CN102154498B

CN102154498B - 一种核酸的检测方法

Info

Publication number: CN102154498B
Application number: CN2011100675696A
Authority: CN
Inventors: 李庆阁; 许晔; 刘英华; 夏晓虎
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2011-03-21
Filing date: 2011-03-21
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2031-03-21
Also published as: CN102154498A

Abstract

一种核酸的检测方法。涉及核酸的检测技术，提供一种灵敏度高、精确度高、成本低、简便快速的核酸的检测方法及其核酸膜层析杂交试纸条。所述核酸膜层析杂交试纸条包括加样垫、靶核酸序列捕获探针、层析膜、吸水垫和底衬，所述层析膜粘贴于底衬的中部，所述加样垫和吸水垫分别粘贴于所述层析膜两端，所述靶核酸序列捕获探针呈直线状固定在所述加样垫和吸水垫之间的层析膜上。将多色荧光标记探针与膜层析技术相结合，通过荧光和物理位置两个参数区分样品中的模板类型，实现了核酸快速的分型检测。核酸检测的灵敏度高，检测灵敏度可达10¹拷贝/反应。核酸检测特异性高，特异性由引物、检测探针和捕获探针共同保证，使结果更加稳定，更加准确。

Description

一种核酸的检测方法

技术领域

本发明涉及核酸的检测技术，特别涉及一种是以荧光探针为基础的核酸的检测方法。

背景技术

目前，国内外进行基因分型检测的方法越来越多，常见的有核苷酸序列分析，限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)，型特异引物法和型特异探针杂交。测序法虽然最为准确，但技术条件要求高、费用昂贵。RFLP敏感性高，但酶切位点易受基因变异影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响型结果判断。型特异引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)则需要进行多管反应，操作不便而且费用也相对较高。型特异探针杂交法应用越来越广泛，例如基于此技术发展起来的胶体金技术、基因芯片技术、斑点杂交等，这些技术已应用于基因表达分析、基因分型以及临床研究等领域。此类技术是基于互补的双链脱氧核糖核酸(DNA)链能够在一定条件下特异性的结合，即严格按照碱基互补的原则进行，因此，当用一段特定的核酸序列作为探针，与靶核酸混合后，如果两者的碱基能够匹配，它们即互补地结合成双链，从而指示被测核酸模板中含有特定的基因序列。

胶体金免疫层析技术具有简便直观和快速的特点，在早孕检测应用中取得了极大的成功，随后在各个领域迅速被扩大应用。2009年，Liu等(1、X.Mao，Y.Q.Ma，A.G.Zhang，L.R.Zhang，L.W.Zeng and GD.Liu，Disposable Nucleic Acid Biosensors Based on Gold Nanoparticle Probesand Lateral Flow Strip，Anal.Chem.，2009，81(4)，1660-1668)制备的核酸层析金标试纸条，使用胶体金标记核酸探针，可直接检测核酸DNA，检测人基因组DNA的检出限达0.5nM，适应于现场检测。公开号CN1811447A的中国专利公开了一种特异性核酸序列扩增物的单探针及双探针检测方法，此发明使用通用的两种抗体，用标准试纸条检测任何来源的核酸序列扩增物。这些报道或专利所检测的方法可以实现快速定性的检测，但是探针标记过程复杂，信号检测依赖呈色反应而灵敏度低，而且只有单种颜色而使得检测靶序列数目有限。

