CN101956024A

CN101956024A - 用于检测人乳头瘤病毒的试剂

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Publication number: CN101956024A
Application number: CN2010105175201A
Authority: CN
Inventors: 朱宝利; 向阳; 杨毅; 张瑞芬; 蔡玉品; 王志云
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2010-10-18
Filing date: 2010-10-18
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2030-10-18
Also published as: CN101956024B

Abstract

本发明公开了一种用于检测人乳头瘤病毒的试剂。本发明提供的试剂，包括引物组合物甲；所述引物组合物甲包括序列表的序列1至序列18所示的DNA。所述试剂还可包括引物组合物乙；所述引物组合物乙由序列表的序列20至序列43所示的DNA组成。所述试剂可用于辅助鉴定人乳头瘤病毒。本发明提供的试剂可检测出感染女性生殖道的所有HPV型别，包括14种高危型HPV和12种低危型HPV。本发明主要解决了现有的检测方法中不能对感染的HPV进行分型，或者因为交叉反应造成的分型不准确的技术问题，从而提供了一种准确、灵敏度高且经济实用的检测方法，适用于临床HPV检测和大规模人群HPV筛查使用。

Description

用于检测人乳头瘤病毒的试剂

技术领域

本发明涉及一种用于检测人乳头瘤病毒的试剂。

背景技术

国际癌症研究组织(IARC)调查显示宫颈癌是妇女当中第三大常见的恶性肿瘤，在中国每年约有8万的新发病例和3万的死亡病例。研究表明，人乳头瘤病毒与宫颈癌的发生密切相关，99％以上的宫颈癌患者当中可检测出HPV的感染。到目前为止已发现了100多个型别的HPV，其中感染生殖道的有40多个(de Villiers EM，Fauquet C，Broker TR，Bernard HU，zur Hausen H.Classification of papillomaviruses.Virology.2004.324：17-27.)。根据流行病学调查以及分子进化树分析，HPV可分为高危型和低危型，其中高危型HPV包括15种(HPV-16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82)，低危型HPV包括12种(HPV-6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81，CP6108)(Munoz N，BoxchFX，de Sanjose S，Herrero R，Castellsague KV，Shanh，Snijders PJ，Meijer CJ.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer.N.Engl.J.Med.2003.348：518-527.)。在宫颈癌患者当中，HPV 16的感染最多，其次是HPV 18，而在中国HPV 58和52这两个型别的感染率相对较高(Clifford GM，GallusS，Herrero R，Munoz N，Snijders PJ，Vaccarella S，Anh PT，Ferreccio C，Hieu，MatosE，Molano M，Rajkumar R，Ronco G，de Sanjose S，Shin HR，Sukvirach S，Thomas JO，Tunsakul S，Meijer CJ，Franceschi S，and the IARC HPV Prevalence Surveys Study Group.Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically normal women in the International Agency for Research on Cancer HPV prevalence surveys：a pooled analysis.Lancet.2005.366：991-998.)。

现在最常用的HPV分子检测方法有：

(i)信号放大法，如美国食品和药物管理局(FDA)通过的第二代杂交捕获技术(HC2)和Cervista HPV HR。HC2是现在临床上用的最多的一种检测方法，它采用两组特异的RNA探针与HPV DNA杂交，利用抗体捕获RNA：DNA杂交子并通过结合二抗使杂交信号放大的方法来检测13种高危型HPV和5种低危型HPV。杂交捕获法敏感性较好，重复性高，缺点是不能测定具体的HPV型别，同时也存在着高危型HPV探针与一些低危型HPV发生交叉反应，从而降低了特异性。另外，这种检测成本太高，并不能作为一种筛查方法在发展中国家得以推广。Cervista HPV HR通过荧光共振能量转移(FRET)的方法使检测信号放大，同样也不能对HPV进行分型并存在交叉反应。

