CN104560962B - 用于检测人乳头瘤病毒的荧光pcr试剂盒及其专用引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人乳头瘤病毒的荧光PCR试剂盒及其专用引物组。本发明提供了一种引物组，由序列表的序列1至序列表的序列44所示的单链DNA分子组成。所述引物组的应用，为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒；（b）辅助鉴定人乳头瘤病毒；（c）辅助检测待测样本中是否含有人乳头瘤病毒；（d）辅助鉴定含有人乳头瘤病毒的待测样本中的人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒。本发明对于人乳头瘤病毒的早期诊断和宫颈癌的早期预防有重要意义，可广泛用于临床高效诊断和女性体检。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测人乳头瘤病毒的荧光PCR试剂盒及其专用引物组。
背景技术
子宫颈癌（又称宫颈癌）是威胁妇女健康的主要疾病之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。宫颈癌是全球性公共卫生问题，也是发展中国家最常见的癌症。据WHO报道，2005年有超过50万的宫颈癌新发病例，90%来自发展中国家。在已建立了筛查制度的发达国家和一些发展中国家的流行病学资料显示，子宫颈浸润癌发病率和死亡率已经大幅度下降。
对宫颈癌发病病因的研究表明，人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）高危型持续感染是宫颈癌发生、发展的必要因素。人乳头瘤病毒是小型双链DNA病毒，主要引起高级脊椎动物的上皮细胞发生增殖以及乳头瘤样改变。依据不同型HPV与宫颈癌发生的危险性高低将HPV分为：高危型HPV(如HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68等)和低危型HPV(如HPV-6、HPV-11、HPV-81、HPV-70等)。
对于HPV感染本身的处理，尽管多数高危HPV感染是一过性的，病毒约经6-8个月后可被清除，但仍有少部分患者(4%)体内病毒不能被清除，感染呈持续性，这将导致宫颈上皮内瘤变（CIN）持续存在或进一步发展为宫颈癌，从高危型HPV感染开始至发展为宫颈癌的时间间隔为15年，因此早期筛查和清除HPV感染，可有效地预防宫颈癌的发生。
目前的流行病学和生物学资料已经证明HPV感染是子宫颈癌及其癌前病变（子宫颈上皮内瘤样变）的主要病因。因此，许多学者提出将检测HPV感染作为子宫颈癌的一种筛查手段。
HPV检测方法有细胞学法、斑点印迹法、荧光原位杂交法、原位杂交法、Southern杂交法、多聚合酶链反应（PCR）法和近年的杂交捕获法等，目前除外多聚合酶链反应（PCR）法和杂交捕获法外，均存在操作繁琐，检测敏感性和特异性差等缺点。杂交捕获法假阳性率高、操作时间长、成本较高，不宜应用于大规模的HPV临床筛查。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测人乳头瘤病毒的荧光PCR试剂盒及其专用引物组。
本发明提供了一种引物组，包括22个引物对中的至少1个引物对；所述22个引物对为引物对1至引物对22；
所述引物对1由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对2由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述引物对3由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成；所述引物对4由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列表的序列8所示的单链DNA分子组成；所述引物对5由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成；所述引物对6由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成；所述引物对7由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列表的序列14所示的单链DNA分子组成；所述引物对8由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列表的序列16所示的单链DNA分子组成；所述引物对9由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列表的序列18所示的单链DNA分子组成；所述引物对10由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列表的序列20所示的单链DNA分子组成；所述引物对11由序列表的序列21所示的单链DNA分子和序列表的序列22所示的单链DNA分子组成；所述引物对12由序列表的序列23所示的单链DNA分子和序列表的序列24所示的单链DNA分子组成；所述引物对13由序列表的序列25所示的单链DNA分子和序列表的序列26所示的单链DNA分子组成；所述引物对14由序列表的序列27所示的单链DNA分子和序列表的序列28所示的单链DNA分子组成；所述引物对15由序列表的序列29所示的单链DNA分子和序列表的序列30所示的单链DNA分子组成；所述引物对16由序列表的序列31所示的单链DNA分子和序列表的序列32所示的单链DNA分子组成；所述引物对17由序列表的序列33所示的单链DNA分子和序列表的序列34所示的单链DNA分子组成；所述引物对18由序列表的序列35所示的单链DNA分子和序列表的序列36所示的单链DNA分子组成；所述引物对19由序列表的序列37所示的单链DNA分子和序列表的序列38所示的单链DNA分子组成；所述引物对20由序列表的序列39所示的单链DNA分子和序列表的序列40所示的单链DNA分子组成；所述引物对21由序列表的序列41所示的单链DNA分子和序列表的序列42所示的单链DNA分子组成；所述引物对22由序列表的序列43所示的单链DNA分子和序列表的序列44所示的单链DNA分子组成。
所述引物组具体可由所述22个引物对（即引物对1至引物对22）组成。
所述引物组合物具体可由引物组合物甲和引物组合物乙组成；所述引物组合物甲由所述引物对1至所述引物对18组成；所述引物组合物乙由所述引物对19至所述引物对22组成。
所述引物组还可包括引物对23；所述引物对23由序列表的序列45所示的单链DNA分子和序列表的序列46所示的单链DNA分子组成。
所述引物组具体可由所述22个引物对和所述引物对23组成。
所述引物组合物具体可由引物组合物甲和引物组合物乙组成；所述引物组合物甲由所述引物对23和所述引物对1至所述引物对18组成；所述引物组合物乙由所述引物对23和所述引物对19至所述引物对22组成。
