CN116622805A - 一种用于核酸检测的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于核酸检测的试剂盒，该试剂盒包括免疫层析试纸和扩增目标核酸的反应体系。免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有胶体金标记抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜及吸水滤纸；样品垫包被有链霉亲和素蛋白标记的胶体金颗粒；T线由抗地高辛抗体或荧光标记相应抗体形成；C线由链霉亲和素抗体形成。核酸反应体系包括用于扩增目标核酸的反应引物、探针及样本稀释液。本方法可用于PCR核酸检测体系或等温扩增体系，或CRISPR的检测，有简便、快速、便携、可实现现场检测及无需专业操作人员等优点，实现了核酸的快速定性检测。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域，尤其涉及一种用于核酸检测的试剂盒。
背景技术
目前适用于CRISPR核酸检测的 LFCA（lateral flow chromatographic assay ）试纸主要采用“三明治夹心法”，具体的原理为在报告分子两端连有发光基团（FAM）和生物素（Biotin），样品滴在样品垫上，样品经毛细作用向吸水纸一侧流动，先经过C线，后经过T线。在流动过程中，报告分子与anti-FAM金纳米颗粒结合，若不存在底物则切割反应不发生，报告分子-金纳米颗粒被链霉素亲和素捕捉，形成第一条条带；若存在底物则切割反应启动，金纳米颗粒会被抗体捕捉而无法被链霉素亲和素捕捉，形成第二条条带即检测T线，如图1所示。
该方法在侧流层析卡制备过程中为实现C线的拦截，会采用降低划线浓度以及降低金标抗体浓度的方式，来使得截留效果更好，但这样做的结果会造成阳性率不足，假阴性率较高的情况出现；另一方面，与传统胶体金检测卡中C线对于反应的有效性把控不同，此方法中当阳性强度较高时，可能会出现C线消线的情况，即阴性、阳性都有可能出现单一条带的情况，可能会造成无效结果的误判以及判读难度较高，为解决这一技术问题，发明专利公开号CN 111621598 A公开了一种消线法制备免疫层析试纸的方法，即通过结合CRISPR核酸检测系统实现对多种特定核酸(病原、基因突变、耐药突变等)的检测，但该方法以T线消线判读阳性，无法满足高灵敏度的需求，且以链霉亲和素作为包被原捕获探针标记生物素特异性比抗原抗体间的特异性反应略有不足。由于该方法灵敏度不足，不能满足常规PCR项目的检测。因此，为提高阳性结果的检出率，提高结果的有效性判读，需寻找更合适的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于核酸检测的试剂盒。
为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括用于核酸检测的免疫层析试纸；
所述免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有胶体金标记抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜及吸水滤纸；
所述样品垫包被有链霉亲和素蛋白标记的胶体金颗粒；
所述T线由抗地高辛抗体或其他标记用荧光素相应抗体形成；
所述C线由链霉亲和素抗体形成。
进一步的，所述试剂盒还包括核酸检测的反应体系；所述反应体系包括用于扩增目标核酸的反应引物、探针及样本稀释液。
进一步的，所述反应体系用于核酸扩增体系或核酸CRISPR体系中的任意一种。
进一步的，所述核酸扩增体系的探针两侧标记的标记物包括生物素或荧光素或地高辛中的任意一种。
进一步的，所述样本稀释液为带有磷酸盐、吐温-20、Tris-HCl的缓冲溶液。
进一步的，所述的核酸扩增反应体系包括PCR扩增体系和等温扩增体系。
本方案采用生物素与地高辛或荧光素为标记物，标记在检测探针的两端，本方法参考胶体金竞争法检测原理制备胶体金检测卡，以抗地高辛抗体作为检测线（T线）包被在硝酸纤维素膜上，以链霉亲和素抗体作为质控线（C线）包被在硝酸纤维素膜上；采用胶体金标记链霉亲和素，结合探针一端的标记物生物素，当结合的探针-金标蛋白复合物层析到质控线时，可被C线包被的链霉亲和素抗体截留，金粒子富集显色。
当反应体系中的探针层析到T线时，探针一端标记的地高辛与预先包被的抗-地高辛抗体发生抗原抗体的特异性反应，截留在检测线（T）上，探针另一端的生物素与金标链霉亲和素（SA）结合，同时会一起截留在检测T线上，则SA上标记的金粒子富集显色，此时T线、C线同时显色。当反应启动时，由于检测探针会发生切割，一条探针被剪开后，则两端的标记物发生分离变成游离状态，分开后地高辛抗体继续结合3’端的地高辛，而缺少另一端生物素标签，使得可富集的金标SA减少，T线颜色降低，剪切越多，断裂的探针越多，可截留在T线上的完整探针越少，T线颜色越浅甚至消线。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本方法可用于核酸扩增体系或CRISPR的检测，有简便、快速、便携、可实现现场检测及无需专业操作人员等优点，实现了核酸的快速定性检测。
