CN103409560A

CN103409560A - 一种广谱、高效、经济的高危人乳头状瘤病毒的pcr检测方法

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Publication number: CN103409560A
Application number: CN2013103623156A
Authority: CN
Inventors: 潘晓静
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2013-11-27

Abstract

本发明公开了一种广谱、高效、经济的高危人乳头状瘤病毒(HPV)的PCR检测方法，包括：(1)设计针对12种高危HPV亚型L1基因的引物，熔点都在60℃，GC％为50％，使得这些引物可以在同一个PCR管中、在相同温度下扩增病毒基因顺序，节省时间和资金；(2)使用三磷酸甘油醛脱脂酶(GAPDH)作为阳性对照，避免假阴性结果；(3)使用含有三磷酸脱氧尿苷(dUTP)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)的防污染热启动PCR系统，避免假阳性结果。本发明在实例的基础上优化PCR反应体系，保证结果的特异性和准确性，并且省时、经济，易于在基层卫生部门开展HPV病毒的高效低成本筛查工作，达到预防宫颈癌的目的。

Description

一种广谱、高效、经济的高危人乳头状瘤病毒的PCR检测方法

技术领域

本发明涉及疾病病原体基因检测技术，尤其涉及12种高危人乳头状瘤病毒的PCR检测技术。

背景技术

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一类能感染人类的乳头状瘤病毒，它的存在与多种皮肤黏膜的良、恶性肿瘤，特别是宫颈癌的发生密切相关。现在已知的HPV的种类有120多种，不同亚型的HPV具有不同的致病危险性。HPV基因的检测和亚型的分析对了解相关疾病、判断预后以及指导治疗具有重要价值。国际癌症研究协会将HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81等12种亚型归为低危型，主要引起湿疣类病变和子宫颈上皮内瘤样改变(CIN I)，大多是一过性的，可以自然痊愈；HPV16、18、31和45亚型具有很强的致癌作用，其次是33、35、39、51、52、56、58、59亚型，这12种亚型归为高危型。持续高危型HPV感染的患者是宫颈癌的高发人群，导致CIN I恶化到CIN II-III和宫颈癌的发生。70％的宫颈癌患者感染了HPV16或18亚型。

全世界每年有49万名妇女患上宫颈癌，有27万人死于该病。在发展中国家，宫颈癌在妇女多发的癌症中是最常见的肿瘤。大部分年轻女性(70％)在感染HPV后1到2年的时间里可以自愈，5％到10％的女性感染期延长，她们是宫颈癌的高发人群。从感染HPV到患上宫颈癌大约需要5到15年的时间，所以有充足的时间阻止宫颈癌的发生。现在在临床上广泛使用子宫颈抹片检查来筛选子宫颈癌前病变。但是，子宫颈抹片检查只能筛查出宫颈癌个体，不能筛查出感染上HPV的个体。所以定时检测HPV感染情况对预防宫颈癌的发生有至关重要的作用。

目前，检测HPV DNA的方法主要有以下几种：杂交捕获(HC2)、PCR检测结合杂交检测法、ELISA检测法和实时荧光PCR检测法。杂交捕获检测法的代表产品是QIAGEN公司的高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒。此种方法是在裂解宫颈脱落细胞后与在96孔板上的HPV亚型特有的DNA顺序结合，冲洗后收集信号。这种方法不仅非常昂贵，而且假阳性和假阴性的几率比较高。

PCR检测结合杂交检测法的灵敏度和特异性均高于传统的杂交捕获检测法，并且可用特异性的探针对HPV分型。已有的商业化检测产品有PCR-反向点杂交法和HPV病毒核酸扩增分型检测试剂盒。这些试剂盒在检测的同时进行分型。这种方法的缺点是对于HPV阴性的患者无疑是过度检测，造成了资源的浪费。

