CN101326293A - 使用核酸扩增法检测人乳头瘤病毒的方法和核酸链固定化载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增用核酸引物。本发明还提供了检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其包括在LAMP反应中通过使用多条引物扩增样本中的核酸链的步骤，其中所述多条引物包括选自根据本发明的核酸引物中的至少一条引物；以及在扩增反应后检测扩增产物的存在并鉴定它们的基因型的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的核酸引物序列、试剂盒、和核酸链固定化载体，并涉及通过使用核酸扩增法检测人乳头瘤病毒的方法。
背景技术
在1980年代，据报道人乳头瘤病毒(HPV)感染是引起子宫颈癌的原因，并且特别引人注意的是癌恶性度和HPV基因型之间的关系。也认为HPV是引起非子宫颈癌的其它癌的原因，其中所述其它癌如生殖器癌和口腔粘膜癌，因此需要快速且正确地检测HPV的方法。至今为止，已知通过使用DNA/RNA识别抗体检测恶性或良性基因型的方法、以及通过聚合酶链反应(PCR)扩增包含对于基因型而言特征性序列的区域并最后通过使用基因型特异的探针鉴定基因型的方法。但是不能鉴定基因型的前一方法不能应用至当前开发的用于疫苗施用的检测。另外，使用PCR法的后一方法也有缺点，如核酸提取等预处理的繁锁操作、需要复杂的温度调节设备如热循环仪、和较长的两小时或更长的反应期间。此外，PCR法有这样一种可能性，如果偶然合成了不正确的互补链，该产物可用作扩增中的模板，结果导致不正确的判断。实际上，难于控制在引物末端仅有一个核苷酸差异的特异性扩增。
对于通过使用DNA芯片的检测，通过PCR法扩增的基因产物通常为双链。因此，出现了互补链成为探针的竞争物的问题，降低了在杂交反应中使用探针的杂交效率和检测灵敏性。因此，例如，采用了分解或分离互补链的方法，使得靶基因产物成为单链。但是，这些方法仍有问题，如由于使用酶和磁珠产生的较高的成本和复杂的操作，需要替代这些常规方法的新方法。
发明公开
本发明的一个目的是：当应用允许简便且快速地检测核酸的LAMP法的原理时，提供用于检测存在于LAMP扩增产物中的HPV核苷酸序列的核酸引物，以及使用所述核酸引物的HPV检测方法。
本发明应用了不同于PCR法的方法即LAMP法来鉴定HPV基因型。因此，可能易于鉴定基因型。但是，LAMP产物具有复杂的高级结构，在杂交中使用结合有探针的支持物引起物理阻碍，这接下来导致降低杂交效率(参见如JP-A 2005-095043(KOKAI))。因此，在本发明中，如此设计引物，使得衍生自人乳头瘤病毒的靶序列位于LAMP产物的单链环区，这与现有技术不同。
根据本发明的一个方面，提供了用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增用核酸引物，所述核酸引物选自以下的(a)-(f)：(a)核酸引物，其在同一链上含有选自表1中所示第一序列组的序列的互补序列和选自表2中所示第二序列组的序列；(b)核酸引物，其在同一链上含有选自第一序列组的序列的互补序列和选自表3中所示第三序列组的序列；(c)核酸引物，其在同一链上含有选自第二序列组的序列的互补序列和选自第三序列组的序列；(d)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交；(e)核酸引物，其含有选自表4中所示第四序列组的序列或其互补序列；和(f)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(e)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(e)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
根据本发明的另一方面，提供了检测人乳头瘤病毒并鉴定其基因型的方法，包括在LAMP反应中通过使用多条引物扩增样本中的核酸链的步骤和在扩增反应后检测扩增产物的存在并鉴定它们的基因型的步骤，其中所述多条引物包括选自上述核酸引物中的至少一条引物。
根据本发明的又一方面，提供了核酸链固定化支持物，其携带有固定的用于检测人乳头瘤病毒LAMP扩增产物的人乳头瘤病毒特异的或基因型特异的核酸链。优选地，固定的核酸链是：(g)核酸探针，其含有选自表5中所示第五序列组的序列或其互补序列，或(h)核酸探针，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(g)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(g)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
附图简述
图1是显示常规LAMP法中的扩增方法的示意图；
图2是显示通过常规LAMP法获得的扩增产物的示意图；
图3是显示制备本发明的测定用核酸中的扩增方法的示意图；
图4是显示本发明的测定用核酸的示意图；
图5是阐述用于鉴定HPV基因型的DNA芯片的一个例子的图示；
图6是阐述用于鉴定HPV基因型的DNA芯片的另一个例子的图示；
图7是显示LAMP扩增后的电泳照片的一个例子的图；
图8是显示LAMP扩增后的电泳照片的另一个例子的图；
图9包括显示通过电流检测型DNA芯片检测的结果的例子的图示；
图10包括显示LAMP扩增后的电泳照片的例子的图示；以及
图11是显示HPV序列和可用作本发明的引物或探针的区域的图。
实施发明的最佳模式
本发明中所用的扩增法“LAMP法”是一种等温聚合酶链反应，使用4种或6种引物。据报道LAMP法在扩增效率上高于PCR法并且也抗样本中的杂质的影响。因此可以通过简单预处理样本而容易地检测小量的人乳头瘤病毒。
在LAMP法中的引物设计和获得的扩增产物参照图1和图2描述。图1显示了待检测的双链DNA。通常地，靶序列位于LAMP扩增产物的茎环结构的中央(图2)。在扩增和检测靶序列时，从位于靶序列两侧的序列确定总共四种引物序列(FIP、F3、BIP、和B3引物)。每一FIP和BIP引物含有两个区域(FIP＝F1c+F2，BIP＝B2+B1c)。用于这些引物中的总共6个区域下文中称为引物区。通过使用这四种引物的LAMP扩增产生图2中所示的具有亚铃型茎环结构的扩增产物，每一扩增产物互补于图1所示的DNA的每一链。在此不对扩增机制进行描述，但可参考例如JP-A2002-186781(KOKAI)。
另一方面，在本发明中，如此设计引物，使得靶序列位于单链环区中，而不是像图2中所示的常规的靶序列位点。具体地，如图3中所示，在本发明中，如此放置6个引物区，使得靶序列(图3中的任一FPc、FP、BP、和BPc)位于引物区F1和F2之间(包括F2区)，位于引物区F2c和F1c之间(包括F2c区)，位于引物区B1和B2之间(包括B2区)，和/或位于引物区B2c和B1c之间(包括B2c区)。靶序列可位于上述区域之间形成的任一单链环区，并且因此在引物区F1和F2之间的环区包括F2区。基于由此确定的6个引物区制备四种引物，并通过使用这些引物进行LAMP扩增而获得图4所示的LAMP扩增产物的一部分。在LAMP扩增产物中，靶序列FPc、FP、BP、和BPc位于扩增产物的亚铃结构中的单链环中。另一方面，引物区F1c和F1以及引物区B1c和B1本来就具有互补序列，并因此通过相互地自身杂交形成双链。在扩增产物中含有的一些靶序列如图4所示为单链状态。因此，可以无需变性操作而如图中所示，通过与分别的靶序列互补的探针核酸(FP、FPc、BP、和BPc)的特异性杂交而检测靶序列。术语“特异性杂交”是指可以检测由于单核苷酸多态性(SNP)或如果存在突变所引起的轻微的差异。
