CN102994645A - 一种人乳头瘤病毒的分型方法 - Google Patents

一种人乳头瘤病毒的分型方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102994645A
CN102994645A CN2011102782279A CN201110278227A CN102994645A CN 102994645 A CN102994645 A CN 102994645A CN 2011102782279 A CN2011102782279 A CN 2011102782279A CN 201110278227 A CN201110278227 A CN 201110278227A CN 102994645 A CN102994645 A CN 102994645A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hpv
primer
probe
fluorescent
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011102782279A
Other languages
English (en)
Inventor
潘振华
孙朝辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN2011102782279A priority Critical patent/CN102994645A/zh
Publication of CN102994645A publication Critical patent/CN102994645A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种人乳头瘤病毒的分型方法，首先进行样品扩增，选用通用HPV扩增引物，上游引物可以是MY11和PGMY11混合引物组，GP5、GP5+、SPF1的混合引物组；下游引物可以是MY09、PGMY09的混合引物组，GP6、GP6+、SPF2的混合引物组；然后进行溶解曲线分析，在HPV的DNA或者上一步的PCR产物中加入，需要检测亚型的探针，可选用的浓度范围是(10-500nM)，在荧光定量PCR仪上需要相应的荧光检测通道，设置的溶解曲线程序进行分析。本发明可以用一种荧光通道检测不同亚型的HPV，我们的附图中提供了一个荧光检测通道检测3个HPV亚型的实例。