所述引物组的功能为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒；（b）辅助鉴定人乳头瘤病毒；（c）辅助检测待测样本中是否含有人乳头瘤病毒；（d）辅助鉴定含有人乳头瘤病毒的待测样本中的人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒。
本发明还保护以上任一所述的引物组在制备试剂盒中的应用。所述试剂盒的功能为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒；（b）辅助鉴定人乳头瘤病毒；（c）辅助检测待测样本中是否含有人乳头瘤病毒；（d）辅助鉴定含有人乳头瘤病毒的待测样本中的人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒。
本发明还保护含有以上任一所述引物组的试剂盒。所述试剂盒的功能为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒；（b）辅助鉴定人乳头瘤病毒；（c）辅助检测待测样本中是否含有人乳头瘤病毒；（d）辅助鉴定含有人乳头瘤病毒的待测样本中的人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒。所述试剂盒中还包括记载有如下判断标准的载体：如果采用所述引物组合物甲时，73.9-81.3℃范围内的导数峰值高于参考值，待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒；如果采用所述引物组合物乙时，74.3-80.35℃范围内的导数峰值高于参考值，待测人乳头瘤病毒为低危型人乳头瘤病毒。
本发明还保护以上任一所述的引物组的应用，为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒；（b）辅助鉴定人乳头瘤病毒；（c）辅助检测待测样本中是否含有人乳头瘤病毒；（d）辅助鉴定含有人乳头瘤病毒的待测样本中的人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒。
本发明还保护一种鉴定待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒的方法，包括如下步骤
（1）提取待测人乳头瘤病毒的总DNA；
（2）以步骤（1）提取的总DNA为模板，分别采用引物组合物甲和引物组合物乙进行实时荧光PCR；所述引物组合物甲包括序列表的序列1所示单链DNA分子、序列表的序列2所示单链DNA分子、序列表的序列3所示单链DNA分子、序列表的序列4所示单链DNA分子、序列表的序列5所示单链DNA分子、序列表的序列6所示单链DNA分子、序列表的序列7所示单链DNA分子、序列表的序列8所示单链DNA分子、序列表的序列9所示单链DNA分子、序列表的序列10所示单链DNA分子、序列表的序列11所示单链DNA分子、序列表的序列12所示单链DNA分子、序列表的序列13所示单链DNA分子、序列表的序列14所示单链DNA分子、序列表的序列15所示单链DNA分子、序列表的序列16所示单链DNA分子、序列表的序列17所示单链DNA分子、序列表的序列18所示单链DNA分子、序列表的序列19所示单链DNA分子、序列表的序列20所示单链DNA分子、序列表的序列21所示单链DNA分子、序列表的序列22所示单链DNA分子、序列表的序列23所示单链DNA分子、序列表的序列24所示单链DNA分子、序列表的序列25所示单链DNA分子、序列表的序列26所示单链DNA分子、序列表的序列27所示单链DNA分子、序列表的序列28所示单链DNA分子、序列表的序列29所示单链DNA分子、序列表的序列30所示单链DNA分子、序列表的序列31所示单链DNA分子、序列表的序列32所示单链DNA分子、序列表的序列33所示单链DNA分子、序列表的序列34所示单链DNA分子、序列表的序列35所示单链DNA分子和序列表的序列36所示单链DNA分子（所述引物组合物甲还可包括序列表的序列45所示的单链DNA分子和序列表的序列46所示的单链DNA分子；所述引物组合物甲具体可由序列表的序列1至序列表的序列36所示的单链DNA分子、序列表的序列45所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成）；所述引物组合物乙包括序列表的序列37所示单链DNA分子、序列表的序列38所示单链DNA分子、序列表的序列39所示单链DNA分子、序列表的序列40所示单链DNA分子、序列表的序列41所示单链DNA分子、序列表的序列42所示单链DNA分子、序列表的序列43所示单链DNA分子和序列表的序列44所示单链DNA分子（所述引物组合物乙还可包括序列表的序列45所示的单链DNA分子和序列表的序列46所示的单链DNA分子；所述引物组合物乙甲具体可由序列表的序列37至序列表的序列44所示的单链DNA分子、序列表的序列45所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成）；
（3）根据实时荧光PCR的熔解曲线，判断待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒。
判断标准如下：如果采用所述引物组合物甲时，73.9-81.3℃范围内的导数峰值高于参考值，待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒；如果采用所述引物组合物乙时，74.3-80.35℃范围内的导数峰值高于参考值，待测人乳头瘤病毒为低危型人乳头瘤病毒。
所述高危型人乳头瘤病毒具体可为HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-73或HPV-82。所述低危型人乳头瘤病毒具体可为HPV-6、HPV-11、HPV-70或HPV-81。
所述待检样本可为：用无菌棉拭子获取的疑似人乳头瘤病毒感染患者的宫颈脱落细胞，或用宫颈刷获取的疑似人乳头瘤病毒感染患者的宫颈脱落细胞，这些样本须在低于4℃的环境下运送到检测实验室，并置于-70℃或-20℃冷冻保存。
荧光PCR法具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、成本适中、高通量、无污染等优点。所述实时荧光PCR可为基于染料法的实时荧光PCR。所述实时荧光PCR中的染料可为Eva Green。
多重PCR即在同一个反应体系含有多对引物对多个靶序列进行检测。采用多重PCR的优势在于可以高效、经济简便，可以大大节约时间和成本，更能满足临床需要。而多重PCR劣势在于体系中使用过多引物，引物之间的相互反应，影响彼此的扩增效率。因此，多重PCR中引物设计的难点在于如何避免引物与引物之间的交叉反应。本发明提供的引物组，经过了大量比较和验证，有效避免了交叉反应的问题，所有引物可以分为两组，分别进行多重PCR，扩增效率高且灵敏度高。