本发明通过将此种引物结构应用至HPV病毒而检测HPV病毒的基因型。
图11所示的序列是HPV病毒序列。已知在该图中含有SEQ ID No 1、2和3的区域在许多HPV病毒中是保守的。另外，SEQ ID No.4显示了其中已知在恶性和良性肿瘤之间存在多态性的区域。为了检测HPV病毒的基因型，例如通过使用对应于SEQ ID No.4的区域的序列作为靶序列而检测多态性。在此种情况下，使用例如选自第一序列组(表1)和第二序列组(表2)的序列，或者使用例如选自第一序列组和第三序列组(表3)的序列作为对应于引物区F1和F2的序列。第一序列组、第二序列组和第三序列组为下表1至3中所示的序列组，并分别对应于图11中SEQ ID No.1、2和3的区域。在这些区域中的序列根据其病毒类型不同而不同，并且不总是与图11中所示序列相同。此外，在实际的LAMP扩增中还需要由BIP和B3引物组成的引物组。也可使用图11中的SEQ ID No.5和6的序列或其互补序列。本发明的引物优选地使用这样的引物，其在从5′至3′方向的同一链上，具有相互连接的选自第一序列组的序列的互补序列和选自第二序列组的序列，具有相互连接的选自第二序列组的序列和选自第一序列组的序列的互补序列，具有相互连接的选自第一序列组的序列的互补序列和选自第三序列组的序列，具有相互连接的选自第三序列组的序列和选自第一序列组的序列的互补序列，具有相互连接的选自第二序列组的序列的互补序列和选自第三序列组的序列，具有相互连接的选自第三序列组的序列和选自第二序列组的序列的互补序列，具有选自第四序列组的序列(表4)，或者具有选自第四序列组的序列的互补序列。互补序列包括严格互补的序列和在严格条件下能够杂交至上述序列组的序列。通常地在此种条件下，90至95％的序列同源性似乎足以进行杂交反应。此种严格条件对本领域技术人员是显然的，并且为例如，20℃至65℃的温度，2×SSC缓冲液，和0.1％w/vSDS。尤其有利的是温度至少65℃，0.1×SSC缓冲液，和0.1％w/v SDS的高严格条件。另外，序列可以是在SEQ ID No.1、2和3或其互补链的至少一条链中具有一个或多个核苷酸(如1至5个核苷酸)被替换、缺失或插入的序列。但是，这些替换、缺失或插入的序列为可以分别与未替换、未缺失或未插入的序列的互补链在严格条件下杂交的序列。此外，SEQ IDNo.1，2和3及其互补链的至少之一可以是1至5个核苷酸的混合核苷酸序列，或者SEQ ID No.1，2和3及其互补链的至少之一可以是1至5个核苷酸的通用核苷酸序列。所使用的通用核苷酸的例子包括可自GrenResearch公司获得的脱氧肌苷(dI)、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、脱氧核糖呋喃糖基(dP)、脱氧-5′-二甲氧基三苯甲基-D-核糖呋喃糖基(dK)。对本领域技术人员显而易见的是在本发明的引物中，这些引物区可相互直接连接或通过间隔区连接。引物的各序列间或末端侧可存在约1至100个核苷酸，优选地2至30个核苷酸的序列(间隔区)。核酸引物的长度为约15至200个核苷酸，优选地20至100个核苷酸，且更优选地40至60个核苷酸。
在用于检测本发明的HPV病毒基因型的引物中，可以仅通过使用序列组1至3中序列的组合或序列组4中的序列作为对应于引物区F1和F2、或者B1和B2的序列来扩增多态性区域。因此可以使用探针检测在LAMP扩增产物中含有的SEQ ID No.4中存在的多态性。因此，位于用LAMP引物扩增的产物的亚铃结构的单链环中的靶序列FPc、FP、BP、或BPc对应于SEQ ID No.4的序列。
用具有引物区F1和F2的结构的上述引物通过LAMP法扩增含有HPV的样本，如图4中所示，可以获得在具有茎环结构的扩增产物的单链环结构中含有的衍生自HPV的靶序列(即对应于SEQ ID No.4的区域中的序列)。
扩增反应可以通过每一试管一引物组实施，或者通过每一试管用于多个基因型的多引物组实施。使用后一方法更有效地用于同时鉴定多个基因型。
使用例如具有互补于SEQ ID No.4的序列的探针核酸(FP，FPc，BP，和BPc)检测扩增产物。通过使用被如荧光色素(荧光素，罗丹明，FITC，FAM，TET，JOE，VIC，MAX，ROX，HEX，TAMRA，Cy3，Cy5，德克萨斯红等)，淬灭剂(TAMRA，掩蔽剂(Eclipse)，Dabcyl，胶体金等)，电子自旋材料和金属复合体(钌，钴，铁等)标记的核酸探针实施均相杂交。经常使用例如分子信标、荧光共振能量转移技术(FRET)和电子自旋共振(ESR)技术用于使用标记探针的均相杂交。侵入物(invader)和焦磷酸测序(pyrosequenching)技术也用于无标记的均相杂交。不特别地限定用于LAMP产物的均相杂交测定法。探针核酸可固定在固体支持物的表面用于多相杂交，并且一般使用DNA芯片，但是可使用在另一微阵列上的探针。如上所述，SEQ ID No.4的区域为多态性区域，并且因此可以根据欲检测的多态性来改变用于检测扩增产物的探针核酸。
用于本发明的核酸探针序列优选地是具有这样的序列的核酸探针，所述序列含有选自第五序列组(表5)的序列或选自第五序列组的序列的互补序列，或者选自第五序列组的序列或其互补序列的且其中一个或多个核苷酸被替换、缺失或插入的序列。也可使用Kleter等人，J.Clin.Microbiol.，37，2508-17(1999)；Vernon等人，BMC Infectious Diseases，3：12(2003)；JP-A 09-509062(KOKAI)等中所述的序列。也不特别地限定核酸探针的结构，也可以使用DNA、RNA、PNA、LNA、磷酸甲酯骨架核酸和其它合成的核酸链。此外，也可使用其嵌合核酸。也可导入官能团如氨基、巯基或生物素，用于将核酸探针固定在固体支持物上，也可额外地在官能团和核苷酸之间导入间隔区。不特别地限制文中使用的间隔区的类型，并且例如可以使用链烷或乙二醇骨架。用于本发明的通用核苷酸包括可获自GrenResearch公司的脱氧肌苷(dI)、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、脱氧核糖呋喃糖基(dP)、和脱氧-5′-二甲氧基三苯甲基-D-核糖呋喃糖基(dK)等。
不特别限制用于本发明的检测方法，其例子包括使用浊度、可见光、荧光、化学发光、电化学发光、化学荧光、荧光能量转移、ESR等的光学方法，以及使用电特性如电流、电压、频率、传导性或电阻的电学方法。
不特别限定本发明使用的用于固定核酸探针的支持物，并且其例子包括粒子(如树脂珠、磁珠、金属微粒子和胶体金)、板(如微量滴定板、玻璃板、硅板、树脂板、电极板和膜)等。