(ii)基于PCR扩增的方法。以聚合酶链式反应(PCR)为基础的检测方法是用PCR方法先进行目的基因的扩增，然后再用各种方法(如特异探针杂交、酶切图谱鉴定和质谱)进行分型。杂交法可以很好的对常见的高危型和低危型分型，同时可以检测混合感染的样品。现在实验室阶段常用的试剂盒大部分都是基于这种方法设计的，如Roche公司的Linear Array HPVGenotyping，Innogenetics开发的INNO-LiPa HPV Genotyping，和Hybribio公司的HPVGenoArray Test Kit.这种方法同样也存在着交叉反应的问题，并且只能检测出针对探针设计的几种常见的高危型和低危型HPV。酶切图谱鉴定是通过一种或几种限制性内切酶对PCR产物进行酶切，然后进行琼脂糖电泳分析带型，这种方法工作量很大，并且易受主观因素影响。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱利用型别特异的延伸引物获得短片段，然后根据延伸产物的荷质比不同将其分型。这种方法需要昂贵的仪器，并且对实验技术要求很高。

病毒检测的金标方法是对全基因组测序，但这在临床上大规模应用是不现实的。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测人乳头瘤病毒的试剂。

本发明提供的用于辅助检测人乳头瘤病毒的试剂，包括引物组合物甲；所述引物组合物甲包括序列表的序列1至序列18所示的DNA。

所述引物组合物甲具体可由序列表的序列1至序列19所示的DNA组成，序列19所示DNA为测序引物。

所述试剂还可包括引物组合物乙；所述引物组合物乙由序列表的序列20至序列43所示的DNA组成。

所述试剂具体可由所述引物组合物甲、所述引物组合物乙和质控引物对组成；所述质控引物对由序列表的序列44所示DNA和序列表的序列45所示DNA组成。

以上任一所述试剂均可用于制备辅助检测人乳头瘤病毒的试剂盒。

本发明还保护一种制备辅助检测人乳头瘤病毒的试剂盒，包括以上任一所述试剂。

所述试剂还可包括阳性对照和阴性对照。所述阳性对照可为克隆有HPV16全长的质粒。所述阴性对照可为无菌水和人的外周血DNA。

所述试剂可用于辅助鉴定人乳头瘤病毒。

所述人乳头瘤病毒为高危型毒株或低危型毒株；所述高危型毒株为HPV-16毒株、HPV-18毒株、HPV-31毒株、HPV-33毒株、HPV-35毒株、HPV-39毒株、HPV-45毒株、HPV-51毒株、HPV-52毒株、HPV-56毒株、HPV-58毒株、HPV-59毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所述低危型毒株为HPV-6毒株、HPV-11毒株、HPV-40毒株、HPV-42毒株、HPV-43毒株、HPV-44毒株、HPV-54毒株、HPV-61毒株、HPV-70毒株、HPV-72毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。

本发明提供了一种人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)检测和分型的方法及试剂盒，可检测出感染女性生殖道的所有HPV型别，包括14种高危型HPV和12种低危型HPV。本发明主要解决了现有的检测方法中不能对感染的HPV进行分型，或者因为交叉反应造成的分型不准确的技术问题，从而提供了一种准确、灵敏度高且经济实用的检测方法，适用于临床HPV检测和大规模人群HPV筛查使用。

本发明提供的试剂可用于检测待测样本中是否含有人乳头瘤病毒，方法如下：

(1)以待测样本的基因组DNA为模板，用引物组合物甲中的序列1至序列18所示DNA同时进行PCR扩增，用序列表的序列19作为测序引物将PCR扩增产物进行测序，如果得到测序结果，根据与现有毒株靶序列的同源性判断待测样本中含有哪种人乳头瘤病毒(同源性95％以上，可判断为相应毒株)，如果无法得到测序结果，进行步骤(2)；

(2)以待测样本的基因组DNA为模板，用引物组合物乙中的每对引物分别进行PCR扩增，将每对引物中的上游引物作为测序引物将PCR产物进行测序，根据测序结果与现有毒株靶序列的同源性判断待测样本中含有哪种人乳头瘤病毒(同源性95％以上，可判断为相应毒株)。

使用本发明的试剂检测HPV具有以下优点：(1)适用于各种型别的HPV病毒检测，包括常见的高危型HPV-16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68以及低危型HPV-6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81和CP6108等；(2)检测灵敏度高，对于症状≥高度鳞状内上皮细胞病变(HSIL)，本发明的检测灵敏度为90.5％；(3)准确性好，由于结果判读是由测序仪完成，所以不易受个人主观因素影响，使结果更加准确，客观；(4)通量大，一台3730xl测序仪一次可进行96个样品的序列分析，耗时1.5-2小时；(5)成本低，一个样品的检测成本在50元人民币左右，远低于临床上常用的HC2方法。