基因芯片技术是近年来分子生物学及医学研究领域的重要进展，可一次性对大量样品基因序列进行检测和分析，具有高通量和自动化等特点，解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低的缺点。公开号CN101792819A的中国专利公开了一种高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，该方法也使用胶体金标记核酸探针，通过银染来提高金信号，通过目视直接进行信号的判断，解决了目前检测结果不能通过肉眼直接看到的缺点。公开号CN1354258的中国专利公开了一种生物大分子快速检测的层析生物芯片技术，主要是根据DNA、信使核糖核酸(mRNA)和蛋白抗体溶液层析过程中被固定的DNA和蛋白探针捕获的原理设计，用流动相带动样品沿膜载体层析，靶物质会被相应的固定探针阵列俘获，达到快速分离鉴定的目的。但上述基因芯片方法存在检测针对性不强，尤其是成本高，依赖于大型仪器等问题，不利于临床上的广泛应用，更重要的是，目前大量研究发现在某一疾病发生发展过程中仅有小部分基因(几十到几百个)表达谱发生变化，而高密度基因芯片所选基因固定，缺乏个性化，在疾病研究中应用势必造成资源浪费。

另外，公开号为CN101748204A的中国专利公开了一种基于微流控的核酸杂交平台及杂交分析方法，该杂交分析方法以离心力和毛细管作用力作为驱动力促使液流在杂交通道中自动地往复流动，样品液流在毛细管作用力下由临时集液池返回杂交通道，这样重复的旋转和停止芯片就可以实现液流的往复。此发明具有物质传质快，杂交时间短，样品消耗少，并且可以同时对多个样品进行平行分析等优点。公开号为CN101886141A的中国专利公开一种鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒，是用特定引物通过PCR，再通过交叉斑点分子杂交，以特异性核酸探针检测样品中致病性外源性禽白血病毒特异性核酸的存在。利用该发明所涉及的试剂盒，对从组织样品中提取的基因组DNA作交叉斑点分子杂交或对提取的DNA用相应引物扩增后的PCR产物作交叉斑点分子杂交，可在24～36h内完成检测并报告结果。此类方法的检测时间较长，需要的样品较多，要实现大规模的临床应用较困难。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种适用范围广、灵敏度高、精确度高、成本低、简便快速的核酸的检测方法。

本发明的第二目的在于提供一种核酸膜层析杂交试纸条。

本发明的第三目的在于提供一种人乳头瘤病毒的检测方法。

本发明的第四目的在于提供一种检测人乳头瘤病毒的膜层析杂交试纸条。

所述一种核酸的检测方法包括以下步骤：

1)根据待测样品的核酸序列，设计PCR扩增的引物、靶核酸序列检测探针和靶核酸序列捕获探针；

2)将PCR扩增的引物和靶核酸序列检测探针加入PCR扩增反应体系中，对待测样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，所述PCR扩增产物中的靶核酸序列与所述靶核酸序列检测探针形成二元杂交复合物；

3)将所得PCR扩增产物置于含有步骤1)中的靶核酸序列捕获探针的核酸膜层析杂交试纸条上进行膜层析分离，所述核酸膜层析杂交试纸条上的靶核酸序列捕获探针捕获PCR扩增产物中的二元杂交复合物，形成三元杂交复合物；

4)通过荧光扫描仪读取步骤3)中获得的三元杂交复合物中的荧光信号，分析所得荧光信号即得核酸检测结果。

在步骤1)中，所述靶核酸序列检测探针的熔点低于所述PCR扩增体系的退火温度；所述靶核酸序列检测探针至少有两种且标记有荧光染料；所述靶核酸序列捕获探针可用生物素标记。

所述核酸膜层析杂交试纸条包括加样垫、靶核酸序列捕获探针、层析膜、吸水垫和底衬，所述层析膜粘贴于底衬的中部，所述加样垫和吸水垫分别粘贴于所述层析膜两端，所述靶核酸序列捕获探针呈直线状固定在所述加样垫和吸水垫之间的层析膜上。

所述加样垫用以吸收和承载待测样品，可为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；所述靶核酸序列捕获探针带有荧光染料，可捕获待测基因，形成靶基因-检测探针二元杂交复合物；所述层析膜用以固定靶核酸序列捕获探针和支持层析反应，可为尼龙膜、PVDF膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜等，最好为硝酸纤维素膜；所述吸水垫用来吸收层析反应过程中的反应液，控制样品的流速，促进虹吸作用，并使试剂跨膜流动，材质可为棉仔绒、棉纤维或纤维素等；所述底衬作为支持物，可为聚氯乙烯或聚苯乙烯等。