不特别限制本发明使用的用于支持物的原材料，并且其例子包括能透过的材料如多孔材料和膜，以及不能透过的材料如玻璃和树脂。支持物材料的典型例子包括无机绝缘材料如玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石、碳化硅、氧化硅和四氮化三硅，以及有机材料如聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和的聚脂、含氟树脂、聚氯乙烯、多氯化乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸类树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚树脂、脲树脂、环氧树脂、蜜胺树脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、有机硅树脂、聚苯醚、聚砜、聚乙二醇、琼脂、丙烯酰胺、硝酸纤维素、尼龙和胶乳。
其上固定有核酸链的支持物表面可例如使用电极材料制成。不特别限制电极材料，但是其例子包括纯金属如金、金的合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓和钨，及其合金；碳材料如石墨和玻璃化炭黑；以及它们的氧化物和化合物。其它例子包括半导体化合物如氧化硅，和多种半导体设备如CCD、FET和CMOS。可通过铺板、印刷、喷镀、蒸汽淀积等制备电极。在蒸汽淀积时，通过电阻加热法、高频加热法、或电子束加热法可形成电极膜。在喷镀时，通过DC两极喷镀、偏置喷镀、非对称AC喷镀、吸气喷镀或高频喷镀可形成电极膜。也可使用电解聚合膜如聚吡咯或聚苯胺或者使用导电性聚合物。不特别限定用于绝缘除电极以外的部分的材料，但优选地为光敏聚合物或光敏抗蚀剂(photoresist)材料。使用的抗蚀材料包括光辐射用光敏抗蚀剂、远紫外线用光敏抗蚀剂、X射线辐射用光敏抗蚀剂和电子束辐射用光敏抗蚀剂。光辐射用光敏抗蚀剂的例子包括含有环化橡胶、聚肉桂酸或酚醛清漆树脂作为主要原材料的光敏抗蚀剂。将环化橡胶、酚树脂、聚甲基异丙烯基酮(PMIPK)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等用作远紫外用光敏抗蚀剂。任一COP、金属丙烯酸盐、以及在薄膜手册(Thin Film Handbook，Ohmsha出版)中所述的物质可用作X射线用抗蚀剂。进一步地，在上述文献中记载的物质如PMMA可用作电子束用抗蚀剂。希望所使用的抗蚀剂(resist)具有或更大和1mm或更小的厚度。通过使用光敏抗蚀剂包覆电极并进行平版印刷可使面积一定。从而可使在电极间固定的DNA探针的量均一，并使得可实施再现性好的测定。一般在最后移除抗蚀材料，但也可不移除而使用抗蚀材料作为电极的一部分用于基因检测。在此种情况下，需要使用耐水性高的物质作为抗蚀材料。对于电极上形成的绝缘层，也可使用非光敏抗蚀剂材料的材料。其例子包括金属如Si、Ti、Al、Zn、Pb、Cd、W、Mo、Cr、Ta和Ni的氧化物、氮化物和碳化物，以及其合金。将所述材料例如通过喷镀、蒸汽淀积或CVD形成薄膜后，通过光刻法对电极暴露区制作图案，调节面积为一个特定值。也可在单个芯片上排布若干个电极单位并固定不同的探针来制备允许同时检测若干种靶的电极。也可在单个芯片上排布若干个电极单位并固定相同的探针来制备允许同时检测多个样本的电极。在此种情况下，事先通过光刻法在基板上对多个电极制作图案。此时为了防止邻近的电极接触，形成分离单个电极的绝缘膜是有效的。绝缘膜的厚度优选地约0.1至100微米。
不特别限定本发明中待分析的样本，其例子包括血液、血清、白细胞、尿、粪、精液、唾液、阴道液、组织、活组织检查样本、口粘膜、培养的细胞、咳痰等。自这些样本提取核酸成分。不特别限制提取方法，其例子包括液液提取，例如用酚-氯仿，以及使用载体的固液提取。此外，可使用市售的核酸提取试剂盒如QIAamp(QIAGEN制备)或Sumai测试(Sumitomo Metal Industries制备)。通过LAMP法扩增所制备的核酸成分，并将扩增产物与固定在电极上的探针杂交用于基因检测。在离子强度为0.01至5且pH为5至10的缓冲液中实施反应。可向溶液中添加其它添加物如杂交促进剂硫酸葡聚糖、鲑精DNA、牛胸腺DNA、EDTA和表面活性剂。向其添加扩增产物。备选地，可通过将溶液滴加至基板上实施杂交。在反应期间可例如通过搅拌或振荡来加快反应。反应温度优选地为10℃至90℃，并且反应期间为约1分钟或以上至过夜。杂交反应后，分离电极并洗涤。离子强度为0.01至5且pH为5至10的缓冲液用于洗涤。
可通过用荧光染料如FITC、Cy3、Cy5或罗丹明；生物素、半抗原、酶如氧化酶或磷酸酶、或者电化学活性物质如二茂铁或醌检测所提取的核酸样本，或者可通过使用事先用上述物质标记的第二探针检测。
例如当使用电化学活性的DNA结合物质检测时，以如下方式分析核酸成分。首先洗净基板，允许选择性结合至电极表面形成的双链区的DNA结合物质反应，并且电化学地分析基板。不特别地限定所使用的DNA结合物质，其例子包括Hoechst 33258、吖啶橙、喹吖因、道诺霉素、金属嵌入剂、双嵌入剂如双吖啶、三嵌入剂、和多嵌入剂。此外，可用电化学活性金属复合体如二茂铁或紫精(viologen)修饰这些嵌入剂。DNA结合物质的浓度根据其种类的不同而不同，但通常在1ng/ml至1mg/ml的范围。使用离子强度在0.001至5的范围和pH在5至10的范围的缓冲液。在与DNA结合物质反应后，洗电极并进行电化学分析。通过包括参照电极、对电极和作用电极的三电极分析仪或通过包括对电极和作用电极的二电极分析仪进行电化学测定。在测定期间，所应用的电压足够高以至于引起DNA结合物质的电化学反应，并且测定源自DNA结合物质的反应电流。电压可线性变化，或可以脉冲形式施加或者以恒定电压施加。在测定期间，通过使用装置如恒电位仪、数字万用表或函数发生器(function generator)控制电流和电压。使用标准曲线，自测定的电流值计算靶基因的浓度。使用基因检测电极的基因检测装置包括基因提取单元、基因反应单元、DNA结合物质反应单元、电化学测定单元、洗净单元等。
通过使用本发明的方法，可以诊断人乳头瘤病毒感染。
因此，提供了诊断人乳头瘤病毒感染的方法，所述方法包括：
自人获得样本；
从样本提取核酸成分；
使用多条引物，在LAMP反应中扩增样本中的核酸链的步骤，其中所述多条引物包括选自上述核酸引物的至少一条引物；以及
在扩增反应后分析是否有扩增产物的步骤，其中
存在扩增产物表明人乳头瘤病毒感染。
也提供了诊断人乳头瘤病毒感染的方法，所述方法包括：
自人获得样本；
从样本提取核酸成分；
使用多条引物，在LAMP反应中扩增样本中的核酸链的步骤，其中所述多条引物包括选自上述核酸引物的至少一条引物；以及
在扩增反应后分析是否有扩增产物或鉴定病毒的基因型的步骤，其中
存在扩增产物导致对人乳头瘤病毒感染的诊断。
此外，本发明提供了用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增试剂盒。LAMP扩增试剂盒含有选自下列(a)-(f)的核酸引物和额外地对LAMP扩增反应所需的任何其它成分如聚合酶、dNTPs、甜菜碱、缓冲剂、阳性对照DNA和无菌水：
(a)核酸引物，其在同一链上含有选自表1中所示第一序列组的序列的互补序列和选自表2中所示第二序列组的序列；
(b)核酸引物，其在同一链上含有选自第一序列组的序列的互补序列和选自表3中所示第三序列组的序列；