附图说明(图1至31中，Query为测序结果，Sbjct为NCBI的序列)

图1为临床样本1的测序峰图和比对结果；

图2为临床样本2的测序峰图和比对结果；

图3为临床样本3的测序峰图和比对结果；

图4为临床样本4的测序峰图和比对结果；

图5为临床样本5的测序峰图和比对结果；

图6为临床样本6的测序峰图和比对结果；

图7为临床样本7的测序峰图和比对结果；

图8为临床样本8的测序峰图和比对结果；

图9为临床样本9的测序峰图和比对结果；

图10为临床样本10的测序峰图和比对结果；

图11为临床样本11的测序峰图和比对结果；

图12为临床样本12的测序峰图和比对结果；

图13为临床样本13的测序峰图和比对结果；

图14为临床样本14的测序峰图和比对结果；

图15为临床样本15的测序峰图和比对结果；

图16为临床样本16的测序峰图和比对结果；

图17为临床样本17的测序峰图；

图18为临床样本18的测序峰图；

图19为HPV-16特异引物对临床样品17的测序峰图和比对结果；

图20为HPV-18特异引物对临床样品17的测序峰图和比对结果；

图21为HPV-16特异引物对临床样品18的测序峰图和比对结果；

图22为HPV-52特异引物对临床样品18的测序峰图和比对结果；

图23为HPV-58特异引物对临床样品18的测序峰图和比对结果；

图24为HPV-31特异引物对混合样本的测序峰图和比对结果；

图25为HPV-33特异引物对混合样本的测序峰图和比对结果；

图26为HPV-35特异引物对混合样本的测序峰图和比对结果；

图27为HPV-39特异引物对混合样本的测序峰图和比对结果；

图28为HPV-51特异引物对混合样本的测序峰图和比对结果；

图29为HPV-56特异引物对混合样本的测序峰图和比对结果；

图30为HPV-66特异引物对混合样本的测序峰图和比对结果；

图31为HPV-68特异引物对混合样本的测序峰图和比对结果；

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、引物组合物甲和引物组合物乙的设计

一、引物组合物甲

HPV已发现了100多个型别，不同型别之间序列上存在约10％的碱基差异。由于HPVL1基因序列相对保守，所以可以针对一致性较好的区域设计通用引物，同时对多个亚型进行扩增。引物组合物甲由表1所列的19条引物组成，各引物单独包装。序列1至序列5所示DNA为正向通用引物；序列6至序列18所示DNA为反向通用引物。序列19所示DNA为测序通用引物。

表1引物组合物甲中各条引物的核苷酸序列

二、引物组合物乙

基于高危型HPV感染对临床诊断具有指导意义，选取了12对特异性引物HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-51，HPV-52，HPV-56，HPV-58，HPV-66，HPV-68对混合感染的样品进行扩增，从而弥补了通用引物不能对多重感染的样品进行分型的不足。同时，选取的12对引物针对中国人群中常见的12种高危型进行分析，可以最大限度的减少对低危型和其他型别的分析，更好的降低成本。引物组合物乙由表2所列的24条引物组成，各个引物单独包装。序列20所示DNA和序列21所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-16型毒株特异引物对。序列22所示DNA和序列23所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-18型毒株特异引物对。序列24所示DNA和序列25所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-31型毒株特异引物对。序列26所示DNA和序列27所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-33型毒株特异引物对。序列28所示DNA和序列29所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-35型毒株特异引物对。序列30所示DNA和序列31所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-39型毒株特异引物对。序列32所示DNA和序列33所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-51型毒株特异引物对。序列34所示DNA和序列35所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-52型毒株特异引物对。序列36所示DNA和序列37所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-56型毒株特异引物对。序列38所示DNA和序列39所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-58型毒株特异引物对。序列40所示DNA和序列41所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-66型毒株特异引物对。序列42所示DNA和序列43所示DNA组成人乳头瘤病毒HPV-68型毒株特异引物对。