所述核酸膜层析杂交试纸条的制备方法包括以下步骤：

1)将层析膜粘贴底衬的中部；

2)将加样垫和吸水垫分别粘贴于步骤1)所述层析膜的两端，并分别与层析膜相连接；

3)将靶核酸序列捕获探针呈直线状固定在所述加样垫和吸水垫之间的层析膜上，即得核酸膜层析杂交试纸条。

在步骤3)中，所述固定可采用亲和素或抗体结合的方式。

所述一种人乳头瘤病毒的检测方法包括以下步骤：

1)根据人乳头瘤病毒的核酸序列，设计PCR扩增的引物、人乳头瘤病毒序列检测探针和人乳头瘤病毒序列捕获探针；

所述PCR扩增的引物序列为：

GP5+：5’-ACGTTGGATGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACG-3’

GP6+：5’-ACGTTGGATGGAAAAATAAATTGTAAATCATAC-3’

β-globinF：5’-ACGTTGGATGGGAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’

β-globinR：5’-ACGTTGGATGCTAGTGAACACAGTTGTG-3’

所述人乳头瘤病毒序列检测探针为：

HPV6：5’-FAM-CATGACATTATGTGCATC-NH₂-3’

HPV11：5’-ROX-CAAATATGACACTATGTGC-PO₄-3’

HPV16：5’-FAM-TATGTCATTATGTGCTGC-NH₂-3’

HPV18：5’-ROX-TATGTGCTTCTACACAGT-PO₄-3’

β-globin：5’-FAM-GCCACACCCTAGGGTT-NH₂-3’

所述人乳头瘤病毒序列捕获探针为：

HPV6：5’-ATCTTCCACATACACCAATT-biotin-3’

HPV11：5’-ATCTGCTACATACACTAATTC-biotin-3’

HPV16：5’-CATATCTACTTCAGAAACTAC-biotin-3’

HPV18：5’-GTACCTGGGCAATATGAT-biotin-3’

β-globin：5’-CCAATCTACTCCCAGGAG-biotin-3’

2)并将步骤1)设计好的的引物和人乳头瘤病毒序列检测探针加入PCR扩增反应体系中，对待测人乳头瘤病毒进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，所述PCR扩增产物中的人乳头瘤病毒序列与所述人乳头瘤病毒序列检测探针形成二元杂交复合物；

3)将步骤2)所得PCR扩增产物置于含有步骤1)中人乳头瘤病毒序列捕获探针的核酸膜层析杂交试纸条上进行膜层析分离，所述核酸膜层析杂交试纸条上的人乳头瘤病毒序列捕获探针捕获PCR扩增产物中的二元杂交复合物，形成三元杂交复合物；

4)通过荧光扫描仪读取步骤3)中的三元杂交复合物中的荧光信号，分析所得荧光信号即得人乳头瘤病毒检测结果。

所述检测人乳头瘤病毒的膜层析杂交试纸条包括加样垫、人乳头瘤病毒序列捕获探针、层析膜、吸水垫和底衬，所述层析膜粘贴于底衬的中部，所述加样垫和吸水垫分别粘贴于所述层析膜两端，所述人乳头瘤病毒序列捕获探针呈直线状固定在所述加样垫和吸水垫之间的层析膜上。

