204-205、SEQ ID NO:206-207、SEQ ID NO:208-209或SEQ ID NO:210-211所示的序列;
24)HPV66的引物对:如SEQ ID NO:212-213、SEQ ID NO:214-215、SEQ ID NO:216-217或SEQ ID NO:218-219所示的序列;
25)HPV68的引物对:如SEQ ID NO:220-221、SEQ ID NO:222-223、SEQ ID NO:224-225或SEQ ID NO:226-227所示的序列;
26)HPV70的引物对:如SEQ ID NO:228-229、SEQ ID NO:230-231、SEQ ID NO:232-233或SEQ ID NO:234-235所示的序列;
27)HPV72的引物对:如SEQ ID NO:236-237、SEQ ID NO:238-239、SEQ ID NO:240-241或SEQ ID NO:242-243所示的序列;
28)HPV73的引物对:如SEQ ID NO:244-245、SEQ ID NO:246-247、SEQ ID NO:248-249或SEQ ID NO:250-251所示的序列;
29)HPV81的引物对:如SEQ ID NO:252-253、SEQ ID NO:254-255、SEQ ID NO:256-257或SEQ ID NO:258-259所示的序列;
30)HPV82的引物对:如SEQ ID NO:260-261、SEQ ID NO:262-263、SEQ ID NO:264-265或SEQ ID NO:266-267所示的序列;以及
31)HPV83的引物对:如SEQ ID NO:268-269、SEQ ID NO:270-271、SEQ ID NO:272-273或SEQ ID NO:274-275所示的序列。
优选地,所述的引物,其包括能特异性扩增出前述DNA片段组合中至少分别源自HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59和HPV68的DNA序列的引物对。
优选地,所述的引物,其包括能特异性扩增出前述DNA片段组合中至少分别源自HPV 6、HPV 11、HPV 26、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV44、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 61、HPV 66、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV83的DNA序列的引物对。
优选地,所述的引物,其包括能特异性扩增出前述DNA片段组合中分别源自HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV83的DNA序列的全部31种引物对。
又一方面,本发明还提供了将前述的混合引物在制备用于检测和/或分型人乳头瘤病毒的产品中的应用。
优选地,所述的引物用于检测和/或分型人乳头瘤病毒的试剂盒。优选地,该试剂盒还包括细胞裂解液、核酸结合缓冲液、核酸洗涤液和PCR反应液。
再一方面,本发明还提供了一种在体外对HPV进行分型的方法,其包括以下步骤:1)提取样本DNA;2)使用前述的引物进行多重PCR反应;3)检测反应产物,其中步骤1)所述的样本,包括人或其他生物的体液或组织样本。
综上所述,本发明选取31种常见类型的HPV稳定存在的DNA片段,针对各DNA片段设计出多对特异性引物,选取两种或两种以上DNA片段的引物混合后组成的混合引物,能一次检测出样本中所含有的HPV,甚至是全部31种HPV。可见,本发明提供的用于检测和/或分型人乳头瘤病毒DNA的31种HPV DNA片段,其应用包括由针对该31种DNA片段而分别设计出的两种或多种特异性引物混合而成的混合引物,由两种或多种混合引物制成的试剂盒等工具,都具有检测和/或分型HPV DNA的用途。本发明具有以下有益效果:
(1)本发明基于聚合酶链反应PCR法,具有该方法简单、易行、技术成熟、结果稳定且成本低的优点;
(2)已有的分析方法只能检测13种以内的重型HPV感染,对于13种重型感染意外的HPV病毒感染均认为是阴性,而本发明不但可以实现对31种HPV感染均一一分型,还能纠正以往的分析方法中假阴性的误断,将混合感染患者所感染的各型HPV病毒一一检测出,更准确的对HPV病毒感染作出体外检测和分型;
(3)本发明能一次同时检测31种不同类型HPV DNA,大大提高了HPV的检测效率,克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染产生漏检的缺陷,实现对有关HPV疾病的早期诊断,适用于临床检测HPV基因及分型,以指导宫颈癌的防治;
(4)本发明所采用的方法属于一个HPV分型的基础研究,也可将此技术用于其他分型的检测。不仅为进一步研究HPV的分型提供了有力的基础技术支持,还对其他病毒的分型检测提供了借鉴。
附图说明
图1为使用MEGA4.0软件制作的本发明31种HPV病毒的进化树模型。
图2A至图2E为用31对单引物分别扩增HPV DNA片段的电泳图。
图3A至图3E为用含31对引物的混合引物扩增HPV DNA片段的电泳图。
图4A至图4E为用31对单引物分别扩增HPV DNA片段作为对照,验证含31对引物的混合引物扩增HPV DNA片段的电泳图,其中A1~A7、B1~B6、C1~C7、D1~D7、E1~E4为混合引物扩增,A1’~A7’、B1’~B6’、C1’~C7’、D1’~D7’、E1’~E4’为作为对照的单引物扩增。
图5A至图5D为临床样本验证电泳图,其中图5A为用含31对引物的混合引物扩增临床样本1~3的电泳图;图5B为用31对单引物扩增临床样本1的电泳图;图5C为用31对单引物扩增临床样本2的电泳图;图5D为用31对单引物扩增临床样本3的电泳图。
下表将附图中的代码与其所对应的病毒类型说明如下:
病毒型号    代码      病毒型号     代码
HPV 58    A1、A1’    HPV 43    C4、C4’
HPV 35    A2、A2’    HPV 44    C5、C5’
HPV 33    A3、A3’    HPV 11    C6、C6’
HPV 68    A4、A4’    HPV 40    C7、C7’
HPV 45    A5、A5’    HPV 82    D1、D1’
HPV 31    A6、A6’    HPV 81    D2、D2’
HPV 18    A7、A7’    HPV 83    D3、D3’
HPV 16    B1、B1’    HPV 66    D4、D4’
HPV 39    B2、B2’    HPV 70    D5、D5’
HPV 51    B3、B3’    HPV 61    D6、D6’
HPV 52    B4、B4’    HPV 53    D7、D7’
HPV 56    B5、B5’    HPV 72    E1、E1’
HPV 59    B6、B6’    HPV 54    E2、E2’
HPV 6     C1、C1’    HPV 26    E3、E3’
HPV 73    C2、C2’    HPV 42    E4、E4’
HPV 55    C3、C3’
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明,而不用于限定本发明的范围。
以下实施例中所使用的技术,除非特别说明,均为本领域的技术人员已知的常规技术;所使用的仪器设备、试剂等,除非是本说明书特别说明,均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1:31种HPV基因DNA片段的选择
将GenBank上公布的31种HPV病毒的基因组全部进行基因比较,对比同源性,选择出本发明所提供的31种HPV基因DNA片段。
31种HPV病毒的基因登录号分别如下(见括号内所示):HPV6[X00203]、HPV 11[M14119]、HPV 16[K02718]、HPV 18[X05015]、HPV 26[X74472]、HPV 31[J04353]、HPV 33[M12732]、HPV 35[X74477]、HPV 39[M62849]、HPV 40[X74478]、HPV 42[M73236]、HPV 43[AJ620205]、HPV 44[U31788]、HPV 45[X74479]、HPV 51[M62877]、HPV 52[X74481]、HPV 53[X74482]、HPV 54[U37488]、HPV 55[U31791]、HPV 56[X74483]、HPV 58[D90400]、HPV 59[X77858]、HPV 61[U31793]、HPV 66[U31794]、HPV 68[X67161]、HPV 70[U21941]、HPV 72[X94164]、HPV 73[X94165]、HPV 81[AJ620209]、HPV 82[AB027021]和HPV 83[AF151983]。
根据同源性比较结果,使用MEGA4.0软件制作出各亚型HPV病毒的进化树模型,如图1所示,其原理是通过各个HPV亚型之间的基因比较,推导得出各亚型之间的进化距离,构建一个进化距离矩阵,基于该矩阵中的进化距离关系构建出进化树模型。
最终选择出本发明的31种HPV基因DNA片段序列,为SEQ ID NO:1-31所示的DNA序列,其分别来源自HPV6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83。其中,所选取31种不同分型的HPV DNA片段同源性最低,大小不同,以便电泳区分检测结果。
