CN102154524B - 12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒，包括：(1)具有仅与12种高危型HPV的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：1～12的探针及SEQ ID No：13～36的引物；(2)与高危型HPV16的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：37的探针及SEQ ID No：38～39的引物；(3)与高危型HPV18的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：40的探针及SEQ ID No：41～42的引物；(4)与细胞内β-globin基因的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：43的探针及SEQ ID No：44～45的引物；其中，上述每组探针分别标记最大发射波长518nm、538～553nm、574～575、607～615、640、666～667、690染料的其中一种并且不同。本发明的试剂盒可以最大限度减轻我国HPV基因检测所带来的巨额费用，同时保护人民的身体健康。
Description
技术领域
本发明涉及基因领域，具体是一种12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒。
背景技术
人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)自20世纪70年代末到20世纪80年代初发现与宫颈癌相关以来，一直受人们的关注。大量的研究结果表明：HPV在宫颈细胞异常以及宫颈癌的病理学上具有最为重要的作用。目前，100多种HPV基因型已被鉴定，其中约40种与生殖道感染相关。高危型主要与宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)II、III级和宫颈癌的发生相关。低危型一般与恶性病变无关，主要引起尖锐湿疣和低级别CIN(CINI)。
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，在女性恶性肿瘤中居第二位。据统计，世界范围内每年大约有46.6万左右的宫颈癌新发病例，其中80％的病例发生在发展中国家。上世纪50年代，我国就开始积极开展宫颈癌的防治工作，使得宫颈癌的死亡率由上世纪70年代的10.28/10万下降到了上世纪90年代的3.25/10万。尽管在过去的20年间，我国宫颈癌的死亡率大幅下降，但是每年仍然有新发病例13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的28.2％。特别是中西部的部分地区，宫颈癌的死亡率与发病率几十年却始终居高不下，如甘肃武都、山西阳城等县，宫颈癌死亡率高达36.00/10万，超过全国宫颈癌死亡率的10倍，远高于世界平均水平8.00/10万。造成这种现象的原因除与当地的经济水平等因素有关外，同时与宫颈癌的筛查有关，目前临床上常用的宫颈细胞学检查方法主要有两种：巴氏涂片法(即宫颈刮片)和液基薄层细胞学检查法(TCT)，由于主观因素的影响，这两种方法的假阴性较高，容易造成漏诊。因此，采用合理、廉价的筛查方法，对提早预防、诊断和治疗宫颈癌有非常重要的意义。
早在1977年，Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中有人乳头状瘤病毒(HPV)颗粒的存在，以及Zur Hausen提出HPV病毒与宫颈癌发病相关联的假设后，国内外学者进行了大量的研究，并在1995年的IARC专题讨论会上通过HPV感染是宫颈癌的主要原因，即HPV感染是宫颈癌发生的必要条件。临床证明95-99.7％的宫颈癌病例和高危型HPV病毒感染有关。在过去10年的研究中，通过DNA检测技术已持续发现90％以上的宫颈癌病人都有HPV感染。至今发现的HPV病毒约有100多种，但并非所有的病毒都会引起宫颈癌，根据HPV感染人体后可致宫颈癌的相关性，分为低危型HPV以及高危型HPV，低危型HPV可导致生殖器尖锐湿疣，影响生活质量；高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度宫颈上皮内瘤，其已明确的病毒亚型主要有HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59型和HPV68型等。来自世界范围的宫颈癌组织标本的研究发现，HPV16和HPV18型感染率最高，在检出的所有型别中，HPV16占50％，HPV18占14％，HPV45占8％，HPV31占5％，其他型别的HPV占23％。HPV16、18型感染很普遍，没有明显的地区差异。但是有些HPV型别的感染有地区差异，如HPV45型在非洲西部很常见，而HPV39和59型仅在美洲的中部和南部出现，HPV52，58则在中国妇女中检出率较高。HPV的型别还与宫颈癌的病理类型有关，在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16为主(占51％)，而在宫颈腺癌和宫颈腺鳞细胞癌中HPV18分别占56％和39％。
高危型HPV导致癌症的机会较高，在99.8％的宫颈癌患者中发现HPV的感染，现已知至少有13种高危型HPV与95％的早期浸润和浸润性子宫颈癌有关。HPV感染使得宫颈癌的相对危险性增加250倍，因此提早诊断HPV感染，防止其向宫颈癌演变有着非常重要的意义。