Description

一种人乳头瘤病毒的分型方法
技术领域
本发明涉及一种人乳头瘤病毒的分型方法，利用寡核苷酸探针的溶解曲线和特定的荧光标记实现HPV亚型的分型检测。
背景技术
宫颈癌是妇女高发的恶性肿瘤之一，几乎所有的宫颈癌标本中可检出HPV DNA，HPV阴性者几乎无罹子宫颈癌之忧，因此，HPV被确认为子宫颈癌发生的必要条件。人乳头状瘤病毒(HPV)型别有80多种，按其感染部位分为皮肤型和生殖道型HPV。大约有35种型别与生殖道感染有关，约20种与肿瘤相关。依据与癌发生关系，分为低危型HPV(如6、11、42、43和44型等可引起外生殖器湿疣、宫颈上皮内低度病变等)和高危型HPV(如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型与子宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的发生相关)。而HPV16和18型感染率最高，即HPV16占所有型别的50％，其病理类型主要为子宫颈癌鳞状上皮细胞癌；HPV18占14％，在子宫颈腺上皮细胞癌占主要地位；HPV45占8％；HPV31占5％；其他型别占23％。所以针对HPV分型的检测对于宫颈癌的预防十分有必要。由于目前尚无有效的技术手段能够在体外培养HPV，所以目前为止没有有效的HPV血清学分型方法。传统的诊断方法主要是形态学检查方法，包括巴氏涂片、液基薄层细胞检查、阴道镜等；免疫学检查，主要是酶联免疫反应。这些传统的技术手段，存在较高假阳性和假阴性率，由于这些不足，分子生物学技术被引入HPV的临床检测，它们包括，原位杂交、杂交捕获、PCR、PCR反向点杂交等技术，其中杂交捕获是目前美国FDA唯一批准可用于临床检测的试剂盒，但这些方法有个共同的缺点就是操作复杂，耗时长大大制约了临床的应用。
荧光定量PCR检测技术是1990年诞生的技术，从一开始就受到广泛的关注和应用，以荧光定量PCR仪为平台，给种革新的技术层出不穷，主要包括，sybrgreen染料法、Taqman探针法、分子信标、FRET等技术，他们各有优缺点和各自不同的应用领域。随着荧光定量PCR技术越来越普及，荧光定量PCR仪成为了医院检验科室不可缺少的仪器。
荧光定量PCR技术中，有一个大的技术类型，称为溶解曲线分析。原理简述如下：荧光定量PCR仪通过对反应体系逐渐增加温度，同时监测每一个温度变化中的荧光信号的强弱，得出曲线。对于染料法的荧光定量PCR实验(例如采用sybrgreen)因为随着反应体系中双链DNA变性，荧光染料或者又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰(Tm，DNA双链解链50％的温度)；对于基于荧光标记的探针的荧光定量PCR实验(例如分子信标，FRET，Eclipse探针)，探针上标记了不同荧光和粹灭基团，当这些探针与其互补的DNA链随着反应体系温度的改变，发生变性和复性的过程，从而使荧光强度发生变化，同样用荧光信号改变的一次导数与温度作图，反应了探针与模板杂交时的特征峰，反应了探针的Tm值。
由于临床常见HPV亚型超过20种，有些亚型与宫颈癌关系不大例如6、11型，有的与宫颈癌关系密切，例如16、18型，有些亚型与宫颈癌关系还不确切，例如53亚型。所以对患者进行HPV亚型分型的诊断很有必要，目前可用于HPV亚型的分型试剂盒大都采用PCR反向点杂交技术，但是这个方法操作时间长，过程繁琐，需要在PCR扩增完毕后，打开PCR反应管进行操作，所以极易造成PCR污染，而且结果通过显示反应表示，带有很大的主观因素。荧光定量PCR技术可以解决这些问题，但是由于荧光通道受局限，目前常用荧光定量PCR仪最为常用的检测通道是FAM和Vic荧光通道，所以最为常用的Taqman探针的荧光定量PCR技术，对于HPV亚型分型检测不是非常合适，应为一个亚型就需要一种荧光，如果仅用Fam和Vic这两个通道，完成23个常见的HPV亚型检测，就需要12个PCR反应管，这显然不利于临床的应用。我们利用荧光定量PCR技术中探针的溶解曲线这一技术途径，因为探针可以根据各个亚型的序列人工设计，所以探针的Tm值也可认为设定，根据不同的Tm值，也可以区分不同的亚型，即使只使用Fam和Vic这两个检测通道，也可以实现一个PCR反应管中最少4个HPV亚型的检测。
我们在实验中选用的是Quenched FRET技术，它是FRET技术的一个衍生，传统的FRET技术又称为双杂交探针，或者LightCycle探针。FRET探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成(距离1-5bp)，上游探针的3`端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5`端标记受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和受体基团紧密相邻，激发供体产生的荧光能量被受体荧光基团吸收，使得检测探头可以检测到受体荧光基团的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到受体荧光基团的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线和SNP检测。Quenched FRET技术利用粹灭性基团，例如BHQ(Black Hole Quenchor)系列、TamraDabcyl、Eclipse等，标记在一条探针的3′端，荧光基团标记在另一条探针的5′端。当探针同时杂交与模板时，粹灭基团与荧光基团互相靠近导致反应体系中的荧光减弱，当变性时两探针游离导致荧光恢复。利用quenched FRET的方法可避免传统FRET的方法对荧光染料选择的局限，理论上各种荧光定量PCR常有的探针标记用的有机染料都可以使用。
探针由各自的TM值(DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度)。所以Quenched FRET的数据是由荧光强度和TM值组成的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种人乳头瘤病毒的分型方法，检测结果准确。
本发明是通过以下的技术方案实现的：
一种人乳头瘤病毒的分型方法：
(1)扩增样品：选用通用HPV扩增引物，上游引物是MY11、PGMY11或上述混合引物组，GP5、GP5+、SPF1或上述混合引物组；下游引物是MY09、PGMY09或上述混合引物组，GP6、GP6+、SPF2或上述混合引物组；
(2)溶解曲线分析：在HPV的DNA或者上一步的PCR产物中加入需要检测亚型的探针，可选用的浓度范围是10-500nM，在荧光定量PCR仪上需要相应的荧光检测通道，设置的溶解曲线程序是温度为20-95℃，温度上升或下降梯度0.1-5℃，每个梯度保持时间0.5-60S。
所述步骤(1)中上游引物浓度50-1000nM，下游引物浓度50-1000nM，反应体系中镁离子浓度的可选范围1.5-5mM。
本发明的有益效果为：可以利用探针不同的荧光标记，和探针Tm值对HPV分型检测，这样可以用一种荧光通道检测不同亚型的HPV。
附图说明
图1是本发明HPV18FAM检测结果图
图2是本发明HPV33FAM检测结果图
图3是本发明HPV35FAM检测结果图
图4是本发明HPV53FAM检测结果图
图5是本发明HPV58FAM检测结果图
图6是本发明HPV39FAM检测结果图
图7是本发明HPV43FAM检测结果图
图8是本发明HPV45FAM检测结果图
图9是本发明HPV56FAM检测结果图
图10是本发明HPV59FAM检测结果图
图11是本发明HPV66FAM检测结果图
图12是本发明HPV68FAM检测结果图
图13是本发明HPV73FAM检测结果图
图14是本发明HPV83FAM检测结果图
图15是本发明HPVMM4FAM检测结果图
图16是本发明HPVB-globinFAM检测结果图
图17是本发明HPV6FAM检测结果图
图18是本发明HPV11FAM检测结果图
图19是本发明HPV16FAM检测结果图
图20是本发明HPV44FAM检测结果图
图21是本发明HPV51FAM检测结果图
图22是本发明HPV52FAM检测结果图
图23是本发明HPV42FAM检测结果图
图24是本发明HPV18FAM检测结果图
具体实施方式
以下结合附图，对本发明做进一步说明。
第一：扩增样品(如果病毒有足够的拷贝数，或者实验要求对灵敏度不高这步可省略)，选用通用HPV扩增引物，上游引物可以是MY11、PGMY11(混合引物组)、GP5、GP5+、SPF1(混合引物组)；下游引物可以是MY09、PGMY09(混合引物组)、GP6、GP6+、SPF2(混合引物组)。这些引物核酸序列已被相关文献发表证实，它们可以很好的扩增HPV L1区域的MY11/09区间。相关引物序列参见相关文献。上下游引物可以组合使用，选取扩增效率符合要求的引物对使用，申请人利用评价了各种组合，认为使用MY11和PGMY09时扩增效率最高。扩增反应条件是
上游引物浓度50-1000nM、下游引物浓度50-1000nM，反应体系中镁离子浓度可选范围1.5-5mM。
第二：溶解曲线分析，在HPV的DNA或者上一步的PCR产物中加入，需要检测亚型的探针，可选用的浓度范围是(10-500nM)，在荧光定量PCR仪上需要相应的荧光检测通道，设置的溶解曲线程序是
Figure BSA00000577005600072
结果如附图1-24。

