CN103602755A - 一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒 - Google Patents

一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒 Download PDF

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Abstract

人乳头瘤病毒(HPV)是一种诱发外生殖器良性病变和女性子宫颈癌的主要病原体。HPV分为低危型和中高危型HPV。低危型HPV常引起外生殖器尖锐湿疣等良性病变；而中高危型HPV与宫颈癌及宫颈上皮内病变的发生密切相关。因此，有针对性地进行HPV的分型检测，对于宫颈癌的早期诊断和治疗具有一定的临床意义。本发明针对HPV基因组晚期区L1区设计特异引物和20型信号探针，将信号探针分别固定在印刷电路板金电极表面，制备成电化学传感器，用于捕获PCR多重扩增产物。由于信号探针标记有二茂铁分子，通过夹心杂交产生电流的变化，应用电化学基因传感器分析系统检测出电流值，最后进行人乳头瘤病毒基因型别判定。

Description

一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20个基因分型的试剂盒，特别是涉及以一种电化学基因传感器技术快速分型检测20个人乳头瘤病毒型别的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒，实现对宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物样本中的20个人乳头瘤病毒型别进行快速检测和分析。
背景技术
1998年底美国科学促进会将电化学基因传感器技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。
生物芯片以其高通量、多靶位的检测模式正在被越来越多地应用于生物科学领域。以印刷电路板为载体的微阵列芯片，更以其高效、高通量、低价位等特点，已经广泛用于基础研究和临床筛查、辅助诊断。
微阵列芯片包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗体芯片等，电化学基因传感器芯片以特殊化学方法处理后的印刷电路板为载体，将各种探针或靶标片段以化学键结合的方式固定在印刷电路板表面，并利用二茂铁衍生物作为电化学指示剂，形成可用于杂交反应或抗原抗体反应的微阵列芯片。
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国每年宫颈癌新发病例约13万，是仅次于乳腺癌而引起妇女癌症相关死亡的重要原因。近几年来，随着生活方式的改变，宫颈癌患者的发病年龄更趋年轻化，并且病例数有不断上升的趋势。宫颈癌也是目前唯一一种发病原因比较清楚的癌症，主要病因是由高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的持续感染或反复感染所致，同一型别的高危HPV病毒持续感染导致发生宫颈癌或者宫颈病变的风险系数更高，而不同型别的HPV与宫颈癌的相关性也不一样，例如HPV16，18型感染与宫颈癌高度相关，60％以上的宫颈癌的发生是由HPV16，18型的持续感染所致；低危型如6，11等的持续感染则几乎不导致宫颈癌的发生。
HPV主要通过性行为传播，也可通过接触污染物品传播。研究表明，几乎所有(99.7％)的宫颈癌患者中都有HPV的感染；有过性行为的女性，一生中至少感染过一种HPV的机率高达40％左右。只有高危型HPV的持续或反复感染才有致癌的可能，从HPV感染至宫颈癌发生需经历多年的时间，通过积极处理HPV感染及癌前病变，可以有效阻断病情发展，预防宫颈癌的发生。因此检测HPV基因型有助于判断病情的进展、制定个体化检查和治疗方案。
目前确定的HPV型别约有100多种，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，大约35种型别涉及生殖道感染，约20种与肿瘤相关。依据不同型HPV与癌发生的危险性高低分为低危险型HPV如HPV6，11，42，43，44等，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变；高危型HPV如16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82等15个型别与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN2／3)的发生相关，尤其是HPV16和18型；而26，53，66等疑似高危型别则可能会引起癌前病变，甚至宫颈癌。
发明内容