实施例2:设计出31种HPV基因DNA片段多对不同的引物
设计引物之前,分析待测靶序列的性质,选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。寡核苷酸引物长度为15~30bp。引物的Tm值一般控制在55~60℃,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2℃。有效引物中(G+C)的比例一般为40~60%。
本发明用primer软件进行设计,并根据每个引物的得分多少进行挑选。每个片段选择了10对得分最高的引物进行试验,扩增不出目的条带的引物被删除,重新进行选择。
根据上述方法所设计出的实施例1所述全部31种人乳头瘤病毒DNA片段的特异性引物如下,括号内为被扩增序列起止位点:
1)HPV6的引物对:如SEQ ID NO:32-33(278-403)、SEQ ID NO:34-35(7-108)、SEQ ID NO:36-37(278-592)或SEQ ID NO:38-39(836-950)所示的序列;
2)HPV11的引物对:如SEQ ID NO:40-41(114-454)、SEQ ID NO:42-43(354-751)、SEQ ID NO:44-45(8-347)或SEQ ID NO:46-47(453-834)所示的序列;
3)HPV16的引物对:如SEQ ID NO:48-49(38-434)、SEQ ID NO:50-51*(117-505)、SEQ ID NO:52-53(120-553)或SEQ ID NO:54-55(232-647)所示的序列;
4)HPV18的引物对:如SEQ ID NO:56-57(39-243)、SEQ ID NO:58-59(252-457)、SEQ ID NO:60-61(439-642)或SEQ ID NO:62-63(405-694)所示的序列;
5)HPV26的引物对:如SEQ ID NO:64-65(65-265)、SEQ ID NO:66-67(417-616)、SEQ ID NO:68-69(705-905)或SEQ ID NO:70-71(1228-1427)所示的序列;
6)HPV31的引物对:如SEQ ID NO:72-73(24-382)、SEQ ID NO:74-75(40-306)、SEQ ID NO:76-77(127-366)或SEQ ID NO:78-79(351-690)所示的序列;
7)HPV33的引物对:如SEQ ID NO:80-81(28-219)、SEQ ID NO:82-83(129-337)、SEQ ID NO:84-85(317-512)或SEQ ID NO:86-87(339-525)所示的序列;
8)HPV35的引物对:如SEQ ID NO:88-89(28-302)、SEQ ID NO:90-91(53-321)、SEQ ID NO:92-93(46-699)或SEQ ID NO:94-95(1294-1460)所示的序列;
9)HPV39的引物对:如SEQ ID NO:96-97(4-439)、SEQ ID NO:98-99(34-461)、SEQ ID NO:100-101(145-582)或SEQ ID NO:102-103(554-887)所示的序列;
10)HPV40的引物对:如SEQ ID NO:104-105(10-595)、SEQ ID NO:106-107(22-613)、SEQ ID NO:108-109(137-733)或SEQ ID NO:110-111(440-1044)所示的序列;
11)HPV42的引物对:如SEQ ID NO:112-113(15-267)、SEQ ID NO:114-115(23-273)、SEQ ID NO:116-117(127-371)或SEQ ID NO:118-119(243-495)所示的序列;
12)HPV43的引物对:如SEQ ID NO:120-121(44-271)、SEQ ID NO:122-123(125-360)、SEQ ID NO:124-125(102-335)或SEQ ID NO:126-127(458-687)所示的序列;
13)HPV44的引物对:如SEQ ID NO:128-129(1-288)、SEQ ID NO:130-131(54-339)、SEQ ID NO:132-133(133-420)或SEQ ID NO:134-135(341-636)所示的序列;
14)HPV45的引物对:如SEQ ID NO:136-137(135-363)、SEQ ID NO:138-139(440-686)、SEQ ID NO:140-141(613-819)或SEQ ID NO:142-143(794-1130)所示的序列;
15)HPV51的引物对:如SEQ ID NO:144-145(10-335)或SEQ ID NO:146-147(19-344)所示的序列;
16)HPV52的引物对:如SEQ ID NO:148-149(37-221)、SEQ ID NO:150-151(64-254)、SEQ ID NO:152-153(209-390)或SEQ ID NO:154-155(608-795)所示的序列;
17)HPV53的引物对:如SEQ ID NO:156-157(37-221)、SEQ ID NO:158-159(65-242)、SEQ ID NO:160-161(328-498)或SEQ ID NO:162-163(742-938)所示的序列;
18)HPV54的引物对:如SEQ ID NO:164-165(82-262)、SEQ ID NO:166-167(259-452)、SEQ ID NO:168-169(534-711)或SEQ ID NO:170-171(563-753)所示的序列;
19)HPV55的引物对:如SEQ ID NO:172-173(1-193)、SEQ ID NO:174-175(50-242)、SEQ ID NO:176-177(146-341)或SEQ ID NO:178-179(450-634)所示的序列;
20)HPV56的引物对:如SEQ ID NO:180-181(19-188)、SEQ ID NO:182-183(58-227)、SEQ ID NO:184-185(79-249)或SEQ ID NO:186-187(180-300)所示的序列;
21)HPV58的引物对:如SEQ ID NO:188-189(36-140)、SEQ ID NO:190-191(97-203)、SEQ ID NO:192-193(108-212)或SEQ ID NO:194-195(651-756)所示的序列;
22)HPV59的引物对:如SEQ ID NO:196-197(1-114)、SEQ ID NO:198-199(34-148)、SEQ ID NO:200-201(25-134)或SEQ ID NO:202-203(248-357)所示的序列;
23)HPV61的引物对:如SEQ ID NO:204-205(20-471)、SEQ ID NO:206-207(42-512)、SEQ ID NO:208-209(62-538)或SEQ ID NO:210-211(243-700)所示的序列;
24)HPV66的引物对:如SEQ ID NO:212-213(11-242)、SEQ ID NO:214-215(48-281)、SEQ ID NO:216-217(200-443)或SEQ ID NO:218-219(223-467)所示的序列;
25)HPV68的引物对:如SEQ ID NO:220-221(12-141)、SEQ ID NO:222-223(34-163)、SEQ ID NO:224-225(193-310)或SEQ ID NO:226-227(1298-1427)所示的序列;
26)HPV70的引物对:如SEQ ID NO:228-229(8-258)、SEQ ID NO:230-231(18-269)、SEQ ID NO:232-233(215-465)或SEQ ID NO:234-235(398-649)所示的序列;
27)HPV72的引物对:如SEQ ID NO:236-237(14-142)、SEQ ID NO:238-239(39-177)、SEQ ID NO:240-241(120-261)或SEQ ID NO:242-243(254-383)所示的序列;
28)HPV73的引物对:如SEQ ID NO:244-245(24-199)、SEQ ID NO:246-247(33-207)、SEQ ID NO:248-249(104-277)或SEQ ID NO:250-251(323-502)所示的序列;
29)HPV81的引物对:如SEQ ID NO:252-253(14-130)、SEQ ID NO:254-255(115-229)、SEQ ID NO:256-257(147-261)或SEQ ID NO:258-259(203-322)所示的序列;
30)HPV82的引物对:如SEQ ID NO:260-261(1-102)、SEQ ID NO:262-263(19-121)、SEQ ID NO:264-265(103-205)或SEQ ID NO:266-267(379-480)所示的序列;以及
31)HPV83的引物对:如SEQ ID NO:268-269(17-306)、SEQ ID NO:270-271(55-344)、SEQ ID NO:272-273(84-269)或SEQ ID NO:274-275(205-489)所示的序列。