本发明采用PCR扩增技术，并结合层析膜上杂交检测法，既保留了PCR高灵敏度的特点，又进一步提高了单管检测的通量，同时还保持了传统试纸条层析法简便快速的特点。本发明采用多色荧光分子标记的检测探针与靶序列共同层析，并被层析膜上固定的捕获探针特异性捕获，通过扫描检测探针的多色荧光信号，结合层析膜上的物理位置，以二维的方式实现对靶基因的分型检测。本发明中的内置式检测探针组包括多条型特异型检测探针，直接内置于扩增反应管内，扩增完成即可进行层析，无需另行添加，无需进行预杂交。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)将多色荧光标记探针与膜层析技术相结合，通过荧光和物理位置两个参数区分样品中的模板类型，实现了核酸快速中通量的分型检测。

2)将PCR技术、内置式探针组和膜层析技术的有机结合，在扩增完成后，只需将核酸扩增产物直接加到加样垫上即可，一步法完成，10～20min就能给出明确的结果。避免了传统方法对扩增产物进行变性处理、预杂交和多步洗涤等繁琐的步骤。使用该技术制备的试纸条操作简便，省时省力，不需要专业人员的操作，有利于大规模推广使用。

3)核酸检测的灵敏度高，检测灵敏度可达10¹拷贝/反应。

4)核酸检测特异性高，特异性由引物、检测探针和捕获探针共同保证，使结果更加稳定，更加准确。

5)成本较低。所需原材料、技术和仪器均较简单，易获得。

附图说明

图1为本发明中核酸膜层析试纸条的结构示意图。在图1中，层析膜2粘贴于底衬4的中部，所述加样垫1和吸水垫3分别粘贴于所述层析膜两端，所述靶核酸序列捕获探针呈直线状固定在所述加样垫和吸水垫之间的层析膜上，形成检测线5。

图2是本发明实施例中核酸膜层析试纸条检测HPV的结果图。在图2中，横坐标为数据点，纵坐标为荧光强度(mV)；曲线a为FAM染料标记HPV6、HPV16和β-globin靶核酸的检测探针，曲线b为ROX染料标记HPV11和HPV18靶核酸的检测探针；图中的5个检测峰，从左至右分别代表HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和β-globin的扩增产物峰。

图3本发明实施例中核酸膜层析试纸条检测HPV16的灵敏度的扫描结果。在图3中，横坐标为数据点，纵坐标为荧光强度(mV)；NTC代表不加HPV模板(用水代替)进行PCR反应的对照；检测灵敏度从上至下分别为10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹。

具体实施方式

本发明首先通过设计引物和优化用量，以对待测样品模板进行指数后线性PCR(LATE-PCR)扩增，获得大量的单链DNA(ssDNA)。依据每种扩增片段的序列，分别设计带有荧光标记的检测探针，这些检测探针将直接加入到扩增反应体系中，与各自的靶DNA杂交，扩增完成即可进行层析，无需另行添加，无需预杂交；同时，还需依据每种扩增片段的序列分别设计捕获探针，这些捕获探针带有生物素或其它小分子标记物，可通过亲和素或对应抗体固定到层析膜的特定位置上。当进行样品检测时，模板首先被扩增并获得大量ssDNA，反应结束后，在PCR管内与检测探针形成二元杂交产物。该二元杂交产物可直接或稀释后在层析膜上进行层析，并被特异的捕获探针所捕获，形成三元杂交复合物。最后通过荧光扫描仪直接读取三元杂交复合物中检测探针的荧光信号，通过荧光信号产生的位置和波长，即可区分不同的基因型，实现快速简便的中通量基因分型检测。

以下实施例是本发明在人乳头瘤病毒分型检测中的具体应用，但本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何本领域技术人员，都可以按照本专利的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明，这些并未脱离本发明描述的基本概念。因此，这些修改或者不同的应用都在应本发明的保护范围之内。