表2引物组合物乙中各条引物的核苷酸序列

序列编号	引物序列(5’--3’)	用途
			序列20	CACAGACGACTATCCAGCGA	HPV-16正向引物和测序引物
序列21	CGCCAGTAATGTTGTGGATG	HPV-16反向引物
			序列22	CACTTCACTGCAAGACATAGA	HPV-18正向引物和测序引物
序列23	GTTGTGAAATCGTCGTTTTTCA	HPV-18反向引物
			序列24	GAAATTGCATGAACTAAGCTCG	HPV-31正向引物和测序引物
序列25	CACATATACCTTTGTTTGTCAA	HPV-31反向引物
			序列26	ACTATACACAACATTGAACTA	HPV-33正向引物和测序引物
序列27	GTTTTTACACGTCACAGTGCA	HPV-33反向引物
			序列28	CAACGAGGTAGAAGAAAGCATC	HPV-35正向引物和测序引物
序列29	CCGACCTGTCCACCGTCCACCG	HPV-35反向引物

序列30	GACGACCACTACAGCAAACC	HPV-39正向引物和测序引物
			序列31	TTATGAAATCTTCGTTTGCT	HPV-39反向引物
序列32	GAGTATAGACGTTATAGCAGG	HPV-51正向引物和测序引物
			序列33	TTTCGTTACGTTGTCGTGTACG	HPV-51反向引物
序列34	TAAGGCTGCAGTGTGTGCAG	HPV-52正向引物和测序引物
			序列35	CTAATAGTTATTTCACTTAATGGT	HPV-52反向引物
序列36	GTGTGCAGAGTATGTTTATTG	HPV-56正向引物和测序引物
			序列37	TTTCTGTCACAATGCAATTGC	HPV-56反向引物
序列38	GTAAAGTGTGCTTACGATTGC	HPV-58正向引物和测序引物
			序列39	GTTGTTACAGGTTACACTTGT	HPV-58反向引物
序列40	TTCAGTGTATGGGGCAACAT	HPV-66正向引物和测序引物
			序列41	AAACATGACCCGGTCCATGC	HPV-66反向引物
序列42	GCAGAAGGCAACTACAACGG	HPV-68正向引物和测序引物
			序列43	GTTTACTGGTCCAGCAGTGG	HPV-68反向引物

实施例2、用于检测人乳头瘤病毒的试剂的制备

用于检测人乳头瘤病毒的试剂由实施例1设计的引物组合物甲、引物组合物乙和质控引物对组成。质控引物对用于扩增β球蛋白基因(看家基因)，由序列44所示DNA和序列45所示DNA组成。序列44(β球蛋白正向引物)：5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’；序列45(β球蛋白反向引物)：5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’。

实施例3、实施例2制备的试剂的应用

一、应用实施例2制备的试剂检测待测样本中的人乳头瘤病毒

分别应用实施例2制备的试剂检测18个知情同意患者的TCT样本(知情同意患者的宫颈切片)，具体步骤如下：

1、DNA模板的制备

①取1ml临床样本加入1.5ml Eppendorf中，8000rpm离心1min，弃上清。

②加入细胞洗脱液(含137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)振荡均匀后，8000rpm离心1min，弃上清。

③加入100μl DNA提取液(10mM Tris-HCl溶液，pH＝7.4)，-80℃冻4-5个小时。

④将离心管置于沸水中煮沸10min。

⑤12,000rpm离心10min。

⑥将上清转移至一个新的Eppendorf管中，作为DNA模板。

2、DNA模板的质控

采用质控引物对，通过PCR扩增β球蛋白基因检验DNA提取的质量。

PCR反应体系(25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTPs(2.5mM)2μl，序列44所示DNA 0.75μl，序列45所示DNA 0.75μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，步骤1制备的DNA模板1μl，H₂O 17.8μl。

PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，DNA提取质量合格的样品在268bp处会有一条明亮的条带。

通过步骤2检测，质量合格的DNA模板进行步骤3，质量不合格DNA模板从新进行步骤1的提取和步骤2的质控。

3、将质量合格的DNA模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应体系(50μl)：10×Buffer 5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，引物混合物1(序列1至序列5所示DNA的浓度均为10μM)1μl，引物混合物2(序列6至序列18所示DNA的浓度均为10μM)1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，步骤1制备的DNA模板2μl，H₂O 36.75μl。

PCR循环条件：94℃10min；94℃30s、42℃30s、72℃45s，5个循环；94℃30s、64℃30s、72℃45s，30个循环；72℃5min。

4、取5μl PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收450bp大小的目的片段，采用序列19所示DNA作为测序引物用ABI BigDye Terminator试剂盒及ABI3730xl自动测序仪进行测序。