本发明涉及一种电化学基因传感器法分型检测20个人乳头瘤病毒型别基因的试剂盒，特别是涉及以一种电化学基因传感器技术快速分型检测20个人乳头瘤病毒型别基因的试剂盒。本试剂盒可以检测宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物样品中人乳头瘤病毒基因。
本发明适用于定性并分型检测宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物等临床样品中的HPV16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，6，11等20个人乳头瘤病毒型别。
本发明的目的是提供一种使用电化学基因传感器技术来定性分型检测样品中20个人乳头瘤病毒型别基因的试剂盒。其基本原理是利用四对寡核苷酸的特异性引物在UNG酶、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、Mg2+和PCR反应缓冲液中，通过ABI2700、ABI9700等市售的定性PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，获得多重扩增产物；设计的特异性捕获探针分别固定在特制的印刷电路板金电极表面，制备成电化学传感器(芯片)，用于捕获PCR多重扩增产物；特异性信号探针与已捕获的PCR产物特异结合。由于信号探针标记有二茂铁分子，通过夹心杂交产生电流的变化，应用电化学基因传感器分析系统检测出电流值(信号值)，并对20个不同人乳头瘤病毒型别的碱基进行判定，从而达到快速检测靶多核苷酸的目的，用以指导临床治疗。
本发明所提供的检测样品中人乳头瘤病毒型别基因的试剂盒包括：(1)分别装有PCR扩增反应液、PCR扩增反应酶系、电化学杂交液、空白对照、人乳头瘤病毒阳性质控品和阴性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的37条引物包括：
正向引物MY11-A：5’-GCACAGGGACATAACAATGG-3’(SEQ ID NO：1)，
正向引物MY11-B：5’-GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’(SEQ ID NO：2)，
正向引物MY11-C：5’-GCACAGGGACATAATAATGG-3’(SEQ ID NO：3)，
正向引物MY11-D：5’-GCCCAGGGCCACAACAATGG-3’(SEQ ID N0：4)，
正向引物MY11-E：5’-GCTCAGGGTTTAAACAATGG-3’(SEQ ID NO：5)，
正向引物MY11-F：5’-GCACAAGGCCATAATAATGG(SEQ ID NO：6)，
正向引物MY11-G：5’-GCCCAGGGTCATAACAATGG-3’(SEQ ID NO：7)，
正向引物MY11-H：5’-GCACAAGGTCATAATAATGG-3’(SEQ ID NO：8)，
正向引物MY11-I：5’-GCICAGGGICATAAIAATGG-3’(SEQ ID NO：9)，
正向引物MY11-J：5’-GCACAGGGACACAATAATGG-3’(SEQ ID NO：10)，
反向引物MY09-1：5’-AGGTAGATGAGGTGGTGGGT-3’(SEQ ID NO：11)，
反向引物MY09-2：5’-ACGCAATCCAGCCTGAACCA-3’(SEQ ID NO：12)，
反向引物MY09-3：5’-TGCCTAACTGAAATATAAATTGTAA-3’(SEQ IDNO：13)，
反向引物MY09-4：5’-GACGATGTGCGGGTGGATGT-3’(SEQ ID NO：14)，
反向引物MY09-5：5’-GCATAGATGAAAAACAAACTGTA-3’(SEQ ID NO：15)，
反向引物MY09-6：5’-GCACACTTGAAAAATAAACTGTAA-3’(SEQ ID NO：16)，
反向引物MY09-7：5’-TGGAAAATAAACTGCAAATCA-3’(SEQ ID NO：17)，
反向引物MY09-8：5’-AGGTGGAAGCAGCAGGACGC-3’(SEQ ID NO：18)，
反向引物MY09-9：5’-CCTATTCTTCACCATGCCTTA-3’(SEQ ID NO：19)，
反向引物MY09-10：5’-CGATGATGCGGGGCGTTTTA-3’(SEQ ID NO：20)，
反向引物MY09-11：5’-AGAGGATACAGGCGGTTTAG-3’(SEQ ID NO：21)，
反向引物MY09-12：5’-AACACAAATTGTAATTCATATTCC-3’(SEQ ID NO：22)，
反向弓物MY09-13：5’-TTTGCGTTTGGTGGATGGTG-3’(SEQ ID NO：23)，
反向引物MY09-14：5’-GGGTAGAGGTAGGGGCAGGC-3’(SEQ ID NO：24)，