实施例1人乳头瘤病毒(HPV)6型、11型、16型、18型快速分型检测试纸条的制备

本实施例以HPV6、HPV11、HPV16、HPV18 4种基因型作为检测对象，利用本发明所提供的方法，实现对4种基因型的快速分型检测，具体实现步骤如下：

一、PCR扩增引物的设计

首先需要借助于软件，如Primer 5.0和BLAST，通过待测样品序列比对以及根据LATE-PCR引物设计的原理进行引物设计，然后通过对引物的用量、退火温度等扩增条件的优化，以及后续的核酸杂交验证，筛选并获得扩增效率高、特异性好的单链核酸扩增体系。该体系可对靶序列进行高效扩增并获得大量的单链核酸片段，扩增产物可直接用于后续的杂交反应，而无需像常规方法一样对双链扩增产物进行变性处理。

以HPV L1克隆重组质粒为模板，确立优化了各种最佳条件，将这些测序证实的重组质粒作为阳性对照，并加用空白对照从而确保实验的准确性和严密性。

HPV型别众多，对HPV DNA的检测，既需广谱又要求具有型特异性，分别以HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV6+11+16+18型试纸条检测不同的HPV亚型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82、6、11、26、40、42、43、44、53、54、66、69、70、72、81)，显示出优异的特异性。“○”表示阴性结果，“√”表示阳性结果。(参见表1)

表1不同HPV亚型特异性检测

HPV DNA检测引物的具体序列如下：

GP5+：5’-ACGTTGGATGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACG-3’

GP6+：5’-ACGTTGGATGGAAAAATAAATTGTAAATCATAC-3’

β-globinF：5’-ACGTTGGATGGGAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’

β-globinR：5’-ACGTTGGATGCTAGTGAACACAGTTGTG-3’

PCR扩增体系为：

25μl扩增体系中，含2.5μl 10×PCR扩增缓冲液，3mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP混合物，0.08pmol上游引物，0.8pmol下游引物，0.4pmol/检测探针，1U Taq DNA聚合酶，0.1～2μg模板DNA，最后加双蒸水至25μl。

PCR扩增反应条件为：95℃，5min；95℃，15s；55℃，15s；72℃，10s；50个循环；72℃，10min。取PCR产物5ul，进行1.6％琼脂糖凝胶电泳检测，从电泳结果可以得知各亚型扩增的产物是否大小正确，符合所用的这对通用引物的DNA扩增片段长度为150bp左右，无非特异条带出现，证明有HPV目的条带出现，然后再将PCR的扩增产物进行核酸层析的检测。凝胶电泳的条件为：1×TBE缓冲液，电压100V，电泳时间30min。

二、检测探针的设计

通过对各PCR产物序列的比对，在扩增产物的型特异性区域各设计一条检测探针，检测探针的5′或3′末端标记荧光基团，荧光基团可以是相同也可以是不同的。标记相同荧光基团的探针通过膜上的物理位置区分，标记不同荧光基团的探针通过发射光波长区分。若荧光基团标记在探针的5′末端，则另一端需要进行封闭，以免发生延伸反应。荧光基团和封闭基团可直接通过DNA合成仪通过化学合成的方式标记到检测探针上。此探针组中各探针的熔点均低于PCR扩增体系的退火温度，因此可直接加入到PCR扩增体系中，而不影响扩增。扩增反应结束时，各探针也已完成与靶序列的杂交，无需变性处理和预杂交，可直接用于层析反应。

1)带有荧光标记的靶核酸序列检测探针(即荧光检测探针)的设计，以HPV6、11、16、18为例，以β-珠蛋白(globin)作为内参(控制线)具体序列如下：

HPV6：5’-FAM-CATGACATTATGTGCATC-NH₂-3’

HPV11：5’-ROX-CAAATATGACACTATGTGC-PO₄-3’

HPV16：5’-FAM-TATGTCATTATGTGCTGC-NH₂-3’

HPV18：5’-ROX-TATGTGCTTCTACACAGT-PO₄-3’

β-globin：5’-FAM-GCCACACCCTAGGGTT-NH₂-3’