(c)核酸引物，其在同一链上含有选自第二序列组的序列的互补序列和选自第三序列组的序列；
(d)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交；
(e)核酸引物，其含有选自表4中所示第四序列组的序列或其互补序列；和
(f)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(e)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(e)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
此外，本发明提供了用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的检测试剂盒。检测试剂盒包括上述的LAMP扩增试剂盒和用于检测通过使用该LAMP扩增试剂盒扩增的人乳头瘤病毒LAMP扩增产物的、其上携带有固定的核酸链的支持物，所述固定的核酸链是：
(g)核酸探针，其含有选自表5中所示第五序列组的序列或其互补序列，或
(h))核酸探针，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(g)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(g)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。可将核酸探针固定在支持物的表面上，并且支持物和支持物表面是使用上述材料制备的。
实施例
下面，通过对应于引物区的序列，即第一序列组、第二序列组、第三序列组、和第四序列组中的序列的一般的例子示于下表中。
表1 代表性的核酸引物序列
表2
表3
表4
此外，对应于核酸探针的第五序列组中的序列的一般例子显示如下。
表5
此后，参照实施例具体描述根据本发明的核酸检测方法。
(1)合成的寡核苷酸
组合上述表1所述的序列，制备用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的核酸引物。具体而言，分别直接连接或通过间隔区连接第一序列组和第二序列组中的序列、第一序列组和第三序列组中的序列、或者第二序列组中序列的互补序列和第三序列组中的序列。另外，制备第四序列组中的序列或其互补序列。可使用本领域技术人员已知的任一方法制备引物。
(2)LAMP反应液
LAMP反应液具有下表6中所示组分。所使用的模板为含有克隆的HPV16的质粒DNA。
表6
| 试剂 | 体积 |
| 无菌超纯水 | 1.5μL |
| BstDNA聚合酶 | 1μL |
| 缓冲剂 | 12.5μL |
| Tris HCl(pH8.0) | 40mM |
| KCl | 20mM |
| MgSO4 | 16mM |
| (NH4)2SO4 | 20mM |
| 吐温20 | 0.2％ |
| 甜菜碱 | 1.6M |
| dNTP | 2.8mM |
| F3引物(10μM) | 0.5μL |
| B3引物(10μM) | 0.5μL |
| FIP引物(10μM) | 4μL |
| BIP引物(10μM) | 4μL |
| 模板(克隆的HPV16) | 1μL |
| 总计 | 25μL |
此外，同时使用下表7所示的用于LAMP扩增反应的核酸引物。
表7 用于LAMP扩增的核酸引物序列
(3)通过LAMP法的核酸扩增
在温度为58℃实施核酸扩增1小时。添加无菌水而非模板的样本用作阴性对照。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的LAMP产物显示LAMP产物特征性的梯状模式。另外，对不含模板DNA的样本没有观察到扩增。因此，可以通过使用所选的引物组进行乳头瘤病毒的序列特异性扩增。
(4)制备固定有核酸探针的载玻片(图5)
将DNA探针1-5固定在载玻片6上。它们的核酸序列示于表8-1。
表8-1探针序列
| 名称 | SEQ ID No. | 互补序列(5’→3’) |
| HPV16 | 7 | TCTGAAGTAGATATGGCAGCACATAATGAC |
| HPV18 | 8 | TGCCCAGGTACAGGAGACTGTGTAGAAGCA |
| HPV26 | 9 | AGTGGATGCAGATGCTGCAGATAATGTACT |
| HPV31 | 10 | GTATCACTGTTTGCAATTGCAGCACAAACA |
| rDNA | 11 | CTGGACGAAGACTGACGCTC |
＊末端通过氨基修饰。
HPV16至31用作HPV亚型特异的序列，而rDNA用作阴性对照。每一探针在末端用氨基修饰，并通过将探针溶液点在碳二亚胺处理的载玻片基板上而固定在其上。最后，用超纯水洗基板并风干，制备出DNA芯片。
(5)LAMP产物与核酸探针的杂交
上述(3)中扩增的LAMP产物用作核酸样本。将上述(4)制备的DNA芯片浸入添加有2×SSC盐的LAMP产物溶液中并在35℃杂交60分钟。接下来，向其添加Cy5-标记的SEQ ID No.7的核酸，将混合物在35℃放置15分钟后，用超纯水轻轻洗涤。使用Amersham公司生产的Tyhoon检测荧光强度。
(6)结果
荧光测定显示仅在固定有HPV16探针的点上有显著的发射，表明可序列特异性地检测通过LAMP反应扩增的核酸。
(7)制备固定有核酸探针的电极(图6)
将DNA探针7-11固定在置于支持物12上的电极13。它们的核酸序列如表8-2所示。可将连接部分14置于支持物12上。
表8-2 探针序列
| 名称 | SEQ ID No. | 互补序列(5’→3’) |
| HPV16 | 7 | TCTGAAGTAGATATGGCAGCACATAATGAC |
| HPV18 | 8 | TGCCCAGGTACAGGAGACTGTGTAGAAGCA |
| HPV26 | 9 | AGTGGATGCAGATGCTGCAGATAATGTACT |
| HPV31 | 10 | GTATCACTGTTTGCAATTGCAGCACAAACA |
| rDNA | 11 | CTGGACGAAGACTGACGCTC |
＊末端通过巯基修饰。
HPV16至31用作HPV亚型特异的序列，而rDNA用作阴性对照。每一探针在末端用巯基修饰，并通过将探针溶液点在金电极上而固定在其上。最后，用超纯水洗基板并风干，制备出DNA芯片。
(8)LAMP产物与核酸探针的杂交
将上述(7)制备的DNA芯片浸入添加有2×SSC盐的LAMP产物溶液中并在35℃杂交60分钟。接下来，将电极浸入含有50μM嵌入剂Hoechst33258的磷酸盐缓冲液15分钟，并测定Hoechst 33258分子的氧化电流反应。
(9)结果
电流测定分析表明仅在携带有固定的HPV16探针的点上可检测到明显的电流信号。因此，明确了可序列特异性地检测通过LAMP反应扩增的核酸。
(10)通过LAMP法的多扩增(multiamplification)1
使用表9所示的引物进行1种模板的扩增。结果观察到LAMP扩增特征性的梯状带，并且证实了基因型特异的扩增(图7)。然后，使用多条引物即分别在组A至D中的多个混合的引物组进行1种模板的扩增，证实了基因型特异的扩增(图8)。