Claims (2)

1.一种人乳头瘤病毒的分型方法，其特征在于是通过以下的步骤实现的：
(1)扩增样品：选用通用HPV扩增引物，上游引物是MY11、PGMY11或上述混合引物组，GP5、GP5+、SPF1或上述混合引物组；下游引物是MY09、PGMY09或上述混合引物组，GP6、GP6+、SPF2或上述混合引物组；
(2)溶解曲线分析：在HPV的DNA或者上一步的PCR产物中加入需要检测亚型的探针，可选用的浓度范围是10-500nM，在荧光定量PCR仪上需要相应的荧光检测通道，设置的溶解曲线程序是温度为20-95℃，温度上升或下降梯度0.1-5℃，每个梯度保持时间0.5-60S。
2.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒的分型方法，其特征在于所述步骤(1)中上游引物浓度50-1000nM，下游引物浓度50-1000nM，反应体系中镁离子浓度的可选范围1.5-5mM。
CN2011102782279A 2011-09-19 2011-09-19 一种人乳头瘤病毒的分型方法 Pending CN102994645A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011102782279A CN102994645A (zh) 2011-09-19 2011-09-19 一种人乳头瘤病毒的分型方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011102782279A CN102994645A (zh) 2011-09-19 2011-09-19 一种人乳头瘤病毒的分型方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102994645A true CN102994645A (zh) 2013-03-27