本发明提供的试剂盒实现了18种高危型和4种低危型人乳头瘤病毒同时检测，非常适用于人乳头瘤病毒的早期筛查诊断。本发明对于人乳头瘤病毒的早期诊断和宫颈癌的早期预防有重要意义，可广泛用于临床高效诊断和女性体检。
附图说明
图1为HPV-16灵敏度检测结果。
图2为HPV-18灵敏度检测结果。
图3为HPV-26灵敏度检测结果。
图4为HPV-31灵敏度检测结果。
图5为HPV-33灵敏度检测结果。
图6为HPV-35灵敏度检测结果。
图7为HPV-39灵敏度检测结果。
图8为HPV-45灵敏度检测结果。
图9为HPV-51灵敏度检测结果。
图10为HPV-52灵敏度检测结果。
图11为HPV-53灵敏度检测结果。
图12为HPV-56灵敏度检测结果。
图13为HPV-58灵敏度检测结果。
图14为HPV-59灵敏度检测结果。
图15为HPV-66灵敏度检测结果。
图16为HPV-68灵敏度检测结果。
图17为HPV-73灵敏度检测结果。
图18为HPV-82灵敏度检测结果。
图19为HPV-6灵敏度检测结果。
图20为HPV-11灵敏度检测结果。
图21为HPV-70灵敏度检测结果。
图22为HPV-81灵敏度检测结果。
图23为部分样本采用高危型检测体系的特异性检测结果。
图24为部分样本采用低危型检测体系的特异性检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、试剂盒的制备
一、引物组的制备
研究表明，人乳头瘤病毒各亚型基因组的L1区序列之间，既有一定的同源性（即人乳头瘤病毒保守序列），又具有一定的多态性（即型特异性），根据亚型的特异性序列可以设计型特异性引物。本发明中用于检测22种人乳头瘤病毒（18种高危型人乳头瘤病毒和4种低危型人乳头瘤病毒）的引物对的设计原理为：在人乳头瘤病毒基因组的L1区（靶序列位置约为L1区bp800-bp1200）选择相邻的多态性序列设计特异性正向引物和反向引物。
引物组由23个引物对组成。
1、用于鉴定HPV-16（5’→3’）的引物对如下：
GCACAGGGCCACAATAATGG（序列表的序列1）；
TCCCCATGTCGTAGGTACTC（序列表的序列2）。
2、用于鉴定HPV-18（5’→3’）的引物对如下：
CACTGTGCCTCAATCCTT（序列表的序列3）；
CATATTGCCCAGGTACAGGAG（序列表的序列4）。
3、用于鉴定HPV-26（5’→3’）的引物对如下：
GCACAGGGTCATAATAATGG（序列表的序列5）；
TGGAGTGGATGCAGATGCTG（序列表的序列6）。
4、用于鉴定HPV-31（5’→3’）的引物对如下：
GCGGCTCAGGGACACAATAATGG（序列表的序列7）；
CCGGTAGTATCACTGTTTGCAATTGC（序列表的序列8）。
5、用于鉴定HPV-33（5’→3’）的引物对如下：
CGTGCACAAGGTCATAATAATGG（序列表的序列9）；
TGTACGGTCACTAGTTACTTGCGTG（序列表的序列10）。
6、用于鉴定HPV-35（5’→3’）的引物对如下：
GCACAAGGCCATAATAATGG（序列表的序列11）；
GAAGACACAGCAGAACACAC（序列表的序列12）。
7、用于鉴定HPV-39（5’→3’）的引物对如下：
AACAATGGTATATGTTGGCAT（序列表的序列13）；
GGTATGGAAGACTCTATAGAGGTAG（序列表的序列14）。
8、用于鉴定HPV-45（5’→3’）的引物对如下：
GGTATTTGTTGGCATAATCAGT（序列表的序列15）；
AGTAGGGTCATATGTACTTGGC（序列表的序列16）。
9、用于鉴定HPV-51（5’→3’）的引物对如下：
GCGCAGGGTCACAATAATGG（序列表的序列17）；
AGTAAATGTTGGGGAAACTGC（序列表的序列18）。
10、用于鉴定HPV-52（5’→3’）的引物对如下：
GCGCAGGGCCACAATAATGG（序列表的序列19）；
GTGCTTTCCTTTTTCACCTCAG（序列表的序列20）。
11、用于鉴定HPV-53（5’→3’）的引物对如下：
GGTCAGGCGTTATTGGTGAG（序列表的序列21）；
CGTAATTGAGCCTCTGAAGTTATC（序列表的序列22）。
12、用于鉴定HPV-56（5’→3’）的引物对如下：
GCCCAAGGCCATAATAATGG（序列表的序列23）；
CTCCACATGTCTAAGGTACTGA（序列表的序列24）。
13、用于鉴定HPV-58（5’→3’）的引物对如下：
GCACAAGGTCATAACAATGG（序列表的序列25）；
GTACCTTCCTTAGTTACTTCAGTG（序列表的序列26）。
14、用于鉴定HPV-59（5’→3’）的引物对如下：
GCTCAGGGTTTAAACAATGG（序列表的序列27）；
GAAGAAGTAGTAGAAGCACACAC（序列表的序列28）。
15、用于鉴定HPV-66（5’→3’）的引物对如下：
GCACAGGGCCATAATAATGG（序列表的序列29）；
GTATTGATTGATTTCACGTGCATC（序列表的序列30）。
16、用于鉴定HPV-68（5’→3’）的引物对如下：
GCACAGGGACACAACAATGG（序列表的序列31）；
GGTACAGCTGATTCAGTAGTAGTAGAC（序列表的序列32）。
17、用于鉴定HPV-73（5’→3’）的引物对如下：
GCACAGGGACAAAATAATGG（序列表的序列33）；
AGAGTTGGCATACGTTGTAGTAG（序列表的序列34）。
18、用于鉴定HPV-82（5’→3’）的引物对如下：
GCCCAGGGCCACAATAATGG（序列表的序列35）；
CCCATGCCTAATGTACTGCTTA（序列表的序列36）。
19、用于鉴定HPV-6（5’→3’）的引物对如下：
GCCCAGGGACATAACAATGG（序列表的序列37）；
GGTGTATGTGGAAGATGTAGTTACG（序列表的序列38）。
20、用于鉴定HPV-11（5’→3’）的引物对如下：
GCGCGTCTAAATCTGCTACATACACTA（序列表的序列39）；
GTGTACCATTTGGTGGAGGCGAT（序列表的序列40）。
21、用于鉴定HPV-70（5’→3’）的引物对如下：
GTCTGCCTGCACCGAAACGG（序列表的序列41）；
CGCAGATGGTGGAGGGGTAACT（序列表的序列42）。
22、用于鉴定HPV-81（5’→3’）的引物对如下：
GCACAGGGCCATAATAATGG（序列表的序列43）；
GCGGTTAGAGGCCTTGTATTCT（序列表的序列44）。
23、用于鉴定GAPDH基因（5’→3’；GAPDH基因在NCBI中的序列号为NG_007073）的引物对如下：
CACTAGGCGCTCACTGTTCTCT（序列表的序列45）；
CCGTTGACTCCGACCTTCA（序列表的序列46）。