采用参与反应的探针浓度来测定核酸含量，提高了检测的特异性和准确度。此外，采用地高辛抗体作为检测物包被于T线，通过抗原抗体的特异性结合可以提高T线反应的特异性，降低反应的假阳性。
在传统方法中，通常以阴性样本检测时的C线与T线颜色一致来判读，以T线颜色浅于C线或消线作为阳性判读依据，但在实际应用中多会出现主观判断的错误，因此本项目中采取以T线强于C线作为阴性判读标准，降低结果的误判，如图2所示；采用标记的链霉亲和素蛋白与探针5’端的生物素结合，可实现3’端任意标记物的变换，可用于多重反应的检测，通过不同的标记物的判读，在同一张检测卡上实现多基因的区分。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为上T（检测线）下C（质控线）的显色图；
图2为本方案的判读依据图；
图3为CRISPR反应产物采用免疫层析试纸法的结果图，其中1-4为阳性，5-6为阴性；
图4为CRISPR反应产物采用荧光法的结果图，其中1-4为阳性，5-6为阴性；
图5为CRISPR反应产物采用qPCR法验证的结果图，其中1-4为阳性，5-6为阴性；
图6为PCR产物采用免疫层析试纸法的检测结果图；
图7为PCR产物采用qPCR法的检测结果图；
图8为PCR产物采用商品化CRISPR检测卡检测的结果图。
具体实施方式
以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1用于核酸检测的侧流层析试纸制备
用于核酸检测的侧向流试纸按流动方向排序依次包括含有胶体金标记链霉亲和素蛋白的样品垫、含有T线和C线的NC膜以及吸水滤纸三部分。
（1）含胶体金标记链霉亲和素的样品垫的制备
a. 胶体金标记链霉亲和素溶液：每1mL上述胶体金溶液加入2-8μL 0.2M的碳酸钾水溶液以及0.01-1mg链霉亲和素蛋白，得到胶体金标记链霉亲和素溶液。
b. 将1mL胶体金标记链霉亲和素蛋白溶液喷在0.005m2 面积的样品垫上，包被浓度为0.001-0.02mg/mL，得到含有胶体金标记链霉亲和素的样品垫。
（2）含有T线和C线的NC膜的制备
a.检测线包被溶液，溶质为地高辛抗体，溶剂为磷酸盐包被缓冲液(PH5.7-8.5)，蔗糖(0.1%-5%)，硫柳汞0.01%-2%（或其他防腐剂）。
b.质控线包被溶液，溶质为链霉亲和素抗体，溶剂为磷酸盐包被缓冲液(PH5.7-8.5)，蔗糖(0.1%-5%)，硫柳汞0.01%-2%（或其他防腐剂）。
c.将30μL上述地高辛抗体溶液喷施在NC膜上，形成T线，包被浓度为0.1-1.5mg/mL；将30μL链霉亲和素抗体溶液喷施在硝酸纤维素膜(NC膜)上，形成C线，包被浓度为0.001-10mg/mL；且T线和C线间隔5mm，得到含有T线和C线的NC膜。
（3）层析试纸的组装
将上述含有胶体金标记链霉亲和素的样品垫、含有T线和C线的NC膜和吸水滤纸按照层析方向依次组装在PVC底板上，得到用于核酸检测的层析试纸。
实施例2基于CRISPR检测体系的检测方法
（1）单链DNA
单链DNA的两端分别标记地高辛和生物素，Dig/ biotin -ssDNA-reportor-biotin/Dig，其中生物素与胶体金标记链霉亲和素蛋白结合，地高辛与试纸条上的地高辛抗体结合。
（2）crRNA的制备：
首先对人工合成的DNA模板进行预扩增，采用引物N-crRNA1和N-crRNA1-R，序列分别详见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，预扩增的反应程序为，94℃，5min；然后94℃30s，52℃30s进行30个循环；最后80℃10min，扩增产物进行纯化处理。
然后进行体外转录crRNA，反应体系为ATP、GTP、CTP、UTP各1μL，T7 polymerase 5μL、10X T7 polymerase buffer 10μL，RNase inhibitor 3μL，涡旋振荡，瞬时离心，于PCR仪上37℃温育2h 或过夜（16h）。采用RNA纯化试剂盒对扩增产物进行纯化处理。
（3）RT-RPA扩增产物的制备
提取待测样本中的核酸为目标核酸500cp/ml（以新冠病毒为例），作为预扩增的模板。利用RT-RPA扩增试剂盒对目标核酸进行预扩增，简要步骤如下：首先将10μL模板、2.5 μL上下游引物N-Exo-S和N-Exo-A 1-10μM，N-Exo-S、N-Exo-A序列详见SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4，20μL A Buffer，10μL无菌无酶水配制为混合液，加入到装有冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分溶解均匀。向每个反应管管盖上加入2μL B Buffer溶液，合上管盖，上下颠倒5-6次混匀，快速离心10秒钟。将上述反应管放置在37-42℃条件下反应20分钟，得到RT-RPA扩增产物。
（4）CRISPR反应产物的制备