实施例3:用31对单引物分别扩增31个HPV DNA模板
用根据实施例2所设计的31对特异性引物分别对其相应的31个HPVDNA模板单独进行PCR扩增。所用引物对为SEQ ID NO:32-33、SEQ IDNO:40-41、SEQ ID NO:48-49、SEQ ID NO:56-57、SEQ ID NO:64-65、SEQ ID NO:72-73、SEQ ID NO:80-81、SEQ ID NO:88-89、SEQ ID NO:96-97、SEQ ID NO:104-105、SEQ ID NO:112-113、SEQ ID NO:120-121、SEQ ID NO:128-129、SEQ ID NO:136-137、SEQ ID NO:144-145、SEQID NO:148-149、SEQ ID NO:156-157、SEQ ID NO:164-165、SEQ ID NO:172-173、SEQ ID NO:180-181、SEQ ID NO:188-189、SEQ ID NO:196-197、SEQ ID NO:204-205、SEQ ID NO:212-213、SEQ ID NO:220-221、SEQID NO:228-229、SEQ ID NO:236-237、SEQ ID NO:244-245、SEQ ID NO:252-253、SEQ ID NO:262-261和SEQ ID NO:268-269。
1)单引物PCR扩增:
a)在200μL Eppendorf管内配制25μL反应体系:
Figure B2009101323589D0000091
其中的2×buffer包括MgCl2 5mmol/L、Tris-HCl(pH 8.8,25℃)20mmol/L、KCl 30mmol/L、(NH4)2SO4 20mmol/L、dNTP 20mM、Taq DNA多聚酶0.08U/μL。
b)PCR条件:
第一阶段94℃,2分钟;
第二阶段94℃,20秒;60℃,30秒;72℃,45秒;共30个循环;
第三阶段72℃,2分钟。
2)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的正确性:
a)制备2%的琼脂糖凝胶
将0.8g琼脂糖中加入1×TAE 40mL,煮沸使其溶解后,冷却至50℃,加入染料0.5μL,混匀后倒胶。
b)电泳
设置:电压150V,时间20min;
点样:10μL样品+1μL 6×loading buffer(上海生工),marker1(上海生工,片段大小为分别为:100、200、300、400、500、600、700bp)4μL;电泳结束后在紫外仪下观察结果,如图2A至图2E所示,为用31对单引物分别扩增HPV DNA模板的电泳图,表明使用所设计的引物均能扩增出HPV DNA片段。
实施例4:用混合引物分别扩增31个HPV DNA模板
单引物验证结果正确后,将实施例3所使用的31对引物以1∶1的比例混合(单引物的终浓度稀释了3倍)形成混合引物,用于本实施例中。
1)混合引物PCR扩增
a)在200μL Eppendorf管内配制25μL反应体系:
其中的2×buffer包括MgCl2 5mmol/L、Tris-HCl(pH 8.8,25℃)20mmol/L、KCl 30mmol/L、(NH4)2SO4 20mmol/L、dNTP 20mM、Taq DNA多聚酶0.08U/μL。
b)PCR条件:
第一阶段94℃,2分钟;
第二阶段94℃,20秒;60℃,30秒;72℃,45秒;共30个循环;
第三阶段72℃,2分钟。
2)聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶(PAGE)电泳检测PCR产物的正确性
a)制备5%的PAGE凝胶
Figure B2009101323589D0000102
b)电泳
用混合引物PCR扩增的片段大小、亮度必须与单独引物扩增的结果一致且没有杂带。
设置:电压100V,时间30min;
点样:10μL样品+1μL 6×loading buffer(上海生工),marker1(上海生工,片段大小为分别为:100、200、300、400、500、600、700bp)4μL;洗胶
蒸馏水洗→10%乙醇洗→1%HNO3洗→蒸馏水洗→0.2%AgNO3于脱色摇床上脱色30min→双蒸水10s/次洗2次→3%Na2CO3+0.15%甲醛于脱色摇床上显色5min→蒸馏水洗→3%乙酸10min停止显色。
电泳结束后在紫外仪下观察结果,如图3A至图3E所示,为用含31对引物的混合引物扩增HPV DNA片段的电泳图。从图中可以看出,使用所设计的混合引物能扩增出对应的HPV DNA片段。
实施例5:用混合引物分别扩增31个HPV DNA模板,以单引物扩增的31个PCR产物做为对照品进行电泳验证
将实施例3中单引物扩增的31个PCR产物做为对照品(可用凝胶纯化试剂盒回收并浓缩),验证用混合引物分别扩增31个HPV DNA模板(样品)的准确性。
测序胶电泳验证对照品和样品的操作方法如下:
a)用去污剂溶液清洗玻璃板和间隔条,用自来水彻底冲洗后,再用蒸馏水冲洗,最后用乙醇冲洗板并晾干(必须彻底洗净玻璃板,以确保灌胶时不会产生气泡)。
b)测序板的硅化处理
长板(亲和硅烷):1mL涂满长板,涂匀,5min后用95%乙醇洗3次,去多余的亲和硅烷;
短板(剥离硅烷):更换手套,避免与亲和硅烷交叉污染;1.5mL涂满短板,涂匀,10min后用干净镜头纸檫去多余的剥离硅烷。
c)装板与封边
将板的两侧及底边封严,在灌胶时不至于漏胶。将板的两侧放置好0.4mm的塑料间隔边条,安装固定用夹板,底用透明胶带封好,防止渗漏。
d)测序凝胶的灌制制备(60mL 5%的PAGE胶)
混匀后倒入夹板中,不要留有气泡。测序凝胶的银染染色过程要求凝胶浸在塑料盘中,大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
e)电泳
设置:电压1500V,时间30min;
点样:10μL样品+2μL6×loading buffer(上海生工),marker1(上海生工,片段大小为分别为:100、200、300、400、500、600、700bp)4μL;
电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板,凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
f)洗胶
蒸馏水洗→10%乙醇洗→1%HNO3洗→蒸馏水洗→0.2%AgNO3于脱色摇床上脱色30min→双蒸水10s/次洗2次→3%Na2CO3+0.15%甲醛于脱色摇床上显色5min→蒸馏水洗→3%乙酸10min停止显色。
将混合引物的31个PCR扩增产物和对照品(31个模板DNA)与marker 进行对照,检测混合引物扩增产物的准确性,结果如图4A至图4E所示,表明混合引物能够准确的扩增出对应单引物扩增的HPV DNA片段。
实施例6:多重PCR扩增试剂盒的组成
本发明所提供的试剂盒成分如下:
试剂盒由一个拭子,一个10mL试管,一个200μL PCR管,A、B、C、D四瓶试剂组成,各试剂分别详述如下:
A液:细胞裂解液,52mL,每次用1mL,设计用量50次;
Figure B2009101323589D0000121
B液:核酸结合缓冲液,52mL,每次用1mL,设计用量50次;
Figure B2009101323589D0000122
C液:核酸洗涤液,52mL,每次用1mL,设计用量50次;
Figure B2009101323589D0000123
D液:PCR反应液,0.8mL,每次用13.5uL,设计用量50次。
Figure B2009101323589D0000124
其中的2×buffer包括MgCl2 5mmol/L、Tris-HCl(pH 8.8,25℃)20mmol/L、KCl 30mmol/L、(NH4)2SO4 20mmol/L、dNTP 20mM、Taq DNA多聚酶0.08U/μL。
实施例7:PCR扩增试剂盒的操作步骤
本发明实施例6所提供的多重PCR扩增试剂盒的操作步骤如下:
a)使用拭子刮取适量的待测细胞,加入10mL试管中,试管中已加入了5mL细胞洗涤液和5ml生理盐水,轻轻转动拭子,将待测细胞洗下;
b)低速离心后细胞沉入管底,抽出上清,加入A液,室温条件下作用10分钟,裂解掉待测细胞,释放DNA;
c)加入B液和核酸吸附填料,混合均匀,微微振动,在合适的离子强度下,核酸结合到填料上;
d)加入溶液C洗掉多余的不结合杂质,即成为待检测的细胞样品;
e)将细胞样品1μL溶于10.5μL蒸馏水中,与D液混合后进行PCR扩增反应;
实施例8:对临床样本的验证
使用混合引物对3个临床样本进行PCR扩增,并分别使用31对单引物对这3个临床样本分别进行扩增作为对照,验证混合引物的扩增结果。
使用实施例6所提供的多重PCR扩增试剂盒,分别扩增3个临床样本,具体操作方法如下:
a)样本的制备:用一次性宫颈拭子取病人子宫颈组织表面细胞,溶于10ml生理盐水中,混合均匀后,取1ml于灭菌的1.5ml离心管中,12000r/min离心2min,去上清。
b)裂解:将细胞液低速离心,1000r/min,15min。抽出上清液,加入A液1ml,室温条件下裂解10min。
c)吸附:加入核酸吸附填料和B液1ml,微微振动,混合均匀,使核酸结合到填料上,抽出上清液。
d)冲洗:在吸附填料上加入C液1ml,洗掉多余的不结合杂质,抽出上清液。