Family

ID=47923750

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011102782279A Pending CN102994645A (zh) 2011-09-19 2011-09-19 一种人乳头瘤病毒的分型方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102994645A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103320533A (zh) * 2013-06-26 2013-09-25 清华大学 一种hpv dna基因分型的方法及其试剂盒
CN103602755A (zh) * 2013-08-21 2014-02-26 中山大学达安基因股份有限公司 一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒
CN104017906A (zh) * 2014-06-27 2014-09-03 湖南圣维尔医学检验所有限公司 一种hpv高危型分型荧光pcr检测试剂盒
CN107043828A (zh) * 2017-03-17 2017-08-15 上海星耀医学科技发展有限公司 一种高危人乳头瘤病毒分型检测方法与试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101676408A (zh) * 2008-09-19 2010-03-24 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 6、11型人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测方法及其试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101676408A (zh) * 2008-09-19 2010-03-24 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 6、11型人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测方法及其试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H A CUBIE等: "Rapid real time PCR to distinguish between high risk human papillomavirus types 16 and 18", 《J CLIN PATHOL: MOL PATHOL》 *
张金业等: "双链置换探针实时荧光定量PCR结合融解曲线特性分析检测高危型人乳头瘤病毒16、58亚型", 《交通医学》 *
薛秀蕾等: "人乳头瘤病毒基因检测及分型方法研究进展", 《东南大学学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103320533A (zh) * 2013-06-26 2013-09-25 清华大学 一种hpv dna基因分型的方法及其试剂盒
CN103602755A (zh) * 2013-08-21 2014-02-26 中山大学达安基因股份有限公司 一种电化学基因传感器法检测人乳头瘤病毒20种分型的试剂盒
CN104017906A (zh) * 2014-06-27 2014-09-03 湖南圣维尔医学检验所有限公司 一种hpv高危型分型荧光pcr检测试剂盒
CN104017906B (zh) * 2014-06-27 2016-02-24 湖南圣湘生物科技有限公司 一种hpv高危型分型荧光pcr检测试剂盒
CN107043828A (zh) * 2017-03-17 2017-08-15 上海星耀医学科技发展有限公司 一种高危人乳头瘤病毒分型检测方法与试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102994651B (zh) 用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒
CN101017141A (zh) 诊断人类乳头状病毒（hpv）感染的荧光聚合酶链式反应（pcr）的方法和试剂盒
CN105755169B (zh) 一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒及其应用
CN105603121A (zh) 用于检测高危型hpv的方法、寡核苷酸和试剂盒
CN107177699A (zh) 一种人类乳头瘤病毒（hpv）分型快速检测方法
CN102994645A (zh) 一种人乳头瘤病毒的分型方法
US20240150856A1 (en) Multiplexed nucleic acid detection kit for human papillomavirus (hpv) typing, and detection method
CN104884638A (zh) 用于检测人乳头瘤病毒核酸的组合物和方法
CN105803110B (zh) 同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用
CN101503741A (zh) 用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用
CN110607399B (zh) 用于lamp扩增以检测hpv和分型的引物组合、试剂盒和方法
Fan et al. Visual detection of high-risk HPV16 and HPV18 based on loop-mediated isothermal amplification
CN101624632B (zh) 人乳头瘤病毒基因芯片、制备方法、应用及检测用试剂盒与应用
Zheng et al. Rapid detection of HPV16/18 based on a CRISPR-Cas13a/Cas12a dual-channel system
CN104560962A (zh) 用于检测人乳头瘤病毒的荧光pcr试剂盒及其专用引物组
CN101251469A (zh) 诊断人乳头瘤病毒感染的荧光pcr方法
Okodo et al. Koilocytic changes are not elicited by human papillomavirus genotypes with higher oncogenic potential
JP2013519395A (ja) 近縁のヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）の血清型を検出するためのアッセイ
Wang et al. Rapid in situ hydrogel LAMP for on-site large-scale parallel single-cell HPV detection
CN107641663A (zh) 用于检测高危型人乳头瘤病毒致癌基因e6/e7dna分型的引物和探针及试剂盒
CN108660254B (zh) 生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法
CN105695627A (zh) 一种用于荧光定量pcr检测15型hpv的特异性引物和探针的组合以及试剂盒
CN109402298A (zh) 一种用于定性检测人宫颈脱落细胞中hpv感染的试剂盒
CN113215325B (zh) 二维pcr单管闭管检测多种hpv亚型的反应体系、方法及试剂盒
CN111593140B (zh) 一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20130327