反向引物MY09-15：5’-TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC-3’(SEQ ID NO：25)，
反向引物MY09-16：5’-GCAGTAGTTGCTGTGGCGGG-3’(SEQ ID NO：26)，
反向引物MY09-17：5’-GGTAGCATCCATTGTGTGTAAA-3’(SEQ ID NO：27)，
反向引物MY09-18：5’-CGAGGAAGCGGAAGAGGATG-3’(SEQ ID NO：28)，
反向引物MY09-19：5’-TGAAAAAtAAACTGTAAATCATATTC-3’(SEQ ID NO：29)，
反向引物MY09-20：5’-GGGCTGTAGAGGGCTTAGAC-3’(SEQ ID NO：30)，
反向引物MY09-21：5’-TGCGTCCCAAAGGAAACTGATC-3’(SEQ ID NO：31)
反向引物MY09-22：5’-CTACCTAAAGGAAACTGATC-3’(SEQ ID NO：32)
反向引物MY09-23：5’-AACTTGCGACCCAATGCAAACTG-3’(SEQ ID N0：33)
反向引物MY09-24：5’-CGTCCTAAAGGAAACTGGTC-3’(SEQ ID NO：34)
反向引物MY09-25：5’-CGACCCAATGGAAACTGATC-3’(SEQ ID NO：35)
反向引物MY09-26：5’-TTTACGGCCCAACGGAAACTGATC-3’(SEQ ID NO：36)
反向引物MY09-27：5’-TGCGCCCTAAGGGAAACTGGGT-3’(SEQ ID NO：37)
根据本发明的一个优选实施方案，电化学杂交液中用于特异性结合PCR产物并指示各个SNP位点的碱基的寡核苷酸信号探针有28条包括：
HPV(20型).SP-01：5’-CACATAATGTCATATTTGTACTGCGT-3’(SEQ ID NO：38)
HPV(20型).SP-02：5’-TGCATAAAGTCATATTAGTGCTACGA-3’(SEQ ID NO：39)
HPV(20型).SP-03：5’-TAGATAATGTAAAGTTGGTACTGCGAG-3’(SEQ ID NO：40)
HPV(20型).SP-04：5’-TAGTAATAGTCATGTTAGTACTGCGGG-3’(SEQ ID NO：41)
HPV(20型).SP-05：5’-CACACACAGAAAGATTAGTGCTTCTAG-3’(SEQ ID NO：42)
HPV(20型).SP-06：5’-TGCATAATGTCATATTAGTGCTACAAG-3’(SEQ ID NO：43)
HPV(20型).SP-07：5’-GGACAATGTAAAATTAGTACTGCGCG-3’(SEQ ID NO：44)
HPV(20型).SP-08：5’-CACATATTGTTAAATTAGTACTGCGG-3’(SEQ ID NO：45)
HPV(20型).SP-09：5’-AACACACAGACATATTGGTACTGCGT-3’(SEQ ID NO：46)
HPV(20型).SP-10：5’-TGCTAATGGTTAAATTTGTACTTCTGG-3’(SEQ ID NO：47)
HPV(20型).SP-11：5’-CGTTAATAGTCATGTTTGTATTCCTG-3’(SEQ ID NO：48)
HPV(20型).SP-12：5’-CAACAGTAACAAAIAGTTGGTTACC-3’(SEQ ID NO：49)
HPV(20型).SP-13：5’-AACTGTGACAAACAACTGATTGCCC-3’(SEQ ID NO：50)
HPV(20型).SP-14：5’-TGTATCAACTACAGTAACAAACAATT-3’(SEQ ID NO：51)
HPV(20型).SP-15：5’-TATCAACACAGGTAATAAAAAGCTGAT-3’(SEQ ID NO：52)
HPV(20型).SP-16：5’-AGTATCCACAACAGTAACAAATACCTGA-3’(SEQ ID NO：53)
HPV(20型).SP-17：5’-GGTATCTACCACAGTAACAAATAATTG-3’(SEQ ID NO：54)
HPV(20型).SP-18：5’-AGTGGTATCCACAACTGTGACAAACAA-3’(SEQ ID NO：55)
HPV(20型).SP-19：5’-ATTAGTGCTTCTAGTAGTATCTACAACAGT-3’(SEQ ID NO：56)
HPV(20型).SP-20：5’-TTGGTACTTTTAGTAGTGTCAACACAAGTA-3’(SEQ ID NO：57)
HPV(20型).SP-21：5’-GGCATACGTTGTAGTAGAGCTACTAGCCTGTG-3’(SEQ ID NO：58)