e)DNA原位提取:在吸附填料上加入D液1管,溶膜释放DAN。
f)PCR反应:将25μL上清液加入EP管中,进行PCR反应,反应条件为:第一阶段94℃,2分钟;第二阶段94℃,20秒;50℃,30秒;72℃,45秒;共30个循环;第三阶段72℃,2分钟。
参照实施例5所提供的方法对PCR扩增产物进行测序胶电泳验证,结果如图5A至图5D所示。
用混合引物扩增临床样本1、2和3的电泳图,如图5A所示。从图5A可以看出,样本1扩增出一条片段,样本2扩增出两条目标片段,样本3可见三条目标片段,以上扩增出的目标片段,分别表明该临床患者至少感染的HPV病毒分型数。
用31对单引物扩增临床样本1的电泳图,如图5B所示。由图可知,从临床样本1中扩增出E1片段,与混合引物扩增结果相同,表明临床样本1中感染的HPV病毒为HPV26。
用31对单引物扩增临床样本2的电泳图,如图5C所示。由图可知,从临床样本中扩增出D2和D3片段,与混合引物扩增结果相同,表明临床样本2中感染的HPV病毒为HPV81和HPV 83。
用31对单引物扩增临床样本3的电泳图,如图5D所示。由图可知,从临床样本中扩增出E2、E3和E4片段,与混合引物扩增结果相同,表明临床样本3中感染的HPV病毒为HPV54、HPV26和HPV42。
以上结果表明,采用本发明所提供的混合引物及其试剂盒可以有效的扩增出临床样本中的HPV病毒片段并对其进行分型。
序列表
<110>白向阳
宁波基内生物技术有限公司
<120>人乳头瘤病毒DNA片段、特异性引物及其应用
<130>DIC08110160
<160>275
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1503
<212>DNA
<213>HPV6片段
<400>1
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aaggtgtcag gatatcaata cagggtattt aaggtggtgt taccagatcc taacaaattt    240
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taa                                                                  1503
<210>2
<211>1506
<212>DNA
<213>HPV11片段
<400>2
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aagtaa                                                               1506
<210>3
<211>1596
<212>DNA
<213>HPV16片段
<400>3
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cctaaagttt caggtttgca atacagggtg tttaggcttc gtttaccaga tcctaataaa    240
tttggatttc cagatgcatc cttttataat cctgataagg agcgcctagt atgggcctgt    300
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gatatttcta acactacctg taaataccca gattatttag gcatggctgc tgatccctat    720
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agggctggtg ataccggtga taaaatccca gatgacctaa tgattaaagg cacaggcaat    840
actgcaacac catccagttg tgttttttat cctacaccta gtggttccat ggtttcttca    900
gatgcacagt tgtttaataa accttattgg ttgcaaaagg cacagggaca aaataatggt    960
atttgttggc ataatcaatt atttttaact gttgtagata ctactagaag cactaatttt    1020
tctgtatgtg taggtacaca ggctagtagc tctactacaa cgtatgccaa ctctaatttt    1080
aaggaatatt taagacatgc agaagagttt gatttacagt ttgtttttca gttatgtaaa    1140
attagtttaa ctactgaggt aatgacatat atacattcta tgaattctac tatattggaa    1200
gagtggaatt ttggtcttac cccaccaccg tcaggtactt tagaggaaac atatagatat    1260
gtaacatcac aggctattag ttgccaacgt cctcaacctc ctaaagaaac agaggaccca    1320
tatgccaagc tatccttttg ggatgtagat cttaaggaaa agttttctgc agaattagac    1380
cagtttcctt tgggaagaaa atttttatta caacttggta tgcgtgcacg tcctaagtta    1440
caagcttcta aacgttctgc atctgctacc acaagtgcca cacctaagaa aaaacgtgct    1500
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<212>DNA
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tccactattc ccaaggtgtc tgggtatcag taccgggtgt ttcgtgtgaa gctccctgac    240
cctaataagt ttgctttacc tgatggtacc ttatataacc cagacaccga acgcatggta    300
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cacccattat ataatcgctt ggatgataca gaaaacactg cttatttggc tgctgccagt    420
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gcacaaaacg aatgcccccc cttggagttt aaaaatacaa ccattcagga tggggacatg    600
gtggaaactg gctatggggc cattgatttt aaggccctgc aggaaaataa atcggaggtg    660
cccttggata tttgcaatac cacctgtaag tatccagatt atttacaaat ggctgctgag    720
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tttaatagac atggcactat gggcgaggcc ttacctgcag acttatatat gaagggtgct    840
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atggtatcct ctgattccca gctgtttaat aagccttatt ggctacaacg ggcacagggc    960
cataataatg gcatttgttg gtttaatgaa atgtttgtta cagtggtgga tactaccaga    1020
agcaccaatt ttactatttg cacagctaca tctgctgctg cagaatacaa ggcctctaac    1080
tttaaggaat ttctgcgcca tacagaggaa tatgatttgc agtttatttt ccaattatgt    1140
aaaatacagt taacaccaga aattatggcc tacttacata atatgaacaa ggcactgttg    1200
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tttttacagt ctcgggccat tacctgtcaa aagggtgctg ctgcccctgc gcccaaagag    1320
gacccttatg ccgacatgtc attttggaca gttgacctta aggacaagtt gtctactgat    1380
ttagatcagt ttcctttggg tcgcaagttt ttgttgcagt ctgggtcccg cacccggtct    1440
tttgctgtgt cccgtaagcg tcctgcgtct gccaggaccc ccactacctc tgctaagcga    1500
aaacgtaaaa aatag                                                     1515
<210>30
<211>1512