5、将各个测序结果与NCBI中的各个HPV各个毒株的序列进行比对，一致性大于95％，即可判断该样本含有该毒株。

临床样本1的PCR扩增产物的部分核苷酸序列(即PCR扩增产物去除前面和后面几十核苷酸的测序准确区域)如序列表的序列46所示，与GenBank ACCESSION NO.FJ006723)进行比对，同源性为100％。临床样本1的测序峰图和序列比对结果见图1。结果表明，临床样本1只含有一种HPV毒株，即HPV-16型毒株。

临床样本2的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列47所示，与GenBankACCESSION NO.X05015进行比对，同源性为99％。临床样本2的测序峰图和序列比对结果见图2。结果表明，临床样本2只含有一种HPV毒株，即HPV-18型毒株。

临床样本3的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列48所示，与GenBankACCESSION N O.J04353进行比对，同源性为99％。临床样本3的测序峰图和序列比对结果见图3。结果表明，临床样本3只含有一种HPV毒株，即HPV-31型毒株。

临床样本4的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列49所示，与GenBankACCESSION NO.M12732进行比对，同源性为99％。临床样本4的测序峰图和序列比对结果见图4。结果表明，临床样本4只含有一种HPV毒株，即HPV-33型毒株。

临床样本5的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列50所示，与GenBankACCESSION NO.X74477进行比对，同源性为99％。临床样本5的测序峰图和序列比对结果见图5。结果表明，临床样本5只含有一种HPV毒株，即HPV-35型毒株。

临床样本6的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列51所示，与GenBankACCESSION NO.M62849进行比对，同源性为99％。临床样本6的测序峰图和序列比对结果见图6。结果表明，临床样本6只含有一种HPV毒株，即HPV-39型毒株。

临床样本7的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列52所示，与GenBankACCESSION NO.M62877进行比对，同源性为99％。临床样本7的测序峰图和序列比对结果见图7。结果表明，临床样本7只含有一种HPV毒株，即HPV-51型毒株。

临床样本8的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列53所示，与GenBankACCESSION NO.X74481进行比对，同源性为99％。临床样本8的测序峰图和序列比对结果见图8。结果表明，临床样本8只含有一种HPV毒株，即HPV-52型毒株。

临床样本9的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列54所示，与GenBankACCESSION NO.X74483进行比对，同源性为99％。临床样本9的测序峰图和序列比对结果见图9。结果表明，临床样本9只含有一种HPV毒株，即HPV-56型毒株。

临床样本10的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列55所示，与GenBankACCESSION NO.D90400进行比对，同源性为99％。临床样本10的测序峰图和序列比对结果见图10。结果表明，临床样本10只含有一种HPV毒株，即HPV-58型毒株。

临床样本11的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列56所示，与GenBankACCESSION NO.U31794进行比对，同源性为98％。临床样本11的测序峰图和序列比对结果见图11。结果表明，临床样本11只含有一种HPV毒株，即HPV-66型毒株。

临床样本12的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列57所示，与GenBankACCESSION NO.EU918769进行比对，同源性为98％。临床样本12的测序峰图和序列比对结果见图12。结果表明，临床样本12只含有一种HPV毒株，即HPV-68型毒株。

临床样本13的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列58所示，与GenBankACCESSION NO.NC_001355进行比对，同源性为98％。临床样本13的测序峰图和序列比对结果见图13。结果表明，临床样本13只含有一种HPV毒株，即HPV-6型毒株。

临床样本14的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列59所示，与GenBankACCESSION NO.M14119进行比对，同源性为100％。临床样本14的测序峰图和序列比对结果见图14。结果表明，临床样本14只含有一种HPV毒株，即HPV-11型毒株。

临床样本15的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列60所示，与GenBankACCESSION NO.GQ472847进行比对，同源性为99％。临床样本15的测序峰图和序列比对结果见图15。结果表明，临床样本15只含有一种HPV毒株，即HPV-42型毒株。

临床样本16的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列61所示，与GenBankACCESSION NO.AJ620209进行比对，同源性为99％。临床样本16的测序峰图和序列比对结果见图16。结果表明，临床样本16只含有一种HPV毒株，即HPV-81型毒株。

临床样本17的测序峰图见图17、临床样本18的测序峰图见图18，均表现为套峰或交叉峰，说明样品为混合感染，即含有两种以HPV毒株，用通用引物结合测序无法获得具体核苷酸序列。