世界卫生组织明确提出13种HPV高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)应该单独或联同细胞学应用于宫颈癌筛查。美国国立综合癌症网络(NCCN)宫颈癌筛查实践指南及美国阴道镜检查与子宫颈病理学会(ASCCP)另外指出，检测13种高危型HPV时，HPV16和HPV18必须特别重视。它们明确指出即使宫颈细胞学无异常而HPV阳性的30岁以上女性，如其为HPV16、HPV18感染者，应立即进行阴道镜检查。因此，HPV分型检测，特别是HPV16、HPV18的分型检测比13种高危型综合笼统归类检测更具临床指导意义。
现有产品HPV核酸扩增分型检测试剂盒，如凯普人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒，广泛应用于宫颈疾病的诊治全过程，临床中发挥重要作用，降低宫颈病变漏诊和避免过度诊断治疗，目前已成为宫颈疾病后续的随访指标。但是，如果用于大规模人群筛查即嫌成本较高，且操作要求严格复杂而费事。
至于美国HC2捕获杂交法13种高危型检测试剂盒及国内“13种高危型HPV核酸扩增荧光检测试剂盒”具有操作简单，自动化程度高的优点，但都无法区分具体HPV型，无法鉴定HPV16和HPV18。所以，无论作为临床还是筛查，也存在较明显的缺陷与不足。
为此，如果在荧光PCR(Real-Time PCR)核酸检测技术平台，开发一种能同一反应管就可以将高危型HPV检测又能将HPV16、HPV18分型的高效产品，既满足筛查要求又更好提供临床指导。另外，根据学术界最新的共识，认为HPV66也是高危型，虽然在宫颈癌病人中感染比例较低。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒，包括：
(1)具有仅与12种高危型HPV(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：1～12的探针及SEQ ID No：13～36的引物；
(2)与高危型HPV16的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：37的探针及SEQ ID No：38～39的引物；
(3)与高危型HPV18的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：40的探针及SEQ ID No：41～42的引物；
(4)与细胞内β-globin基因的DNA互补的核甘酸序列的SEQ IDNo：43的探针及SEQ ID No：44～45的引物；
其中，上述每组探针分别标记最大发射波长518nm、538～553nm、574～575、607～615、640、666～667、690染料的其中一种并且不同。
具体探针和引物的核苷酸排列顺序如下：
| 序列号 | 名称 | 序列(5′-3′) |
| SEQ ID NO 1 | HPV31 probe | CTGTCTGTCT GTCA |
| SEQ ID NO 2 | HPV33 probe | TGACATACAG ACAGACA |
| SEQ ID NO 3 | HPV35 probe | TCTACATCTG ACTGC |
| SEQ ID NO 4 | HPV39 probe | CACTGCTGTC TGTAT |
| SEQ ID NO 5 | HPV45 probe | CATAGACAGA CTGC |
| SEQ ID NO 6 | HPV51 probe | ACACAGCCAT AGTC |
| SEQ ID NO 7 | HPV52 probe | CACTGCTGCT GTCA |
| SEQ ID NO 8 | HPV56 probe | TTCAACAATC CACAGG |
| SEQ ID NO 9 | HPV58 probe | CTATCGTCTG CTGT |
| SEQ ID NO 10 | HPV59 probe | ACAGCGTATC AGCAGC |
| SEQ ID NO 11 | HPV66 probe | TGTCTACTCG TATGTCT |
| SEQ ID NO 12 | HPV68 probe | TCACTGTCAT CTGT |
| SEQ ID NO 13 | HPV31 primer1 | GAGCACACAA GTAGATATTC |
| SEQ ID NO 14 | HPV31 primer2 | GTCCTCTGAA ATGTTGTC |
| SEQ ID NO 15 | HPV33 primer1 | CGTCTATATC TAGCAACCA |
| SEQ ID NO 16 | HPV33 primer2 | GCTGTTCTAT TGTCCAAG |
| SEQ ID NO 17 | HPV35 primer1 | TGGACAGTGT TGACAGAG |
| SEQ ID NO 18 | HPV35 primer2 | CCCAATCTAT ATCTTGAACA CTTTA |
| SEQ ID NO 19 | HPV39 primer1 | GACCTGGCAG ACTTTATTG |
| SEQ ID NO 20 | HPV39 primer2 | CCTGGTATTC CTGCCTAC |
| SEQ ID NO 21 | HPV45 primer1 | CGGTGGGATA CATGACTA |
| SEQ ID NO 22 | HPV45 primer2 | CCAACAACCA AGCAAAAG |