<212>DNA
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attgtcaaca cagaagaata tataacccgc accggcatat attattatgc aggcagttcc    120
agacttatta ccttaggaca tccatatttt tcaataccca aaaccaatac acgtgctgaa    180
atacctaagg tatctgcctt tcagtatagg gtgtttaggg tacagttacc tgaccccaac    240
aaatttggtc ttcctgatcc taatttgttt aatccagaca cagatcgttt ggtgtgggga    300
tgtgttggtg ttgaagtagg taggggtcag ccgttaggtg ttggccttag tggtcatcct    360
ttatttaata agtatgatga tactgaaaac tctaggtttg ccaatggcaa cgaccaacag    420
gatgttaggg acaacatatc tgtggacaac aaacaaactc agttatgcat tataggctgc    480
gctcctccta ttggggaaca ctgggccaca ggtaccacat gtaaaaacgt acctgtacct    540
cagggtgact gtccaccttt ggaacttgtg tctactgtca ttgaggatgg cgatatggtg    600
gacactggtt ttggggccat ggattttgct aatttacaag ctactaaatc agatgttcca    660
ttggatattg ctcagtctgt gtgtaaatac cctgattact taaaaatgtc agcagataca    720
tatggcaatt ctatgttttt tcatttacgc agggagcaaa tatttgctag gcattactat    780
aataaggctg gtgtggttgg tgatgccatt ccagacaagg cttatattaa gggtactggt    840
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acctctgatt ctcagatttt taataagcct tattggttgc atcgcgccca gggccacaat    960
aatggcattt gctggaataa tcagcttttt attacttgtg ttgacactac taaaagtacc    1020
aatttaacca ttagcactgc tgttactcca tctgttgcac aaacatttac tccagcaaac    1080
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gttaaaaaat ag                                                        1512
<210>31
<211>1512
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cctaataagt ttagccttcc tgatacgtcc ctatataatc ctgacacgga acgcatggta    300
tgggcatgcc gcggtataga ggttggtcgt ggtcagcctc ttggcgtggg cactagtggc    360
catcccctat ataatcggct ggatgacact gaaaacacac cattgcttgc tgctgcagac    420
acagataggc gtgacaatgt ctcagtggat tacaaacaaa cgcagcttat tatcattggg    480
tgtaagcccc caatagggga acactgggca aagggtactg tgtgttccgg tgtgtccccg    540
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ccatatggtg attgtatgtt cttttgcctc cgtagggaac aaatgtttgc acgacatttt    780
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gaagaggaag acgaggaagg            20
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ataatccata gaaacatt             18
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atacggatcc ggacttattc c         21
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agctgtgtat tgttggctgt acac      24
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atatttactt ttactattaa c         21
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ttcaggatta tatatagtag            20
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atccatttta taataaattg gatgat       26
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ctgctgatcc ctatggggat tctat         25
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gtagaggcac ataatgttaa att           23
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caagaatggt aggatccatt gtg      23
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cagaggtaat ggcttattta cacac    25
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ataacccaga aacccaaagg
20
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aacttattag gatctggc              18
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cgttgcagcc aatatggctt at        22
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<212>DNA
<213>人工序列
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atatgtgact cgcacaagca tata      24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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ataaactagg atcaggcagt ccaa      24
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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aactcctagt ggctctatgg taa       23
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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catttgttcc cgccttaagt aa        22
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>174
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<212>DNA
<213>人工序列
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gcaaatttat tagggtctgg                20
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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ttgccatacg accagcaaac aaga           24