6、将无法获得核苷酸序列的DNA模板，分别采用如下引物对进行PCR扩增：人乳头瘤病毒HPV-16型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-18型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-31型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-33型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-35型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-39型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-51型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-52型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-56型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-58型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-66型毒株特异引物对；人乳头瘤病毒HPV-68型毒株特异引物对。

PCR反应体系(25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTPs(2.5mM)2μl，正向引物(10μM)0.75μl，反向引物(10μM)0.75μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，步骤1制备的DNA模板1μl，H₂O 17.8μl。

PCR循环条件：94℃10min；94℃30s、56℃30s、72℃45s，35个循环；72℃5min。

7、取5μl PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。采用ABI BigDye Terminator试剂盒及ABI3730xl自动测序仪进行测序。

采用人乳头瘤病毒HPV-16型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为457bp；采用人乳头瘤病毒HPV-18型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为322bp；采用人乳头瘤病毒HPV-31型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为263bp；采用人乳头瘤病毒HPV-33型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为398bp；采用人乳头瘤病毒HPV-35型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为358bp；采用人乳头瘤病毒HPV-39型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为280bp；采用人乳头瘤病毒HPV-51型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为223bp；采用人乳头瘤病毒HPV-52型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为229bp；采用人乳头瘤病毒HPV-56型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为181bp；采用人乳头瘤病毒HPV-58型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为274bp；采用人乳头瘤病毒HPV-66型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为172bp；采用人乳头瘤病毒HPV-68型毒株特异引物对PCR扩增的目标片段为333bp。

8、将各个测序结果与NCBI中的各个HPV各个毒株的序列进行比对，一致性大于95％，即可判断该样本含有该毒株。

临床样本17采用人乳头瘤病毒HPV-16型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列62所示，与GenBank ACCESSION NO.K02718进行比对，同源性为99％，测序峰图和序列比对结果见图19。临床样本17采用人乳头瘤病毒HPV-18型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列63所示，与GenBank ACCESSION NO.X05015进行比对，同源性为99％，测序峰图和序列比对结果见图20。临床样品17采用其它10个特异引物对没有得到测序结果。结果表明，临床样本17为HPV-16和HPV-18混合感染。

临床样本18采用人乳头瘤病毒HPV-16型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列64所示，与GenBank ACCESSION NO.K02718进行比对，同源性为99％，测序峰图和序列比对结果见图21。临床样本18采用人乳头瘤病毒HPV-52型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列65所示，与GenBank ACCESSION NO.X74481进行比对，同源性为98％，测序峰图和序列比对结果见图22。临床样本18采用人乳头瘤病毒HPV-58型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列66所示，与GenBank ACCESSION NO.D90400进行比对，同源性为97％，测序峰图和序列比对结果见图23。临床样品18采用其它9个特异引物对没有得到测序结果。结果表明，临床样本18为HPV-16、HPV-52和HPV-58混合感染。

二、应用实施例2制备的试剂检测混合样本中的人乳头瘤病毒

将临床样本3、临床样本4、临床样本5、临床样本6、临床样本7、临床样本9、临床样本11和临床样本12混合，作为混合样本。用混合样本制备DNA模板，方法同步骤一的1。将DNA模板进行步骤一的步骤6至8的实验操作。

混合样本采用人乳头瘤病毒HPV-31型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列67所示，与GenBank ACCESSION NO.J04353进行比对，同源性为100％，测序峰图和序列比对结果见图24。混合样本采用人乳头瘤病毒HPV-33型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列68所示，与GenBank ACCESSION NO.M12732进行比对，同源性为98％，测序峰图和序列比对结果见图25。混合样本采用人乳头瘤病毒HPV-35型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列69所示，与GenBankACCESSION NO.X74477进行比对，同源性为99％，测序峰图和序列比对结果见图26。混合样本采用人乳头瘤病毒HPV-39型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列70所示，与GenBank ACCESSION NO.M62849进行比对，同源性为100％，测序峰图和序列比对结果见图27。混合样本采用人乳头瘤病毒HPV-51型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列71所示，与GenBank ACCESSION NO.M62877进行比对，同源性为99％，测序峰图和序列比对结果见图28。混合样本采用人乳头瘤病毒HPV-56型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列72所示，与GenBank ACCESSIONNO.X74483进行比对，同源性为100％，测序峰图和序列比对结果见图29。混合样本采用人乳头瘤病毒HPV-66型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列73所示，与GenBank ACCESSION NO.U31794进行比对，同源性为100％，测序峰图和序列比对结果见图30。混合样本采用人乳头瘤病毒HPV-68型毒株特异引物对的PCR扩增产物的部分核苷酸序列如序列表的序列74所示，与GenBank ACCESSION NO.EU918769进行比对，同源性为99％，测序峰图和序列比对结果见图31。