HPV(20型).SP-22：5’-GGCATACGTTGTAGTAGAGCTACTAGCCTG-3’(SEQ ID NO：59)
HPV(20型).SP-23：5’-TCATTTTTATATGTACCTTCCTTAGTTACT-3’(SEQ ID NO：60)
HPV(20型).SP-24：5’-TCACTAGAAGACACAGCAGAACACACAGACAT-3’(SEQ ID NO：61)
HPV(20型).SP-25：5’-GAAGACTCTATAGAGGTAGATAATGTAA-3’(SEQ ID NO：62)
HPV(20型).SP-26：5’-CGCAGCAGTGGCAGTGCTAATAGTTAAATTTGTA-3’(SEQ IDNO：63)
HPV(20型).SP-27：5’-TCACTAGTTACTTGTGTGCATAAAGTCATATTAG-3’(SEQ IDNO：64)
HPV(20型).SP-28：5'-ATGGTAAGGTTAGTACTGCGGGTGGTATCAAC-3’(SEQ ID NO：65)
根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液由(a)PCR反应缓冲液、(b)镁离子溶液、(c)能够分别与20个不同型别的双链靶多核苷酸的第一条链结合的10条正向引物、(d)能够分别与20个不同型别的双链靶多核苷酸的第二条链结合的27条反向引物。
根据本发明的另一个优选实施方案，PCR扩增反应液中的各引物的工作浓度，正向引物浓度各0.5μmol／L，反向引物浓度各0.03μmol／L。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应酶系由耐热DNA聚合酶(Taq酶)、UNG酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)组成。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的镁离子最佳浓度为6.5mmol／L。PCR扩增反应酶系中耐热Taq酶最佳用量为7U／反应、UNG酶最佳用量为O.1U／反应、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳浓度为0.6mmol／L。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：50℃3分钟；然后95℃预变性15分钟；最后94℃30秒，45℃30秒，72℃30秒50个循环；72℃7分钟。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中电化学杂交液包括杂交液I、杂交液II、杂交液III三种，杂交液I的主要成分为上述的28种信号探针(SEQ ID NO：38～SEQ ID NO：65)，每种信号探针的浓度均为0.175pmol／μL；杂交液II的主要成分为蛋白质；杂交液III的主要成分为高氯酸钠，其浓度为0.8mol／L。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为灭菌纯化水。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中人乳头瘤病毒阳性质控品为传代培养的宫颈癌Hela细胞(人乳头瘤病毒检测显示18型阳性)，浓度为104拷贝／mL。
本发明提供的检测试剂盒可以检测出人乳头瘤病毒的最低浓度为5×103拷贝／mL，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。
本发明针对20个型别的人乳头瘤病毒设计特异引物和探针，可分型检测20个人乳头瘤病毒型别，但不能检测出除此20个型别以外的其他人乳头瘤病毒型别，说明本试剂盒具有很好的特异性。
本发明提供的检测试剂盒可以灵敏、快速地检测宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物等样品中20个人乳头瘤病毒型别；可为人乳头瘤病毒型别筛查提供可靠的实验证据。
附图说明
图1显示人乳头瘤病毒分型检测结果
图2显示人乳头瘤病毒分型检测结果
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：人乳头瘤病毒分型基因检测试剂的研制
1、引物和探针的设计：通过对Genebank数据库已有的20个型别人乳头瘤病毒基因的序列以及国内外已发表文献中报导的相关核酸序列进行序列比对分析，以人乳头瘤病毒基因的保守片段为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件，人工设计多对引物和探针。
2、样本的选择：根据国内外相关文献报道表明，可以选择宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物样品。