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<212>DNA
<213>人工序列
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ataccaacac ccaggggctg                20
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<213>人工序列
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aacacaatta tgtttagttg gc             22
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<211>21
<212>DNA
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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cgtaggcgcc gtaaacgtat tcc         23
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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ttcctatgta aaacgcacta gt          22
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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attgggtgtt ggcgtaagtg                 20
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>203
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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tagctgggtc tgcttataat caaca      25
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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ttatgtgcaa cgcaccaact            20
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>207
tgcgctcagt atcaggatta tacaagg    27
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>208
gtgtctaaag ttatcagtac tgacc      25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>209
cggggttagc acaagcagta ccctt      25
<210>210
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>211
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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caggatactt gcatatagtg gtgca      25
<210>212
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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ggcggcctag tgacaataag gtg        23
<210>213
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>213
aaacactcta tactgatatg cacta          25
<210>214
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
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gcatatcagt atagagtgtt tagggtac       28
<210>215
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>215
tcacgggcat catatttagt t              21
<210>216
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>216
atcagtatag agtgtttagg gt             22
<210>217
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>217
tataacatta ttacctgcta aatta          25
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<212>DNA
<213>人工序列
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gtttagggta cggttgcctg atcctaa        27
<210>219
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>219
cagatatatt gtcccggcta tcttc          25
<210>220
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>220
gcgagctagc gacaacatgg tgta           24
<210>221
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>221
atggcctaca gttaataacc tagat       25
<210>222
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>222
tatttgcctc ccccctcagt ggcgaa      26
<210>223
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>223
cataggaacc ttaaaatatg gatgg        25
<210>224
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>224
gtgtctgcat atcaatacag agtg         24
<210>225
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>225
accaacacag gcccatacca tgcgc        25
<210>226
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>226
tggctgcaca aggcacaggg              20
<210>227
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>227
ggtagcggta tgtatctaca aga          23
<210>228
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>228
ctttgtggcg gtctagtgac              20
<210>229
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>229
ggatacccta aataccctat actgata      27
<210>230
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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tagtgacaac acggtgtatt tgccacc     27
<210>231
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>231
gggaaggatc cggaaggcca aactt       25
<210>232
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>232
tatttagggt atccctacct gat         23
<210>233
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>233