以ELISA技术检测HPV方法如罗氏(Roche)公司的AMPLICOR PCR-ELISA试剂盒因为稳定性的问题，一直没有得到广泛使用。

实时荧光PCR检测法是在PCR运行的同时检测探针发射的荧光强度的改变，从而达到检测的同时分型的目的。这种检测法精确度高，能定量测量HPV感染的程度。但是实时荧光PCR机非常昂贵，不容易得到普及。

有鉴于此，需要一种更加便利、高效、经济的HPV检测方法。

发明内容

本发明提供了一种特异性检测样本中是否存在HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59亚型的方法，所述方法包括：

1)如SEQ ID NO：1和2所示的用于扩增HPV16亚型的引物；

2)如SEQ ID NO：3和4所示的用于扩增HPV18亚型的引物；

3)如SEQ ID NO：5和6所示的用于扩增HPV31亚型的引物；

4)如SEQ ID NO：7和8所示的用于扩增HPV33亚型的引物；

5)如SEQ ID NO：9和10所示的用于扩增HPV35亚型的引物；

6)如SEQ ID NO：11和12所示的用于扩增HPV39亚型的引物；

7)如SEQ ID NO：13和14所示的用于扩增HPV45亚型的引物；

8)如SEQ ID NO：15和16所示的用于扩增HPV51亚型的引物；

9)如SEQ ID NO：17和18所示的用于扩增HPV52亚型的引物；

10)如SEQ ID NO：19和20所示的用于扩增HPV56亚型的引物；

11)如SEQ ID NO：21和22所示的用于扩增HPV58亚型的引物；

12)如SEQ ID NO：23和24所示的用于扩增HPV59亚型的引物；

以上所有引物熔点温度是60℃，GC比例是50％，使得这些引物可以在相同的温度下扩增HPV DNA，以上所有引物可以放入同一个PCR管中工作，节省成本。而且，PCR产物的大小都在200bp左右，阳性结果明显，非常容易观察，人为失误少。

在优选的实施方式中，本发明的方法中还包含如SEQ ID NO：23和24所示的用于扩增三磷酸甘油醛脱脂酶即GAPDH的引物，GAPDH PCR产物有450bp，作为阳性对照，避免假阴性结果的出现。

在优选的实施方式中，所述样本为宫颈脱落细胞、液基细胞学标本或组织石蜡切片。

在优选的实施方式中，所述PCR体系中使用三磷酸脱氧尿苷(dUTP)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)的防污染系统，以避免假阳性结果的出现。

在优选的实施方式中，所述PCR的扩增条件为：95℃，9min；95℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，循环40次；72℃，10min；4℃，30min。

在优选的实施方式中，所述PCR扩增的各步变温速率为1℃/s。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行进一步说明。

图1显示特异性HPV引物设计图。

图2显示三个实例为HPV阳性和一个实例为HPV阴性结果。

图3显示一个实例HPV阳性和GAPDH正常，另一个实例GAPDH正常和HPV阴性。

具体实施方式

本发明利用同一标准设计的引物达到在一个PCR管中鉴定12种高危型HPV病毒的目的，GAPDH作为阳性反应对照，以辨别检测结果。

实施例

本发明提供一种检测高危型HPV的方法，所述方法主要包括以下步骤：(1)提取样品的DNA；(2)使用SEQ ID NO：1-26的引物对所提取的DNA进行PCR扩增；(3)跑4％琼脂糖胶鉴定检测结果。

(1)样本采集和保存

以无菌棉试纸或宫颈刷取患者的宫颈脱落细胞，置于生理盐水中，置于-20℃冰箱中保存。

(2)提取DNA

12000RPM离心含有宫颈脱落细胞的离心管，5分钟后，去上清，沉淀用QIAGEN公司的样本DNA提取试剂盒进行DNA的提取。

(3)PCR反应

每个PCR反应体系的总体积是50μl，反应体系如下表1所示。

表1.PCR反应体系

解冻PCR反应液各组分，短暂离心混匀，按上表在冰浴上配制反应体系，充分混匀后将PCR管置入PCR仪中，按如下设置运行PCR程序：

(4)跑胶

配制4％琼脂糖胶，称4g琼脂糖粉末，置入100ml的TAE buffer中，用微波炉加热将琼脂糖融化后置于桌上，待温度降到65度左右时加入1μl溴化乙锭(10mg/ml)混匀，注入胶模中，放上梳子，待冷却后将琼脂糖胶取出置入跑胶仪中。