3、反应体系的建立与优化
样品的准备：以中检所提供人乳头瘤病毒国家质粒参考品中的20个本试剂盒可以检测到的型别质粒作为阳性参考品，待用。
引物探针的筛选：以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的由阳性参考品提取的人基因组DNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合：序列表中SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：65。
引物浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，上下游引物量比例由4／1至20／1的梯度，分别使用从0.10μmol／L至0.60μmol／L浓度梯度的上游引物进行PCR反应，下游引物则浓度使用从0.01μmol／L至0.10μmol／L浓度梯度进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的各引物的工作浓度为上游引物浓度各0.5μmol／L，下游引物浓度各0.03μmol／L。
热启动Taq酶用量的优化：在30μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从2U(酶单位)至10U浓度梯度的酶用量／反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的Taq酶用量为7U／反应。
UNG酶用量的优化：在301μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.05U(酶单位)至0.2U浓度梯度的酶用量／反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的UNG酶用量为0.1U／反应。
dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.2mmol／L至0.8mmol／L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.6mmol／L。
加样量的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别测试从2μLC至10μL梯度的加样量，进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳加样量为5μL。
反应温度的优化：根据酶的活性和寡多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：50℃3分钟，95℃预变性15分钟；然后94℃30秒，45℃30秒，72℃30秒，40个循环；最后72℃延伸7分钟。
杂交液I中信号探针浓度的优化：在杂交反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.10pmol／人份至0.20pmol／人份浓度梯度的信号探针进行杂交反应，经多次重复试验，最终确定最佳的每种信号探针的浓度均为0.175pmol／μL。
杂交液II量的优化：在杂交反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从5μL至15μL梯度的杂交液II进行杂交反应，经多次重复试验，最终确定最佳的杂交液II量为10μL。
杂交液III浓度的优化：在杂交反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.4mol／L至1.5mol／L梯度的杂交液III进行杂交反应，经多次重复试验，最终确定最佳的杂交液III浓度为0.8mol／L。
4、最低检出量实验：将20个型别人乳头瘤病毒质粒分别梯度稀释成105拷贝／mL、104拷贝／mL、7.5×103拷贝／mL、5×103拷贝／mL、2.5×103拷贝／mL、103拷贝／mL、102拷贝／mL作为线性与最低检出量参考品，进行PCR检测分析，当DNA浓度为5×103拷贝／mL时，仍能检测到各位点有正常信号值，即最低检出量可到达5×103拷贝／mL。
5、标本检测：以已知感染了人乳头瘤病毒的宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物样品作为待检标本，分别用磁珠法提取标本的DNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明：本试剂盒可以很灵敏的检测并分型临床标本中的20个人乳头瘤病毒型别。