tgtgtttgct tatagtccac agaca       25
<210>234
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>234
atttttcctc tgctgttagt acacagga    28
<210>235
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>235
cacttttggt ttcctgcaat gtacg       25
<210>236
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>236
ggcctggtga cggcaaggta ta          22
<210>237
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>237
gatgtcctac agttagtaga cgaga       25
<210>238
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>238
gctgacaatt ctgacagtcg ggaca     25
<210>239
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>239
tccaaactgg tagaaggagg ag        22
<210>240
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>240
tcgtctacta actgtaggac atcctt    26
<210>241
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>241
aggcaaagca aatttattgg gatca     25
<210>242
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>242
ctttgcctga tggcacactt taca      24
<210>243
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>243
tccaagcgat tatacaaggg gtgac     25
<210>244
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>244
gataaggagc gcctagtatg g         21
<210>245
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>245
tctgggtatt tacaggtagt gttaga    26
<210>246
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>246
aggtatacct gccccctgtg tctgt    25
<210>247
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>247
cctgtattgc aaacctgaaa cttta    25
<210>248
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>248
tattattatg caggtagcac acg      23
<210>249
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>249
tatcaggatt ataaaaggat gcatc    25
<210>250
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>250
gacaaccctt aggtataggt act      23
<210>251
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>251
cccaatgttc ccctaaggga ggcct    25
<210>252
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>252
ggcctggtga cggcaaggta tac      23
<210>253
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>253
taagaaggcg ggaactgccc ccata    25
<210>254
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>254
tattggctac aacgggcaca          20
<210>255
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>255
gcagaaattc cttaaagtta gaggc     25
<210>256
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>256
ttgtacatta actattggta cc        22
<210>257
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>257
aggtaaagca aacttattag ggtca     25
<210>258
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>258
ccgggtgttt cgtgtgaagc tccct     25
<210>259
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>259
cctcaatgcc cctgcaagcc catac     25
<210>260
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>260
tatagggtgt ttagggtaca gttac    25
<210>261
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>261
aacatcctgt tggtcgttgc          20
<210>262
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>262
aatgacagca aagtgtattt accac    25
<210>263
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>263
accttgacgg acgtattatt atata      25
<210>264
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>264
tattatgcag gcagttccag acttatt    27
<210>265
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>265
tgactttccg tctatggaat ccata      25
<210>266
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>266
gatactgaaa actctaggtt tgcca      25
<210>267
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>267
cgtcggatat tacgtattga ctcaa      25
<210>268
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>268
ctggtgacgg caagacgtac ttgcc      25
<210>269
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>269
acgggtatgg tacgcaaggc acagt      25
<210>270
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>270
tctaaggtta tcagtacgga ccgtt      25
<210>271
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>271
ggttctccga ctggtgctgg ttgga      25
<210>272
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>272
gtggctccct ggtatcgtcc              20
<210>273
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>273
tgcgggtagt atctacaact gtaacaaa      28
<210>274