表9
(11)LAMP多扩增产物的检测1
通过使用在同一芯片上固定有序列编号605、623、635、652、683、763和793的探针的电流检测型DNA芯片检测图8所示的扩增产物。将探针设计为与16型、18型、31型、33型、45型、58型和68型的核酸分别特异性反应。仅使用模板16型和18型扩增的样本的反应导致仅对应于模板的电极上电流增加，表明基因型特异的检测(图9)。
(12)通过LAMP法的多扩增2
分别混合表10中所示的组A至D的引物组，以产生多个引物组。使用多个引物组扩增1种模板。以模板浓度103个拷贝/反应于65℃扩增2小时。结果证实了基因型特异的扩增(图10)。
表10
(13)LAMP多扩增产物的检测2
通过使用在同一芯片上固定有序列编号602，623，635，647，657，681，694，750，762，774和793的探针的电流检测型DNA芯片检测图10所示的扩增产物。将探针设计为与16型、18型、31型、33型、35型、45型、51型、56型、58型、59型、和68型的核酸分别特异性反应。使用11种模板中的每一种进行扩增所获得的样本的反应导致仅在对应于模板的电极上电流增加，表明对11种基因型的基因型特异的检测。
(14)通过LAMP法的多扩增3
分别混合表11中所示的组A至D的引物组产生多个引物组。具体地，管A含有增加16型、35型、和59型的引物组；管B含有增加18型、39型、和56型的引物组；管C含有增加45型、51型、58型、和68型的引物组；且管D含有增加31型、33型、和52型的引物组。此外，管E含有用于扩增人β-珠蛋白基因的引物SEQ ID No.801，802，803，和804(表12)。分别使用多个引物组进行1种模板的扩增。对应于每一HPV型的质粒用作模板，并且在浓度103个拷贝/反应于63℃杂交1.5小时，证实了基因型特异的扩增。
表11
(接下页)
表11
表12
(15)LAMP多扩增产物的检测3
上述扩增产物通过使用在同一芯片上固定有序列编号600，623，630，641，654，673，676，699，725，750，752，771，和783的探针的电流检测型DNA芯片检测。将探针设计为与16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、和68型的核酸分别特异性反应。在同一基板上固定用作探针来检测β-珠蛋白基因的寡核苷酸SEQ ID No.813作为反应的阳性对照，以及作为阴性对照的寡核苷酸SEQID No.814(表13)。使用13种模板中的每一种扩增所获得的样本的反应导致仅在对应于模板的电极上电流增加，表明对13种基因型的基因型特异的检测。
表13
其它优点和改变对本领域技术人员是显然的。因此，本发明在广义的方面不限于文中显示和描述的具体的详情和代表性的实施方案。因此，在不背离由后附的权利要求书及它们的等同物定义的总的发明观点的精神或范围内，可进行多种改变。
序列表
<110>株式会社 东芝
<120>使用核酸扩增法检测人乳头瘤病毒的方法和核酸链固定化载体
<130>06S1841P
<140>
<141>
<150>JP 2005-354826
<151>2005-12-08
<150>JP 2006-187871
<151>2006-07-07
<150>PCT/JP2006/323261
<151>2006-11-15
<160>814
<170>PatentIn版本3.1
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<213>人乳头瘤病毒
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<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒
<400>794
actgtaccag ctgtgtatga ttctaataaa tttaa 35
<210>795
<211>20
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
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tgatggtatg gggccaagag 20
<210>796
<211>45
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<213>人
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gaggtctaag tgatgacagc cgctgagggt ttgaagtcca actcc 45
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<211>46
<212>DNA
<213>人
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aatctactcc caggagcagg gctagtgaac acagttgtgt cagaag 46
<210>798
<211>20
<212>DNA
<213>人
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gagtcagatg caccatggtg 20
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<212>DNA
<213>人
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tgaggtctaa gtgatgacag ccgctgaggg tttgaagtcc aactcc 46
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<211>46
<212>DNA
<213>人
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aatctactcc caggagcagg gaagtgaaca cagttgtgtc agaagc 46
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<211>20
<212>DNA
<213>人
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agggctgagg gtttgaagtc 20
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<212>DNA
<213>人
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tgaggtctaa gtgatgacag ccgcaactcc taagccagtg ccaga 45
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<212>DNA
<213>人