实施例2：人乳头瘤病毒(20个型)基因分型检测试剂盒(电化学基因传感器法)及其使用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒：HPV分型PCR反应液A(528μL／管)1管、HPV分型PCR反应液B(72μL／管)1管、HPV阳性质控品(200μL／管)1管、阴性质控品(200μL／管)1管、杂交液I(1680μL／管)1管、杂交液II(2401μL／管)1管、杂交液III(480μL／管)1管、电化学传感器(芯片)(8个／包)3包。
2、标本采集、运送和保存
2.1适用样本类型：宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物。
2.2宫颈样本：医护人员先用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用宫颈刷置于宫颈口，顺时针旋转4-6周以获取足量的上皮细胞，然后取出宫颈刷置于盛有2mL生理盐水的无菌小试管中备检。若样本黏液过多或者含血量过多应该尽量重新取样。
女性尿道样本：首先使用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用棉拭子插入尿道约2cm，然后捻动拭子，最后将拭子放入细胞保存液中，密闭送检。采集尿道样本时，受检者必须在采集前2小时禁止小便。
男性尿道样本：取尿道分泌物或使用细小的尿道拭子，插入男性尿道2-4cm，然后捻动尿道拭子取出分泌物，最后将尿道拭子放入细胞保存液中，密闭送检。
2.3保存与运送：标本应立即用于测试，4℃保存不应超过1星期，-20℃保存不应超过3个月。若要长期保存，需储存于-80±5℃；标本应避免反复冻融。标本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封运输，运输时间不应超过7天。
3、检测步骤
(1)基因组DNA提取
建议取200μl样本进行核酸提取。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒(磁珠法)，该试剂盒可用于对宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物中病毒DNA的提取，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。
本试剂盒中的质控品均参与提取，其中阴性质控品用于对环境进行监控；阳性质控品用于提取及PCR检测试剂的质控。
(2)PCR扩增
取适量PCR反应管，每管加入HPV分型PCR反应液A22μL、HPV分型PCR反应液B3μL(也可根据PCR反应用量，计算各组分所需总量，混匀后分装25μL于单个PCR反应管中)；
于上述PCR反应管中分别加入提取好的样本DNA和HPV阴阳性质控品DNA各51μL，6,000rpm瞬时(5秒)离心后，将各反应管放入PCR仪，按下列条件上机进行扩增：
50℃3分钟，95℃预变性15分钟，然后按94℃30秒→45℃30秒→72℃30秒扩增50个循环，最后72℃延伸7分钟。
(3)杂交操作
取一0.2mL的离心管，依次加入70μL杂交液I，10μL杂交液II，20μL杂交液III以及25μLPCR产物，充分混匀(注意尽量不要有气泡)，将混匀的液体移入电化学传感器(芯片)的管中，压紧管盖。在传感器插入DA9000仪器(由中山大学达安基因股份有限公司自主研发的与本试剂盒匹配的专用杂交检测仪)的检测模块前，检查是否已正确地标记，确认样本管的序列号与传感器是否匹配。然后选定与本试剂盒匹配的专用杂交检测程序，开始运行。大约30分钟后，杂交完成，输出报告单。
(4)结果分析
检测报告中会提供20个HPV型别结果，检测阳性的HPV型别对应的结果显示为“Positive”，检测阴性的HPV型别对应的结果显示为“Target Not Detected”。
检测报告中会显示本试剂盒可以检测的20种HPV型别及结果。检测报告可以打印，也可以直接查看电子版本的信息，详细的信息可以阅读电化学基因传感器系统说明书。
有效的结果：电化学传感器结果中高信号控制点(HiS Contro1)和芯片低信号控制点(LoSContro1)的结果显示“pass”。
无效的结果：电化学传感器中芯片高信号控制点(HiS Contro1)或芯片低信号控制点(LoSContro1)的结果显示“Fai1”，该实验视为无效，建议重新测试。
(5)结果判断
结果判断为有效的结果情况下，检测结果显示为“Positive”表明样本有该HPV病毒的DNA存在。
结果判断为有效的结果情况下，检测结果显示“Target Not Detected”并不能排除样本不含有该病毒DNA，只能说明样本含有的病毒DNA浓度低于本试剂盒的检测下限。
实施例3：应用人乳头瘤病毒(20个型)基因分型检测试剂盒(电化学基因传感器法)检测临床样品
所有实验过程在广州南方医院检验室完成，临床样品由广州南方医院检验室提供，包括宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物、已提取好的DNA样本等样品类型，标本DNA提取、PCR反应与结果分析参照实施例2进行。