| SEQ ID NO 23 | HPV51 primer1 | GCCCATTAGG AGACATTA |
| SEQ ID NO 24 | HPV51 primer2 | CGGATAACTG TCCAGTAA |
| SEQ ID NO 25 | HPV52 primer1 | GCATCTGGTC ATGTATTG |
| SEQ ID NO 26 | HPV52 primer2 | CCTGGAATAG GTGTACTAC |
| SEQ ID NO 27 | HPV56 primer1 | AAGGCAGCTT ATTCTGTG |
| SEQ ID NO 28 | HPV56 primer2 | CTCAGCACGT GTTAGTTC |
| SEQ ID NO 29 | HPV58 primer1 | AGCGGTAATA GAACGAAGA |
| SEQ ID NO 30 | HPV58 primer2 | CTGTGTAGTA CTTTGTACTG AATC |
| SEQ ID NO 31 | HPV59 primer1 | GCAAGAGTAA GAGAATTAAG A |
| SEQ ID NO 32 | HPV59 primer2 | GTTGGACATA GAGGTTTTAG |
| SEQ ID NO 33 | HPV66 primer1 | CGATGTCAAT GTCCGTTA |
| SEQ ID NO 34 | HPV66 primer2 | GCATGGTTAT ACTGTAGATT C |
| SEQ ID NO 35 | HPV68 primer1 | CATGGAATAG ATGATAGTGT A |
| SEQ ID NO 36 | HPV68 primer2 | GCAGCATTAC TATTACAATC |
| SEQ ID NO 37 | HPV16 probe | CACTATCGTC TACTATGTCA |
| SEQ ID NO 38 | HPV16 primer1 | ACAGGTATAT CAAATATTAG TGAA |
| SEQ ID NO 39 | HPV16 primer2 | CTTGCATTAC TATTAGTGTC TG |
| SEQ ID NO 40 | HPV18 probe | TCTATGTCAC GAGC |
| SEQ ID NO 41 | HPV18 primer1 | AGCCCCAAAA TGAAATTC |
| SEQ ID NO 42 | HPV18 primer2 | CACACTTACA ACACATACA |
| SEQ ID NO 43 | β-globin probe | TGCTTCTGAC ACAACT |
| SEQ ID NO 44 | β-globin primer1 | GAGCCATCTA TTGCTTACA |
| SEQ ID NO 45 | β-globin primer2 | CTCACCACCA ACTTCATC |
本发明是基于多重荧光PCR技术，通过实时荧光PCR仪，进行同步核酸扩增与检测，而提供一种可以在同一反应管中检测第一组不分型12种高危型HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)、第二组高危型HPV 16、第三组高危型HPV 18及第四组细胞内β-globin基因的试剂盒；第四组同步检测细胞内保守基因β-globin，用于评估采集样本质量及PCR抑制因素，对检测过程进行质量控制。本发明所有的探针Tm接近相同且高于引物的Tm大约8～10℃，所有引物的Tm接近相同为58～60℃，确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。
本发明的试剂盒既可以将高危型HPV检测又能将HPV16、HPV18具体分型，同时还可通过β-globin基因对检测过程进行质量控制，满足了筛查要求且能更好地提供临床指导，这样可以最大限度减轻我国HPV基因检测所带来的巨额费用，从而降低病人的经济负担，达到有效利用资源的目的，同时保护人民的身体健康。
附图说明
以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。
图一是第一组12种高危型HPV中的模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。
图二是第二组高危型HPV 16模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。
图三是第三组高危型HPV 18模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。
图四是第四组细胞内β-globin基因模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。
图五是含有第一组至第四组的模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行详细的说明。