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ctagggttgg ccaatctact cccaatagat ggctctgccc tgac 44
<210>804
<211>22
<212>DNA
<213>人
<400>804
tgaacacagt tgtgtcagaa gc 22
<210>805
<211>35
<212>DNA
<213>人
<400>805
aaagtcaggg cagagccatc tattgcttac atttg 35
<210>806
<211>30
<212>DNA
<213>人
<400>806
tcagggcaga gccatctatt gcttacattt 30
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<211>35
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<213>人
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gtcagggcag agccatctat tgcttacatt tgctt 35
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<211>35
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<213>人
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agggcaggag ccagggctgg gcataaaagt caggg 35
<210>809
<211>35
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<213>人
<400>809
aaagtcaggg cagagccatc tattgcttac atttg 35
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<211>28
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<213>人
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tgggcataaa agtcagggca gagccatc 28
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caggagcagg gagggcagga gccagggctg ggcat 35
<210>812
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<213>人
<400>812
cagggagggc aggagccagg gctgggcat 29
<210>813
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>813
caggagcagg gagggcagga gccaggg 27
<210>814
<211>25
<212>DNA
<213>人
<400>814
gactataaac atgctttccg tggca 25
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增用核酸引物，所述核酸引物选自下列(e)和(f)：
(e)核酸引物，其含有选自表4中所示第四序列组的序列或其互补序列；和
(f)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(e)的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(e)的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
2.包含权利要求1的引物的核酸引物的组，其中核酸引物的组选自：
分别含有序列SEQ ID No.136和132的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.278和276的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.527和524的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.164和167的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.320和327的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.454和457的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.363和359的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.399和391的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.474和476的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.549和547的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.208和203的两种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.251和244的两种核酸引物的组；和
分别含有序列SEQ ID No.422和425的两种核酸引物的组。
3.包含权利要求1的引物的核酸引物的组，其中核酸引物的组选自：
分别含有序列SEQ ID No.136，132，126和128的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.278，276，277和281的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.527，524，526和523的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.164，167，162和166的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.320，327，319和324的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.454，457，543和456的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.363，359，366和361的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.399，391，395和388的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.474，476，477和475的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.549，547，548和546的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.208，203，210和205的四种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.251，244，248和242的四种核酸引物的组；和