检测探针的5′末端标记荧光基团(HPV6/16标记FAM，HPV11/18标记ROX)，另一端需要进行氨基基团或是磷酸基团封闭，以免发生延伸反应。。其中FAM指羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，与FITC相比，FAM与氨基反应更快。ROX是指5-羧基-X-罗丹明，Carboxy-X-rhodamine。该检测探针序列与待检靶核酸序列互补，因此可以特异性的杂交，形成扩增物-荧光检测探针复合物二元杂交复合物。

用pH8.3的10mM Tris-HCl溶解检测探针，得到浓度是50μM的检测探针溶液。

2)捕获探针的设计

捕获探针具有生物素标记，其序列与待检靶核酸序列互补，保证了检测的特异性，减少了假阳性的产生，将该探针与亲和素以一定的比例混合后，通过点膜仪呈线条状固定于膜上形成检测线和控制线。以HPV6/11/16/18为例：

HPV6：5’-ATCTTCCACATACACCAATT-biotin-3’

HPV11：5’-ATCTGCTACATACACTAATTC-biotin-3’

HPV16：5’-CATATCTACTTCAGAAACTAC-biotin-3’

HPV18：5’-GTACCTGGGCAATATGAT-biotin-3’

β-globin：5’-CCAATCTACTCCCAGGAG-biotin-3’

用pH8.3的10mM Tris-HCl溶解捕获探针，得到浓度是50μM的杂交捕获探针溶液。

三、核酸膜层析试纸条的制备

核酸膜层析试纸条由由加样垫1、捕获探针、层析膜2、吸水垫3和底衬4组成(参见图1)。加样垫用以吸收和承载样品，多为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；通过对各PCR产物序列的比对，在扩增产物型特异性区域(不同于检测探针杂交区域)各设计一条捕获探针，这些捕获探针带有生物素或其它小分子标记物，可通过亲和素或对应抗体固定到层析膜的特定位置上形成检测线5(根据需要还可设置控制线，指示检测的有效性)，以捕获特定基因型的靶基因-检测探针复合物；所说的层析膜用以固定捕获探针和支持层析反应，常用的层析膜包括尼龙膜、PVDF膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或者硝酸纤维素与醋酸纤维素的混合膜等，优选硝酸纤维素膜；所说的吸水垫用来吸收反应液，以支持层析反应的进行；所说的底衬通常为聚氯乙烯或聚苯乙烯材质，是作为支持物，可将加样垫、层析膜和吸水垫粘贴其上。

制备方法包括以下步骤：

1)将层析膜(Millipore HF135)按长轴方向粘贴于长条形底衬的中部；

2)通过点膜仪将各型捕获探针和控制线核酸捕获探针沿长轴方向依次呈线条状以1.0μL/mm的速度直接固定在层析膜上，形成检测线和控制线；

3)将加样垫(玻璃纤维素膜BT40)和吸水垫(Whatman470)分别粘贴于底衬上层析膜的两边，并分别与层析膜相接；

4)将步骤3)中的层析膜用切条机，垂至于长轴方向裁切成条状，条宽通常为3～4mm，即为核酸膜层析杂交试纸条。

四.杂交反应和荧光检测

30μl样品与50μl杂交液(67mM Tris-HCl，pH 8.8，16.6mM(NH4)₂SO4，1％(V/V)Tween-20)混合均匀后，加到层析试纸条的加样垫上，37℃温育15min，以荧光扫描仪进行检测，并对结果进行分析。四重核酸检测结果表明：4个待检靶基因以及一个控制线靶基因在层析膜被很好的区分和检测(参见图2)。以HPV16型为例，考察了本发明的检测灵敏度，从结果可以看出检测灵敏度可达10¹拷贝/反应(参见图3)。