实施例4、该检测方法的灵敏度分析

用实施例2制备的试剂对48例临床诊断表现为高度病变(HSIL)和26例临床表现为宫颈癌(SCC)的样品进行HPV检测，结果显示有67例样品中含有高危型HPV的感染，检测的灵敏度为90.5％。

Claims

1.用于辅助检测人乳头瘤病毒的试剂，包括引物组合物甲；所述引物组合物甲包括序列表的序列1至序列18所示的DNA。

2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述引物组合物甲由序列表的序列1至序列19所示的DNA组成。

3.如权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括引物组合物乙；所述引物组合物乙由序列表的序列20至序列43所示的DNA组成。

4.如权利要求1至3中任一所述的试剂，其特征在于：所述试剂由所述引物组合物甲、所述引物组合物乙和质控引物对组成；所述质控引物对由序列表的序列44所示DNA和序列表的序列45所示DNA组成。

5.如权利要求1至4中任一所述的试剂，其特征在于：所述人乳头瘤病毒为高危型毒株或低危型毒株；所述高危型毒株为HPV-16毒株、HPV-18毒株、HPV-31毒株、HPV-33毒株、HPV-35毒株、HPV-39毒株、HPV-45毒株、HPV-51毒株、HPV-52毒株、HPV-56毒株、HPV-58毒株、HPV-59毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所述低危型毒株为HPV-6毒株、HPV-11毒株、HPV-40毒株、HPV-42毒株、HPV-43毒株、HPV-44毒株、HPV-54毒株、HPV-61毒株、HPV-70毒株、HPV-72毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。

6.权利要求1至5中任一所述试剂在制备辅助检测人乳头瘤病毒的试剂盒中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述人乳头瘤病毒为高危型毒株或低危型毒株；所述高危型毒株为HPV-16毒株、HPV-18毒株、HPV-31毒株、HPV-33毒株、HPV-35毒株、HPV-39毒株、HPV-45毒株、HPV-51毒株、HPV-52毒株、HPV-56毒株、HPV-58毒株、HPV-59毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所述低危型毒株为HPV-6毒株、HPV-11毒株、HPV-40毒株、HPV-42毒株、HPV-43毒株、HPV-44毒株、HPV-54毒株、HPV-61毒株、HPV-70毒株、HPV-72毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。

8.一种辅助检测人乳头瘤病毒的试剂盒，包括权利要求1至5中任一所述的试剂。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述人乳头瘤病毒为高危型毒株或低危型毒株；所述高危型毒株为HPV-16毒株、HPV-18毒株、HPV-31毒株、HPV-33毒株、HPV-35毒株、HPV-39毒株、HPV-45毒株、HPV-51毒株、HPV-52毒株、HPV-56毒株、HPV-58毒株、HPV-59毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所述低危型毒株为HPV-6毒株、HPV-11毒株、HPV-40毒株、HPV-42毒株、HPV-43毒株、HPV-44毒株、HPV-54毒株、HPV-61毒株、HPV-70毒株、HPV-72毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。

10.权利要求1至5中任一所述的试剂在辅助鉴定人乳头瘤病毒中的应用；所述人乳头瘤病毒为高危型毒株或低危型毒株；所述高危型毒株为HPV-16毒株、HPV-18毒株、HPV-31毒株、HPV-33毒株、HPV-35毒株、HPV-39毒株、HPV-45毒株、HPV-51毒株、HPV-52毒株、HPV-56毒株、HPV-58毒株、HPV-59毒株、HPV-66毒株或HPV-68毒株；所述低危型毒株为HPV-6毒株、HPV-11毒株、HPV-40毒株、HPV-42毒株、HPV-43毒株、HPV-44毒株、HPV-54毒株、HPV-61毒株、HPV-70毒株、HPV-72毒株、HPV-81毒株或CP6108毒株。