人乳头瘤病毒靶序列扩增产物所依据的基因库编号和位置见表1。
表1人乳头瘤病毒靶序列扩增产物所依据的基因库编号和位置
二、试剂盒的制备
试剂盒包括：（1）聚合酶链反应混合液A；（2）聚合酶链反应混合液B；（3）阳性对照；（4）阴性对照。
聚合酶链反应混合液A（高危型检测体系）由序列表的序列1至36所示的单链DNA分子、序列表的序列45所示的单链DNA分子、序列表的序列46所示的单链DNA分子、5×GoldStar Taq PCR Buffer（康为世纪有限公司，产品目录号：12910j）、dNTPs、dUTPs、Hotstar Taq Polymerase、UNG酶、Rox Reference Dye、Eva Green和纯化水组成。聚合酶链反应混合液A中，各个组分的浓度见表2。
表2聚合酶链反应混合液A中各个组分的浓度
| 原浓度 | μl/反应 | 终浓度 | |
| 纯化水 | 8.375 | ||
| 5×GoldStar Taq PCR Buffer | 5× | 6 | 1× |
| dNTP | 2.5mM | 2.4 | 0.2mM |
| dUTP | 10mM | 0.075 | 0.025mM |
| 序列1所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.07 | 0.023μM |
| 序列2所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.07 | 0.023μM |
| 序列35所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.1 | 0.033μM |
| 序列36所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.1 | 0.033μM |
| 序列19所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.13 | 0.043μM |
| 序列20所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.13 | 0.043μM |
| 序列45所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列46所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列5所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列6所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列7所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列8所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列11所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列12所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列15所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列16所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列21所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列22所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列3所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列4所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列13所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列14所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列25所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列26所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列27所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列28所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列29所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列30所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列31所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列32所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列33所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列34所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列9所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.4 | 0.133μM |
| 序列10所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.4 | 0.133μM |
| 序列17所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.4 | 0.133μM |
| 序列18所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.4 | 0.133μM |
| 序列23所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.4 | 0.133μM |
| 序列24所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.4 | 0.133μM |
| Rox Reference Dye | 50× | 0.6 | 1× |
| Eva green | 20× | 0.45 | 0.3× |
| UNG酶 | 0.1U/μl | 0.3 | 0.3U/反应 |
| Hotstar Taq Polymerase | 5U/μl | 0.2 | 1U/反应 |