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>274
taccaatata gggtgtttcg catta         25
<210>275
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>275
cccgaatgtg ggttactatt attcg          25

Claims (10)

1.一组人乳头瘤病毒DNA片段组合,其特征在于,所述DNA片段组合包括如SEQ ID NO:1-31所示的31种DNA序列,其分别来源自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83。
2.能特异性扩增出权利要求1所述DNA片段组合中的至少一种DNA片段的引物,所述引物包括选自下列的一种或多种引物对:
1)HPV6的引物对:如SEQ ID NO:32-33、SEQ ID NO:34-35、SEQ IDNO:36-37或SEQ ID NO:38-39所示的序列;
2)HPV11的引物对:如SEQ ID NO:40-41、SEQ ID NO:42-43、SEQ IDNO:44-45或SEQ ID NO:46-47所示的序列;
3)HPV16的引物对:如SEQ ID NO:48-49、SEQ ID NO:50-51、SEQ IDNO:52-53或SEQ ID NO:54-55所示的序列;
4)HPV18的引物对:如SEQ ID NO:56-57、SEQ ID NO:58-59、SEQ IDNO:60-61或SEQ ID NO:62-63所示的序列;
5)HPV26的引物对:如SEQ ID NO:64-65、SEQ ID NO:66-67、SEQ IDNO:68-69或SEQ ID NO:70-71所示的序列;
6)HPV31的引物对:如SEQ ID NO:72-73、SEQ ID NO:74-75、SEQ IDNO:76-77或SEQ ID NO:78-79所示的序列;
7)HPV33的引物对:如SEQ ID NO:80-81、SEQ ID NO:82-83、SEQ IDNO:84-85或SEQ ID NO:86-87所示的序列;
8)HPV35的引物对:如SEQ ID NO:88-89、SEQ ID NO:90-91、SEQ IDNO:92-93或SEQ ID NO:94-95所示的序列;
9)HPV39的引物对:如SEQ ID NO:96-97、SEQ ID NO:98-99、SEQ IDNO:100-101或SEQ ID NO:102-103所示的序列;
10)HPV40的引物对:如SEQ ID NO:104-105、SEQ ID NO:106-107、SEQ ID NO:108-109或SEQ ID NO:110-111所示的序列;
11)HPV42的引物对:如SEQ ID NO:112-113、SEQ ID NO:114-115、SEQID NO:116-117或SEQ ID NO:118-119所示的序列;
12)HPV43的引物对:如SEQ ID NO:120-121、SEQ ID NO:122-123、SEQ ID NO:124-125或SEQ ID NO:126-127所示的序列;
13)HPV44的引物对:如SEQ ID NO:128-129、SEQ ID NO:130-131、SEQ ID NO:132-133或SEQ ID NO:134-135所示的序列;
14)HPV45的引物对:如SEQ ID NO:136-137、SEQ ID NO:138-139、SEQ ID NO:140-141或SEQ ID NO:142-143所示的序列;
15)HPV51的引物对:如SEQ ID NO:144-145或SEQ ID NO:146-147所示的序列;
16)HPV52的引物对:如SEQ ID NO:148-149、SEQ ID NO:150-151、SEQ ID NO:152-153或SEQ ID NO:154-155所示的序列;
17)HPV53的引物对:如SEQ ID NO:156-157、SEQ ID NO:158-159、SEQ ID NO:160-161或SEQ ID NO:162-163所示的序列;
18)HPV54的引物对:如SEQ ID NO:164-165、SEQ ID NO:166-167、SEQ ID NO:168-169或SEQ ID NO:170-171所示的序列;
19)HPV55的引物对:如SEQ ID NO:172-173、SEQ ID NO:174-175、SEQ ID NO:176-177或SEQ ID NO:178-179所示的序列;
20)HPV56的引物对:如SEQ ID NO:180-181、SEQ ID NO:182-183、SEQ ID NO:184-185或SEQ ID NO:186-187所示的序列;
21)HPV58的引物对:如SEQ ID NO:188-189、SEQ ID NO:190-191、SEQ ID NO:192-193或SEQ ID NO:194-195所示的序列;
22)HPV59的引物对:如SEQ ID NO:196-197、SEQ ID NO:198-199、SEQ ID NO:200-201或SEQ ID NO:202-203所示的序列;
23)HPV61的引物对:如SEQ ID NO:204-205、SEQ ID NO:206-207、SEQ ID NO:208-209或SEQ ID NO:210-211所示的序列;
24)HPV66的引物对:如SEQ ID NO:212-213、SEQ ID NO:214-215、SEQ ID NO:216-217或SEQ ID NO:218-219所示的序列;
25)HPV68的引物对:如SEQ ID NO:220-221、SEQ ID NO:222-223、SEQ ID NO:224-225或SEQ ID NO:226-227所示的序列;
26)HPV70的引物对:如SEQ ID NO:228-229、SEQ ID NO:230-231、SEQ ID NO:232-233或SEQ ID NO:234-235所示的序列;
27)HPV72的引物对:如SEQ ID NO:236-237、SEQ ID NO:238-239、SEQ ID NO:240-241或SEQ ID NO:242-243所示的序列;
28)HPV73的引物对:如SEQ ID NO:244-245、SEQ ID NO:246-247、SEQ ID NO:248-249或SEQ ID NO:250-251所示的序列;
29)HPV81的引物对:如SEQ ID NO:252-253、SEQ ID NO:254-255、SEQ ID NO:256-257或SEQ ID NO:258-259所示的序列;
30)HPV82的引物对:如SEQ ID NO:260-261、SEQ ID NO:262-263、SEQ ID NO:264-265或SEQ ID NO:266-267所示的序列;以及
31)HPV83的引物对:如SEQ ID NO:268-269、SEQ ID NO:270-271、SEQID NO:272-273或SEQ ID NO:274-275所示的序列。
3.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,其至少包括能特异性扩增出权利要求1所述DNA片段组合中分别来源自HPV 16、HPV 18、HPV31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59和HPV 68的DNA序列的引物对。
4.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,其至少包括能特异性扩增出权利要求1所述DNA片段组合中分别来源自HPV 6、HPV 11、HPV26、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 61、HPV 66、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV83的DNA序列的引物对。
5.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,其包括能特异性扩增出权利要求1所述DNA片段组合中分别来源自HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 55、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81、HPV 82和HPV 83的DNA序列的全部31种引物对。
6.权利要求2至5中任一项所述的引物在制备用于检测和/或分型人乳头瘤病毒的产品中的用途。
7.包括权利要求2至5中任一项所述的引物的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,其还包括细胞裂解液、核酸结合缓冲液、核酸洗涤液和PCR反应液。
9.一种在体外对HPV进行分型的方法,其包括以下步骤:
1)提取样本DNA;
2)使用利要求2至5中任一项所述的引物进行多重PCR反应;
3)检测反应产物。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,其中所述的步骤1)的样本,包括人或其他生物的体液或组织样本。
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