利用LwCas12a蛋白和单链DNA进行CRISPR反应，20μL体积CRISPR反应体系如下：10μL RT-RPA产物；1μL LwCas12a蛋白1-10μM；2μL Buffer预混液，0.85μL相应crRNA(10-500nM)；0.24μL单链DNA10-200nM（序列详见SEQ ID NO.5）；5.91μL无酶水。将上述反应体系的反应管盖上管盖，上下颠倒5-6次混匀，低速离心10秒钟后，放置在37-42℃条件下反应20分钟，得到CRISPR反应产物。
取CRISPR反应产物2-20μL与80-98μL样本稀释液（磷酸盐缓冲液、0.1%-5%蔗糖、0.01%-10%吐温-20）充分混匀加入到本发明的侧流层析试纸以及市售试纸条的加样孔中，静置3-15分钟肉眼观察并拍照记录结果（图3）。
若试纸有C线显现而T线颜色明显浅于C线或无T线时，待测样本含有目标核酸，判定为阳性；若试纸有C线显现而有T线明显强于C线时，则待测样本不含有目标核酸，判定为阴性。
同时采用CRISPR-荧光法（图4）与qPCR法验证检测样本（图5），对比验证试纸法结果的准确性，可得到相同结果，证明本发明方法具有良好的准确性。
实施例3基于PCR扩增体系的检测方法
（1）PCR扩增方法
提取待测样本中目标核酸（以新冠病毒为例）。然后在灭菌的0.2ml PCR管中，在20μL的反应体系中，针对不同的基因型分别加入不同的PCR扩增引物N-F1/N-R1（序列详见SEQID NO.6和SEQ ID NO.7）和两端带有标记探针，5'-digoxin 3'Biotin（序列详见SEQ IDNO.8），等浓度的N-F1和N-R1引物对不同的基因型进行特异性的扩增；加入等浓度的四种脱氧核苷酸dATP，dTTP，dGTP，dCTP各2 mmol/L；加入10x反应缓冲液2μL，其中包括20mmol/LTris-HCl PH8.9，50mmol/L KCl，MgCl21.5mmol/L；分别加入提取好的模板4μL，短暂离心后进行PCR循环。
PCR循环参数为95 ℃ 1-5min， 93－96℃ 1-5min ，60-72℃ 1-5min，72℃2-5min，30-50个循环 ；93－96 ℃ 5s-5min，45-55℃ 1-5min ，2-10个循环；95℃ 5min。
在PCR扩增过程中，若有待测核酸，则在反应的进行过程中，带有双标记的特异性探针参与扩增反应，不断进行切割引导核酸的扩增发生，形成延伸产物。
（2）PCR扩增产物检测结果及对比
取PCR扩增产物2-20μL与80-98μL样本稀释液充分混匀加入到侧流层析试纸的加样孔中，静置3-15分钟肉眼观察并拍照记录结果（图6）。
若试纸有C线显现而T线颜色明显浅于C线或无T线时，待测样本含有目标核酸，判定为阳性；若试纸有C线显现而有T线明显强于C线时，则待测样本不含有目标核酸，判定为阴性；若试纸没有C线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。同时采用qPCR法和商品化的CRISPR检测卡验证检测样本，对比验证本方案中层析试纸法结果的准确性，qPCR法（图7）与本方案中层析试纸法可得到相同结果，商品化的CRISPR检测卡的检测结果（图8），阴性、阳性都出现单一条带的情况，无法区分阴性阳性。该结果证明本发明方法具有良好的准确性，且对于其他等温扩增体系的产物，也具有相同的准确性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于核酸检测的免疫层析试纸；
所述免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有胶体金标记抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜及吸水滤纸；
所述样品垫包被有链霉亲和素蛋白标记的胶体金颗粒；
所述T线由抗地高辛抗体或其他标记用荧光素相应抗体形成；
所述C线由链霉亲和素抗体形成。
2.根据权利要求1所述的用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸检测的反应体系；所述反应体系包括用于扩增目标核酸的反应引物、探针及样本稀释液。
3.根据权利要求2所述的用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述反应体系用于核酸扩增体系或核酸CRISPR体系中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增体系的探针5'端标记生物素，3'端标记地高辛或5'端标记地高辛，3'端标记生物素。
5.根据权利要求2所述的用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为带有磷酸盐、吐温-20、Tris-HCl的缓冲溶液。
6.根据权利要求3所述的用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述的核酸扩增反应体系包括PCR扩增体系或等温扩增体系中的任意一种。
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