| 总量 | 28 |
聚合酶链反应混合液B（低危型检测体系）由序列表的序列37至44所示的单链DNA分子、序列表的序列45所示的单链DNA分子、序列表的序列46所示的单链DNA分子、5×GoldStar Taq PCR Buffer（康为世纪有限公司，产品目录号：12910j）、dNTPs、dUTPs、Hotstar Taq Polymerase、UNG酶、Rox Reference Dye、Eva Green和纯化水组成。聚合酶链反应混合液B中，各个组分的浓度见表3。
表3聚合酶链反应混合液B中各个组分的浓度
| 原浓度 | 体积μl/反应 | 终浓度 | |
| 纯化水 | 15.075 | ||
| 5×GoldStar Taq PCR Buffer | 5× | 6 | 1× |
| dNTP | 2.5mM | 2.4 | 0.2mM |
| dUTP | 10mM | 0.075 | 0.025mM |
| 序列37所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.15 | 0.05μM |
| 序列38所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.15 | 0.05μM |
| 序列45所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列46所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.2 | 0.067μM |
| 序列41所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列42所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列43所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列44所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.3 | 0.1μM |
| 序列39所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.5 | 0.167μM |
| 序列40所示的单链DNA分子 | 10μM | 0.5 | 0.167μM |
| Rox Reference Dye | 50× | 0.6 | 1× |
| Eva green | 20× | 0.45 | 0.3× |
| UNG酶 | 0.1U/μl | 0.3 | 0.3U/反应 |
| Hotstar Taq Polymerase | 5U/μl | 0.2 | 1U/反应 |
| 总量 | 28 |
阳性对照：采用了两个阳性对照质粒（HPV16型质粒和HPV18型质粒），均为中国食品药品检定研究院的“人乳头瘤病毒L1基因分型参考品”（产品目录号：360002）中的组件。
阴性对照：高压灭菌水。
实施例2、多重PCR扩增程序的优化
为了提高检测体系的灵敏度和特异性，发明人对PCR扩增程序的各个参数（包括退火温度和时间、检测温度和时间）进行优化，最终确定的PCR反应程序如下：
37℃600秒（1个循环）→95℃900秒（1个循环）→95℃20秒，59℃30秒（35个循环）→95℃15秒（1个循环）→60℃60秒（1个循环）→95℃15秒（1个循环）→60℃15秒（1个循环）。其中，59℃是荧光检测温度。
实施例3、试剂盒的结果判读方法
本发明提供的试剂盒通过对样本熔解曲线的分析进行阴阳性判断。通过分别判断高危型检测体系73.9-81.3℃和低危型检测体系74.3-80.35℃范围内的导数峰值是否高于参考值，确定样品是否为HPV高危型阳性或HPV低危型阳性。另外在熔解曲线图中，高于参考值范围还存在质控峰（人组织中含有GAPDH基因，高危型检测体系和低危型检测体系中均含有用于鉴定GAPDH基因的引物对，所以会出现质控峰；由于横坐标为温度，质控峰即目标峰后面的峰），如果出现质控峰，说明结果可信。
实施例4、试剂盒灵敏度检测
等摩尔混合的HPV-16阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-16阳性质粒的浓度约为103copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图1。对于103copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-18阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-18阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图2。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-26阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-26阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图3。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-31阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-31阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图4。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-33阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-33阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图5。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-35阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-35阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图6。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-39阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-39阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图7。