分别含有序列SEQ ID No.422，425，420和429的四种核酸引物的组。
4.包含权利要求1的引物的核酸引物的组，其中核酸引物的组选自：
分别含有序列SEQ ID No.136，132，126，128和138的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.278，276，277，281和280的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.527，524，526，523和529的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.164，167，162，166和170的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.320，327，319，324和328的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.454，457，453，456和458的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.363，359，366，361和370的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.399，391，395，388和402的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.474，476，477，475和480的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.549，547，548，546和572的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.208，203，210，205和214的五种核酸引物的组；
分别含有序列SEQ ID No.251，244，248，242和255的五种核酸引物的组；和
分别含有序列SEQ ID No.422，425，420，429和431的五种核酸引物的组。
5.用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增用试剂盒，其包含根据权利要求1的核酸引物。
6.检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其包括：
在LAMP反应中通过使用多条引物扩增样本中的核酸链的步骤，其中所述多条引物包括选自根据权利要求1的核酸引物中的至少一条引物；以及在扩增反应后检测扩增产物的存在并鉴定它们的基因型的步骤。
7.根据权利要求6的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中在扩增反应后检测扩增产物或鉴定它们的基因型的步骤还包括：
将扩增产物与病毒特异的或基因型特异的核酸链杂交的步骤；以及，
检测通过杂交形成的双链来检测人乳头瘤病毒或鉴定其基因型的步骤。
8.根据权利要求7的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中病毒特异的或基因型特异的核酸链是：(g)核酸探针，其含有选自表5中所示第五序列组的序列或其互补序列，或(h)核酸探针，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(g)的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(g)的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
9.根据权利要求8的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，
其中将病毒特异的或基因型特异的核酸链固定在支持物表面。
10.根据权利要求9的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中支持物表面是用电极材料制成的。
11.根据权利要求10的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中使用电化学活性的核酸链识别剂。
12.用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增用核酸引物，所述核酸引物选自以下的(a)-(f)：
(a)核酸引物，其在同一链上含有选自表1中所示第一序列组的序列的互补序列和选自表2中所示第二序列组的序列；
(b)核酸引物，其在同一链上含有选自第一序列组的序列的互补序列和选自表3中所示第三序列组的序列；
(c)核酸引物，其在同一链上含有选自第二序列组的序列的互补序列和选自第三序列组的序列；
(d)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交；
(e)核酸引物，其含有选自表4中所示第四序列组的序列或其互补序列；和
(f)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(e)的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(e)的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
13.用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增用试剂盒，其包含根据权利要求12的核酸引物。
14.检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其包括：
在LAMP反应中通过使用多条引物扩增样本中的核酸链的步骤，其中所述多条引物包括选自根据权利要求12的核酸引物中的至少一条引物；以及在扩增反应后检测扩增产物的存在并鉴定它们的基因型的步骤。
15.根据权利要求14的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中在扩增反应后检测扩增产物并鉴定它们的基因型的步骤还包括：
将扩增产物与病毒特异的或基因型特异的核酸链杂交的步骤；以及，
检测通过杂交形成的双链来检测人乳头瘤病毒或鉴定其基因型的步骤。
16.根据权利要求15的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中病毒特异的或基因型特异的核酸链是：