临床样品的检测结果如附图所示：从2个临床标本的检测报告单中均能直观判定临床标本中含有的人乳头瘤病毒基因型别(见说明书附图图1、图2)。
图1说明：高信号控制点(HiS Control)和芯片低信号控制点(LoS Control)的结果均显示“pass”表明试验结果有效，本例样本检出人乳头瘤病毒型别HPV16和HPV39阳性，其余型别未被检出，与RDB对照试剂结果对照，结果一致。
图2说明：高信号控制点(HiS Contro1)和芯片低信号控制点(LoS Control)的结果均显示“pass”表明试验结果有效，本例样本检出人乳头瘤病毒型别HPV58和HPV11阳性，其余型别未被检出，与RDB对照试剂结果对照，结果一致。
本发明人乳头瘤病毒(20个型)基因分型检测试剂盒(电化学基因传感器法)操作简便，半小时即可以得到准确的检测结果；且一个芯片可以同时分辨检测一个样本中可能存在的20个型别人乳头瘤病毒，成本低廉。
Figure ISA0000094158730000021
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Claims (9)

1.一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒，该试剂盒包括：PCR扩增反应液、PCR扩增反应酶系、电化学杂交液、人乳头瘤病毒阳性质控品和阴性质控品。其中PCR扩增反应液由PCR反应缓冲液、镁离子溶液、能够分别与20个不同型别的双链靶多核苷酸的第一条链结合的10条正向引物、能够分别与20个不同型别的双链靶多核苷酸的第二条链结合的27条反向引物组成；PCR扩增反应酶系由Taq酶、UNG酶和dNTPs组成；电化学杂交液由杂交液I、杂交液II、杂交液III组成。 
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的10条正向引物和27条反向引物的序列包括： 
正向引物MY11-A：GCACAGGGACATAACAATGG 
正向引物MY11-B：GCGCAGGGCCACAATAATGG 
正向引物MY11-C：GCACAGGGACATAATAATGG 
正向引物MY11-D：GCCCAGGGCCACAACAATGG 
正向引物MY11-E：GCTCAGGGTTTAAACAATGG 
正向引物MY11-F：GCACAAGGCCATAATAATGG 
正向引物MY11-G：GCCCAGGGTCATAACAATGG 
正向引物MY11-H：GCACAAGGTCATAATAATGG 
正向引物MY11-I：GCICAGGGICATAAIAATGG 
正向引物MY11-J：GCACAGGGACACAATAATGG 
反向引物MY09-1：AGGTAGATGAGGTGGTGGGT 
反向引物MY09-2：ACGCAATCCAGCCTGAACCA 
反向引物MY09-3：TGCCTAACTGAAATATAAATTGTAA 
反向引物MY09-4：GACGATGTGCGGGTGGATGT 
反向引物MY09-5：GCATAGATGAAAAACAAACTGTA 
反向引物MY09-6：GCACACTTGAAAAATAAACTGTAA 
反向引物MY09-7：TGGAAAATAAACTGCAAATCA 
反向引物MY09-8：AGGTGGAAGCAGCAGGACGC 
反向引物MY09-9：CCTATTCTTCACCATGCCTTA 
反向引物MY09-10：CGATGATGCGGGGCGTTTTA 
反向引物MY09-11：AGAGGATACAGGCGGTTTAG 
反向引物MY09-12：AACACAAATTGTAATTCATATTCC 
反向引物MY09-13：TTTGCGTTTGGTGGATGGTG 
反向引物MY09-14：GGGTAGAGGTAGGGGCAGGC 
反向引物MY09-15：TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC 
反向引物MY09-16：GCAGTAGTTGCTGTGGCGGG 
反向引物MY09-17：GGTAGCATCCATTGTGTGTAAA 
反向引物MY09-18：CGAGGAAGCGGAAGAGGATG 
反向引物MY09-19：TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 
反向引物MY09-20：GGGCTGTAGAGGGCTTAGAC 
反向引物MY09-21：TGCGTCCCAAAGGAAACTGATC 
反向引物MY09-22：CTACCTAAAGGAAACTGATC 
反向引物MY09-23：AACTTGCGACCCAATGCAAACTG 
反向引物MY09-24：CGTCCTAAAGGAAACTGGTC 