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-45阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-45阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图8。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-51阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-51阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图9。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-52阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-52阳性质粒的浓度约为103copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图10。对于103copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-53阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-53阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图11。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-56阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-56阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图12。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-58阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-58阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图13。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-59阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-59阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图14。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-66阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-66阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图15。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-68阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-68阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图16。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-73阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-73阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图17。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-82阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-82阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图18。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-6阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-6阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液B混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图19。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-11阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-11阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液B混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图20。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-70阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-70阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液B混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图21。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
等摩尔混合的HPV-81阳性质粒和GAPDH阳性质粒，得到质粒混合物，将2微升质粒混合物（HPV-81阳性质粒的浓度约为102copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液B混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。结果见图22。对于102copies/μl的质粒浓度来说，结果为阳性。
HPV-16阳性质粒为将序列47所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-18阳性质粒为将序列48所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-26阳性质粒为将序列49所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-31阳性质粒为将序列50所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-33阳性质粒为将序列51所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-35阳性质粒为将序列52所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-39阳性质粒为将序列53所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-45阳性质粒为将序列54所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-51阳性质粒为将序列55所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-52阳性质粒为将序列56所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-53阳性质粒为将序列57所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-56阳性质粒为将序列58所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-58阳性质粒为将序列59所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-59阳性质粒为将序列60所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-66阳性质粒为将序列61所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-68阳性质粒为将序列62所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-73阳性质粒为将序列63所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-82阳性质粒为将序列64所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-6阳性质粒为将序列65所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-11阳性质粒为将序列66所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-70阳性质粒为将序列67所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。HPV-81阳性质粒为将序列68所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。GAPDH阳性质粒为将序列69所示的双链DNA分子插入pMD18-T载体得到的重组质粒。
从图1-图22的结果可以看出，本发明的方法和试剂盒可以检测到浓度约为102-103copies/μl的常见18种高危型和4种低危型人乳头瘤病毒DNA模板，可以满足临床的需求。
实施例5、试剂盒特异性检测
对照质粒：含有HPV-40的DNA片段的质粒、含有HPV-42的DNA片段的质粒、含有HPV-43的DNA片段的质粒、含有HPV-44的DNA片段的质粒、含有HPV-54的DNA片段的质粒，均为购自中国食品药品检定研究院的产品名称“人乳头瘤病毒L1基因分型参考品”（产品目录号：360002）的组件。
分别将2微升各个对照质粒（浓度约为107copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。将各个对照质粒的图谱叠加得到图23。
分别将2微升各个对照质粒（浓度约为107copies/μl）与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液B混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。将各个对照质粒的图谱叠加得到图24。
从图23和图24的结果可以看出，本发明的方法和试剂盒对本试剂盒检测范围外的浓度为107copies/μl的各型人乳头瘤病毒DNA模板检测结果为阴性，说明试剂盒的特异性良好。
实施例6、试剂盒对临床样本的检测
使用本发明的方法和试剂盒，对53例的临床宫颈标本（已通过DNA测序确认其含有哪种HPV）进行检测，其中28例含高危型人乳头瘤病毒DNA，5例含低危型人乳头瘤病毒DNA，20例不含人乳头瘤病毒DNA。
分别将每个标本提取基因组DNA，然后将2微升基因组DNA与28微升实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液A或实施例1的步骤二制备的聚合酶链反应混合液B混合，采用实施例2优化的程序进行PCR，按照实施例3的方法判断结果。
结果见表4。结果显示：28例高危型人乳头瘤病毒DNA阳性的样本用本发明的试剂盒检测，与测序检测结果的符合率为100%；5例低危型人乳头瘤病毒DNA阳性的样本使用本发明的试剂盒检测，与测序检测结果的符合率为100%；本试剂盒的总阳性检出率为100%；20例不含人乳头瘤病毒DNA的样本用本发明的试剂盒检测，结果均为阴性，特异性100%。
表4分别使用本发明的试剂盒和DNA测序检测53例临床标本的结果比较
| 样本号 | 本发明检测结果 | 测序检测结果 |
| SX-071 | HPV高危阳性 | HPV18 |
| XJ-089 | HPV高危阳性 | HPV51 |
| XJ-093 | HPV低危阳性 | HPV70 |
| XJ-141 | HPV高危阳性 | HPV31 |
| XJ-147 | HPV高危阳性 | HPV52 |
| XJ-156 | HPV高危阳性 | HPV56 |
| XJ-165 | HPV高危阳性 | HPV52 |
| XJ-183 | HPV低危阳性 | HPV6 |
| XJ-196 | HPV高危阳性 | HPV33 |
| XJ-200 | HPV高危阳性 | HPV52 |
| XJ-208 | HPV高危阳性 | HPV52 |
| XJ-260 | HPV低危阳性 | HPV6 |
| XJ-243 | HPV低危阳性 | HPV6 |
| XJ-275 | HPV低危阳性 | HPV81 |
| XJ-277 | HPV高危阳性 | HPV16 |
| XJ-281 | HPV高危阳性 | HPV33 |
| XJ-283 | HPV高危阳性 | HPV58 |
| XJ-293 | HPV高危阳性 | HPV58 |
| XJ-301 | HPV高危阳性 | HPV51 |
| XJ-303 | HPV高危阳性 | HPV53 |
| XJ-049 | HPV低危阳性 | HPV81 |
| XJ-101 | HPV高危阳性 | HPV53 |
| XJ-117 | HPV高危阳性 | HPV16 |