本发明人通过分析临床样本的DNA，分别制备具有仅与12种高危型HPV(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：1～12的探针及SEQ ID No：13～36的引物；仅与高危型HPV16的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：37的探针及SEQ ID No：38～39的引物；仅与高危型HPV18的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：40的探针及SEQ ID No：41～42的引物，仅与细胞内β-globin基因的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：43的探针及SEQ ID No：44～45的引物；第一组探针标记最大发射波长518nm染料、第二组探针标记最大发射波长553nm染料、第三组探针标记最大发射波长607nm染料、第四组探针标记最大发射波长667nm染料。以此来检测12种HPV感染及鉴定HPV16、HPV18，并且同时检测细胞内β-globin基因的DNA用于评估样本质量及PCR抑制因素。
同时准备试验所需的DNA聚合酶、PCR MIX，后者包括除模板以外的所有PCR反应所需试剂，以及用于阳性对照的HPV16、18、31质粒和阴性对照的超纯水。
样品采集及处理：
1.宫颈脱落细胞：由医生以窥阴器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈过多的分泌物擦去。将宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转3至5圈。慢慢取出宫颈刷，将其放入装有细胞保存液的样本管中。在管口处将多余的刷柄折断，将刷头留在样本管中，旋紧管盖，做好样品标识并保持洗脱管直立放置。
2.宫颈分泌物：使用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈口，拭子深入宫颈管1～2cm，捻动拭子，并停留30秒后取出，其放入标有编号的取样管中。
3.男性泌尿生殖道分泌物采集：用细小棉拭子伸入尿道2-5cm，捻动拭子采集分泌物，将其放入标有编号的取样管中。
样品采用常规提取DNA的方法提取DNA。
样品检测：
将样品提取的DNA 2μl加入PCR反应液并混匀后，再放置于荧光定量PCR仪中反应，采用常规的扩增程序95℃10分钟，热循环95℃15秒，60℃60秒，共45循环。
扩增后曲线分析：
样品的Ct值显示为Undet，判断为阴性。样本的Ct值≤40，判断为阳性；若为40＜Ct值＜45的样品建议重做，重做结果Ct值＜40者为阳性，否则为阴性。
为检测本发明试剂盒诊断HPV感染的准确性和有效性，对931例临床样品与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)做对比实验，评价试验系统和对照系统的一致性。定性检测产品的结果多为计数统计资料，可按下表进行统计分析：
配对计数资料统计例表
阳性符合率和阴性符合率的公式为：
阳性符合率＝a/a+c*100％
阴性符合率＝b/b+d*100％
阳性符合率和阴性符合率满足临床要求，认为两个方法或产品等效。
本发明试剂盒与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)对HPV16检测结果比较：
| 指标 | 本试剂盒 |
| HPV16阳性符合率 | 100％ |
| HPV16阴性符合率 | 100％ |
本发明试剂盒与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)对HPV18检测结果比较：
| 指标 | 本试剂盒 |
| HPV18阳性符合率 | 100％ |
| HPV18阴性符合率 | 99.89％ |
本发明试剂盒与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)对除HPV16、HPV18外的12种高危型HPV检测结果比较：
| 指标 | 本试剂盒 |
| 12HPV阳性符合率 | 100％ |
| 12HPV阴性符合率 | 99.53％ |
本发明试剂盒与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)对HPV16、HPV18及12种高危型HPV检测结果合并比较：
| 指标 | 本试剂盒 |
| 12+2HPV阳性符合率 | 100％ |
| 12+2HPV阴性符合率 | 99.40％ |
结合上述实验结果，本发明试剂盒与对比试剂在灵敏度和特异度方面具有很高的一致性，对疾病的诊断起到了快速、准确的效果，完全满足临床应用的要求。
Claims (1)
1.一种12+2高危型人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)核酸检测试剂盒，包括：
(1)检测12种高危型HPV的核苷酸序列为SEQ ID No：1～12的探针及SEQ ID No：13～36的引物；所述12种高危型HPV是指HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68；
(2)检测高危型HPV16的核苷酸序列为SEQ ID No：37的探针及SEQ ID No：38～39的引物；
(3)检测高危型HPV18的核苷酸序列为SEQ ID No：40的探针及SEQ ID No：41～42的引物；
(4)检测细胞内β-globin基因的核苷酸序列为SEQ ID No：43的探针及SEQ ID No：44～45的引物；
其中，上述(1)～(4)组每组探针分别标记选自最大发射波长518nm、538～553nm、574～575nm、607～615nm、640nm、666～667nm、690nm染料的其中一种并且每组探针标记不同波长的染料。
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