(g)核酸探针，其含有选自表5中所示第五序列组的序列或其互补序列，或(h)核酸探针，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(g)的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(g)的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
17.根据权利要求16的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，
其中将病毒特异的或基因型特异的核酸链固定在支持物表面。
18.根据权利要求17的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中支持物表面是用电极材料制成的。
19.根据权利要求18的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中使用电化学活性的核酸链识别剂。
Claims (21)
1.用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增用核酸引物，所述核酸引物选自以下的(a)-(f)：
(a)核酸引物，其在同一链上含有选自表1中所示第一序列组的序列的互补序列和选自表2中所示第二序列组的序列；
(b)核酸引物，其在同一链上含有选自第一序列组的序列的互补序列和选自表3中所示第三序列组的序列；
(c)核酸引物，其在同一链上含有选自第二序列组的序列的互补序列和选自第三序列组的序列；
(d)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交；
(e)核酸引物，其含有选自表4中所示第四序列组的序列或其互补序列；和
(f)核酸引物，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(e)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(e)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
2.用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的LAMP扩增用试剂盒，其包含根据权利要求1的核酸引物。
3.检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其包括：
在LAMP反应中通过使用多条引物扩增样本中的核酸链的步骤，其中所述多条引物包括选自根据权利要求1的核酸引物中的至少一条引物；以及在扩增反应后检测扩增产物的存在并鉴定它们的基因型的步骤。
4.根据权利要求3的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中在扩增反应后检测扩增产物并鉴定它们的基因型的步骤还包括：
将扩增产物与病毒特异的或基因型特异的核酸链杂交的步骤；以及，
检测通过杂交形成的双链来检测人乳头瘤病毒或鉴定其基因型的步骤。
5.根据权利要求4的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，
其中将病毒特异的或基因型特异的核酸链固定在支持物表面。
6.根据权利要求4的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中病毒特异的或基因型特异的核酸链是：
(g)核酸探针，其含有选自表5中所示第五序列组的序列或其互补序列，或(h)核酸探针，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(g)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(g)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
7.根据权利要求4的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，其中支持物表面是用电极材料制成的，且电极上固定有选自下列(g)和(h)的核酸探针：
(g)核酸探针，其含有选自表5中所示第五序列组的序列或其互补序列，或(h)核酸探针，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(g)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(g)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
8.根据权利要求7的检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的方法，
其中使用电化学活性的核酸链识别剂。
9.用于检测通过使用权利要求1的核酸引物扩增的人乳头瘤病毒LAMP扩增产物的核酸链固定化支持物，其包含支持物和在该支持物表面上固定的人乳头瘤病毒特异的或基因型特异的核酸链。
10.根据权利要求9的核酸链固定化支持物，其中核酸链是：
(g)核酸探针，其含有选自表5中所示第五序列组的序列或其互补序列，或(h)核酸探针，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(g)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(g)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
11.根据权利要求10的核酸链固定化支持物，其中支持物是由透过性材料或不透过性材料形成的。
12.根据权利要求11的核酸链固定化支持物，其中透过性材料是多孔材料或膜。
13.根据权利要求11的核酸链固定化支持物，其中不透过性材料是玻璃或树脂。
14.根据权利要求10的核酸链固定化支持物，其中支持物表面是用电极材料制成的。
15.用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的检测试剂盒，其包含根据权利要求10的核酸链固定化支持物。
16.用于检测人乳头瘤病毒LAMP扩增产物的核酸链固定化支持物，其包含支持物和在该支持物表面固定的人乳头瘤病毒特异的或基因型特异的核酸链，其中核酸链是：
(g)核酸探针，其含有选自表5中所示第五序列组的序列或其互补序列，或(h)核酸探针，其含有通过插入、缺失、或替代一个或多个碱基而不同于核酸引物(g)之一的所选序列的序列，并且能够与具有核酸引物(g)之一的所选序列的互补序列的核酸链杂交。
17.根据权利要求16的核酸链固定化支持物，其中支持物是由透过性材料或不透过性材料形成的。
18.根据权利要求17的核酸链固定化支持物，其中透过性材料是多孔材料或膜。
19.根据权利要求17的核酸链固定化支持物，其中不透过性材料是玻璃或树脂。
20.根据权利要求16的核酸链固定化支持物，其中支持物表面是用电极材料制成的。
21.用于检测人乳头瘤病毒和鉴定其基因型的检测试剂盒，其包含根据权利要求16的核酸链固定化支持物。
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