| XJ-156 | HPV高危阳性 | HPV35 |
| XJ-174 | HPV高危阳性 | HPV16 |
| XJ-255 | HPV高危阳性 | HPV59 |
| XJ-268 | HPV高危阳性 | HPV53 |
| XJ-277 | HPV高危阳性 | HPV16 |
| XJ-288 | HPV高危阳性 | HPV52 |
| XJ-297 | HPV高危阳性 | HPV68 |
| XJ-307 | HPV高危阳性 | HPV35 |
| XJ-308 | HPV高危阳性 | HPV59 |
| XJ-190 | HPV高危阳性 | HPV66 |
| XJ-042 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-043 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-044 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-045 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-046 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-047 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-048 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-049 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-050 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-051 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-052 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-053 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-054 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-055 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-056 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-057 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-058 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-059 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-060 | HPV阴性 | HPV阴性 |
| XJ-061 | HPV阴性 | HPV阴性 |
Claims (6)
1.一种引物组，由引物组合物甲和引物组合物乙组成；
所述引物组合物甲由序列表的序列1所示单链DNA分子、序列表的序列2所示单链DNA分子、序列表的序列3所示单链DNA分子、序列表的序列4所示单链DNA分子、序列表的序列5所示单链DNA分子、序列表的序列6所示单链DNA分子、序列表的序列7所示单链DNA分子、序列表的序列8所示单链DNA分子、序列表的序列9所示单链DNA分子、序列表的序列10所示单链DNA分子、序列表的序列11所示单链DNA分子、序列表的序列12所示单链DNA分子、序列表的序列13所示单链DNA分子、序列表的序列14所示单链DNA分子、序列表的序列15所示单链DNA分子、序列表的序列16所示单链DNA分子、序列表的序列17所示单链DNA分子、序列表的序列18所示单链DNA分子、序列表的序列19所示单链DNA分子、序列表的序列20所示单链DNA分子、序列表的序列21所示单链DNA分子、序列表的序列22所示单链DNA分子、序列表的序列23所示单链DNA分子、序列表的序列24所示单链DNA分子、序列表的序列25所示单链DNA分子、序列表的序列26所示单链DNA分子、序列表的序列27所示单链DNA分子、序列表的序列28所示单链DNA分子、序列表的序列29所示单链DNA分子、序列表的序列30所示单链DNA分子、序列表的序列31所示单链DNA分子、序列表的序列32所示单链DNA分子、序列表的序列33所示单链DNA分子、序列表的序列34所示单链DNA分子、序列表的序列35所示单链DNA分子和序列表的序列36所示单链DNA分子组成；
所述引物组合物乙由序列表的序列37所示单链DNA分子、序列表的序列38所示单链DNA分子、序列表的序列39所示单链DNA分子、序列表的序列40所示单链DNA分子、序列表的序列41所示单链DNA分子、序列表的序列42所示单链DNA分子、序列表的序列43所示单链DNA分子和序列表的序列44所示单链DNA分子组成。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述引物组的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)辅助鉴定待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒；(b)辅助鉴定人乳头瘤病毒；(c)辅助检测待测样本中是否含有人乳头瘤病毒；(d)辅助鉴定含有人乳头瘤病毒的待测样本中的人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒。
3.权利要求1所述的引物组在制备试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)辅助鉴定待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒；(b)辅助鉴定人乳头瘤病毒；(c)辅助检测待测样本中是否含有人乳头瘤病毒；(d)辅助鉴定含有人乳头瘤病毒的待测样本中的人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒。
5.含有权利要求1所述引物组的试剂盒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)辅助鉴定待测人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒；(b)辅助鉴定人乳头瘤病毒；(c)辅助检测待测样本中是否含有人乳头瘤病毒；(d)辅助鉴定含有人乳头瘤病毒的待测样本中的人乳头瘤病毒为高危型人乳头瘤病毒还是低危型人乳头瘤病毒。
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