从PCR反应液中取出20μl液体，加入1μl loading buffer，混匀后加入4％琼脂糖胶梳孔中，100V/cm的速度跑胶，在紫外线灯下观察结果。

(5)结果判定

图2显示4个实例中，有三个HPV阳性，一个HPV阴性，HPV阳性产物的大小在200bp左右。

图3显示2个实例的GAPDH阳性对照工作良好，PCR产物大小在450bp，说明样本DNA提取成功；一个实例HPV阳性，PCR产物在200bp左右，另一个实例HPV阴性，无产物。

本发明结合实例和实验数据进行描述，但应该理解的是，本领域技术人员在公开的实施例的基础上可对本发明进行各种修改或等同替换，而不违背本发明的精神，这些修改和等同替换也被视为本发明的范围之内。

Claims

1.一种广谱、高效、经济的高危人乳头状瘤病毒的PCR检测方法，其特征在于，同时检测已知的12种高危人乳头状瘤病毒，16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，所述方法包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括：

1)特异性扩增人乳头状瘤病毒16亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：1所示；

2)特异性扩增人乳头状瘤病毒16亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：2所示；

3)特异性扩增人乳头状瘤病毒18亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：3所示；

4)特异性扩增人乳头状瘤病毒18亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：4所示；

5)特异性扩增人乳头状瘤病毒31亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：5所示；

6)特异性扩增人乳头状瘤病毒31亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：6所示；

7)特异性扩增人乳头状瘤病毒33亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：7所示；

8)特异性扩增人乳头状瘤病毒33亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：8所示；

9)特异性扩增人乳头状瘤病毒35亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：9所示；

10)特异性扩增人乳头状瘤病毒35亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：10所示；

11)特异性扩增人乳头状瘤病毒39亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：11所示；

12)特异性扩增人乳头状瘤病毒39亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：12所示；

13)特异性扩增人乳头状瘤病毒45亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：13所示；

14)特异性扩增人乳头状瘤病毒45亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：14所示；

15)特异性扩增人乳头状瘤病毒51亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：15所示；

16)特异性扩增人乳头状瘤病毒51亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：16所示；

17)特异性扩增人乳头状瘤病毒52亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：17所示；

18)特异性扩增人乳头状瘤病毒52亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：18所示；

19)特异性扩增人乳头状瘤病毒56亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：19所示；

20)特异性扩增人乳头状瘤病毒56亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：20所示；

21)特异性扩增人乳头状瘤病毒58亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：21所示；

22)特异性扩增人乳头状瘤病毒58亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：22所示；

23)特异性扩增人乳头状瘤病毒59亚型的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：23所示；

24)特异性扩增人乳头状瘤病毒59亚型的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：24所示；

25)阳性对照三磷酸甘油醛脱脂酶即GAPDH的上游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：25所示；

26)阳性对照三磷酸甘油醛脱脂酶即GAPDH的下游引物，其碱基顺序如SEQ ID NO：26所示；所述引物熔点温度是60度，GC比例是50％。

2.根据权利要求1所述的高危人乳头状瘤病毒的PCR方法，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括纯水、10×PCR buffer、25mM MgCl₂、2.5mM dATP、2.5mM dGTP、2.5mM dCTP、7.5mM dUTP、Taq酶。

3.根据权利要求1所述的高危人乳头状瘤病毒的PCR方法，其特征在于，所述SEQ ID NO：1-24的上游引物的浓度为1nM，所述SEQ ID NO：1-24的下游引物的浓度为1nM，所述SEQ ID NO：23、24的上、下游引物的浓度为100pM。