反向引物MY09-25：CGACCCAATGGAAACTGATC 
反向引物MY09-26：TTTACGGCCCAACGGAAACTGATC 
反向引物MY09-27：TGCGCCCTAAGGGAAACTGGGT 。
3.根据权利要求2所述的引物序列，其特征还在于正向引物工作浓度均为0.5μmol／L，反向引物的工作浓度均为0.03μmol／L。 
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应酶系中Taq酶的浓度为7U／反应，UNG酶的浓度为0.1U／反应，dNTPs的浓度为0.6mmol／L。 
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于用于PCR扩增反应的反应条件为：50℃3分钟；95℃15分钟；94℃30秒，45℃30秒，72℃30秒，50个循环；72℃7分钟。 
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于电化学杂交液中杂交液I的主要成分为28种信号探针，且浓度均为0.175pmol／μL；杂交液II的主要成分为蛋白质；杂交液III的主要成分为高氯酸钠，且浓度为0.8mol／L。 
7.根据权利要求6所述的电化学杂交液，其特征还在于电化学杂交液I中用于特异性结合PCR产物并指示各个人乳头瘤病毒型别的寡核苷酸信号探针有28条，包括： 
HPV(20型).SP-01：CACATAATGTCATATTTGTACTGCGT 
HPV(20型).SP-02：TGCATAAAGTCATATTAGTGCTACGA 
HPV(20型).SP-03：TAGATAATGTAAAGTTGGTACTGCGAG 
HPV(20型).SP-04：TAGTAATAGTCATGTTAGTACTGCGGG 
HPV(20型).SP-05：CACACACAGAAAGATTAGTGCTTCTAG 
HPV(20型).SP-06：TGCATAATGTCATATTAGTGCTACAAG 
HPV(20型).SP-07：GGACAATGTAAAATTAGTACTGCGCG 
HPV(20型).SP-08：CACATATTGTTAAATAGTACTGCGG 
HPV(20型).SP-09：AACACACAGACATATTGGTACTGCGT 
HPV(20型).SP-10：TGCTAATGGTTAAATTTGTACTTCTGG 
HPV(20型).SP-11：CGTTAATAGTCATGTTTGTATTCCTG 
HPV(20型).SP-12：CAACAGTAACAAATAGTTGGTTACC 
HPV(20型).SP-13：AACTGTGACAAACAACTGATTGCCC 
HPV(20型).SP-14：TGTATCAACTACAGTAACAAACAATT 
HPV(20型).SP-15：TATCAACACAGGTAATAAAAAGCTGAT 
HPV(20型).SP-16：AGTATCCACAACAGTAACAAATACCTGA 
HPV(20型).SP-17：GGTATCTACCACAGTAACAAATAATTG 
HPV(20型).SP-18：AGTGGTATCCACAACTGTGACAAACAA 
HPV(20型).SP-19：ATTAGTGCTTCTAGTAGTATCTACAACAGT 
HPV(20型).SP-20：TTGGTACTTTTAGTAGTGTCAACACAAGTIA 
HPV(20型).SP-21：GGCATACGTTGTAGTAGAGCTACTAGCCTGTG 
HPV(20型).SP-22：GGCATACGTTGTAGTAGAGCTACTAGCCTG 
HPV(20型).SP-23：TCATTTTTATATGTACCTTCCTTAGTTACT 
HPV(20型).SP-24：TCACTAGAAGACACAGCAGAACACACAGACAT 
HPV(20型).SP-25：GAAGACTCTATAGAGGTAGATAATGTAA 
HPV(20型).SP-26：CGCAGCAGTGGCAGTGCTAATAGTTAAATTTGTA 
HPV(20型).SP-27：TCACTAGTTACTTGTGTGCATAAAGTCATATTAG 
HPV(20型).SP-28：ATGGTAAGGTTAGTACTGCGGGTGGTATCAAC 。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于人乳头瘤病毒阴性质控品为灭菌纯化水；阳性质控品为传代培养的宫颈癌Hela细胞，且DNA浓度为104拷贝／mL。 
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所检测的样品可选自但不局限于宫颈脱落细胞样本或生殖泌尿道分泌物。 
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