荧光标记探针-靶核酸复合物形成的二元杂交符合物在溶液中通过毛细作用沿纤维膜向吸水垫一侧流动，当该二元杂交复合物遇到固定于膜上的检测线和控制线时，待检的靶核酸与线条上的捕获探针结合，形成检测探针-靶核酸-捕获探针的三元杂交复合物，从而滞留在检测线(或控制线)上。以荧光扫描仪检测，根据层析膜上扫描获得的荧光峰的位置和荧光通道，进行分型结果的判定，即可在同一条膜上分型检测出不同的核酸序列。当特异性的扩增物不存在时，不能形成检测探针-靶核酸-捕获探针的三元杂交复合物，仅在控制线上出现峰值，则为阴性结果。层析反应结束后，只要根据检测不同基因型纸条上的检测线是否出现及出现的峰值高低和位置，即可以判断样本的基因型，这极大地降低了对实验操作人员的相关技能的要求，避免了复杂的仪器操作和烦琐的数据和图像分析过程。无需经过任何的洗涤或显色等步骤，可直接进行荧光信号的读取，大大简化了操作，缩短了时间，提高了效率。

本发明运用膜层析技术原理进行检测，核酸在层析膜上杂交、分离和检测的过程将使检测性能更灵敏。整个层析反应只需要一步加样操作，10～20min即可完成反应，并进行荧光扫描。控制线的显示与否用以判断该试纸的有效性，而根据检测线的显示来判断检测结果。检测过程以特异性的检测探针和特异性的捕获探针来共同保证检测的高度特异性，从而保证检测结果的准确性。

Claims

1.一种核酸的检测方法，其特征在于其包括以下步骤：

1）根据待测样品的核酸序列，设计PCR扩增的引物、靶核酸序列检测探针和靶核酸序列捕获探针；所述靶核酸序列检测探针的熔点低于所述PCR扩增体系的退火温度，所述靶核酸序列检测探针至少有两种且标记有荧光染料，所述靶核酸序列捕获探针用生物素标记；

2）并将步骤1）设计好的的引物和靶核酸序列检测探针加入PCR扩增反应体系中，对待测样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，所述PCR扩增产物中的靶核酸序列与所述靶核酸序列检测探针形成二元杂交复合物；

3）将步骤2）所得PCR扩增产物置于含有步骤1）中靶核酸序列捕获探针的核酸膜层析杂交试纸条上进行膜层析分离，所述核酸膜层析杂交试纸条上的靶核酸序列捕获探针捕获PCR扩增产物中的二元杂交复合物，形成三元杂交复合物；

4）通过荧光扫描仪读取步骤3）中的三元杂交复合物中的荧光信号，分析所得荧光信号即得核酸检测结果。

2.如权利要求1所述一种核酸的检测方法，其特征在于在步骤3）中，所述核酸膜层析杂交试纸条包括加样垫、靶核酸序列捕获探针、层析膜、吸水垫和底衬，所述层析膜粘贴于底衬的中部，所述加样垫和吸水垫分别粘贴于所述层析膜两端，所述靶核酸序列捕获探针呈直线状固定在所述加样垫和吸水垫之间的层析膜上。

3.如权利要求2所述一种核酸的检测方法，其特征在于所述加样垫为玻璃纤维，所述靶核酸序列捕获探针带有荧光染料，所述层析膜为尼龙膜、PVDF膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜中的一种；所述吸水垫为棉仔绒、棉纤维或纤维素，所述底衬为聚氯乙烯或聚苯乙烯。

4.如权利要求1所述一种核酸的检测方法，其特征在于在步骤3）中，所述核酸膜层析杂交试纸条的制备方法包括以下步骤：

1）将层析膜粘贴底衬的中部；

2）将加样垫和吸水垫分别粘贴于步骤1）所述层析膜的两端，并分别与层析膜相连接；

3）将靶核酸序列捕获探针呈直线状固定在所述加样垫和吸水垫之间的层析膜上，即得核酸膜层析杂交试纸条。

5.如权利要求4所述一种核酸的检测方法，其特征在于在步骤3）中，所述固定采用亲和素或抗体结合的方式。