CN117007789A - 基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法 - Google Patents

基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法及应用，包括步骤：一，对核酸样品进行等温多重扩增；二，在扩增产物加入Argonaute、向导ssDNA和探针进行剪切；三，将剪切产物滴加于免疫层析侧流片，所述试纸设有若干条检测线和质控线，观察检测线和质控线的颜色，确定检测结果。本发明采用Argonaute级联剪切与免疫层析相结合的方法，通过特别的探针修饰和层析侧流片设计，实现了一条免疫层析侧流片的多重核酸检测，并应用于SARS‑CoV‑2、甲型流感、非洲猪瘟和Actin‑β基因检测中，相比于已有技术灵敏度更高、特异性更强，且操作简便，无仪器局限性，有重要的应用价值。

Description

基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体地涉及基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法。
背景技术
核酸检测属于分子诊断，应用分子生物学方法检测受检个体或其携带的病毒、病原体的遗传物质的结构或表达调控的变化水平，为疾病的防治、预测、诊断、治疗和预后判断提供信息和决策依据的技术。由于分子诊断技术可针对产生疾病的相关基因进行准确诊断，特异性强，灵敏度高，可应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性疾病、肿瘤分子诊断等领域，还能在部分应用领域替代其他体外诊断技术，成为体外诊断技术中重要的发展和研究方向。
免疫层析检测技术是一种快速、便捷的病原体检测方法，主要应用于抗原和抗体的检测，但是由于没有靶标扩增，检测灵敏度较低，容易出现漏检情况。
基于RPA和LAMP等温扩增的免疫层析检测技术是一种高灵敏、可视化的核酸检测技术，但是其容易出现非特异性扩增，并且扩增产物不被降解易污染，容易导致假阳性的发生。
最近，CRISPR免疫层析检测方法可以实现对核酸产物的高灵敏可视化检测，但是CRISPR目前难以实现单条多重核酸检测试纸条，且存在假阳性，主要原因为：1.多酶多重试剂体系复杂，且多酶之间容易出现交叉反应；2.探针被随机切割为碎片，探针碎片化分离导致无法实现探针的多抗原表位修饰，难以设计多重检测和避免挂钩效应。3.gRNA长度较长，合成成本高，并且不易保存。
综上所述，本发明迫切需要开发一种快速、特异性好、灵敏度高、可靠性好、兼容性强、可肉眼观察判定结果的多重核酸扩增产物的免疫层析检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、特异性好、灵敏度高、可靠性好、兼容性强、可肉眼观察判定结果的多重核酸扩增产物的免疫层析检测方法及检测试剂盒。
本发明第一方面提供一种免疫层析核酸检测方法，包括步骤：
(1)提供待测核酸样本作为模板，进行扩增，从而获得核酸扩增产物；
(2)将所述核酸扩增产物与Argonaute酶、针对不同靶标的向导ssDNA(gDNA)和探针进行混合，使Argonaute酶对所述核酸扩增产物和所述探针进行级联剪切，从而获得剪切产物；
所述探针包括一种或多种核酸探针，其中，所述核酸探针的一个末端标记有被第一抗体特异性识别并结合的第一标记分子，所述第一标记分子作为阴性质控标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第二抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子；所述探针还标记有层析显色标记分子(或第三标记分子)；和
(3)将所述剪切产物加样于免疫层析侧流片，进行免疫层析检测，从而获得免疫层析检测结果。
在另一优选例中，当所述探针包括针对n个靶序列区域的n种特异性核酸探针时，其中n为≥2的正整数时，则所述n种特异性核酸探针各自标记有相同的第一标记分子和不同的第二标记分子。
在另一优选例中，所述的n为2-50，较佳地2-30，更佳地2-5，如2、3、4或5。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针中的2种或多种核酸探针是针对同一类病原体(如甲流病毒、乙流病毒)、不同类病原体(如新冠病毒、甲流病毒)或同一种病原体不同亚型(如不同亚型的新冠病毒)，并且标记有相同的第一标记分子。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针中的2种或多种核酸探针是针对同一类病原体(如甲流病毒、乙流病毒)、不同类病原体(如新冠病毒、甲流病毒)或同一种病原体不同亚型(如不同亚型的新冠病毒)，并且标记有不同的第二标记分子。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针的第三标记分子标记于靠近第二标记分子一端的T碱基上，较佳地，距离第二标记分子标记末端2-5nt以内。
在另一优选例中，第一标记分子选自下组：FAM、FITC、DIG、TAMRA、ROX、VIC、HEX、CY5、CY3、或其组合。
在另一优选例中，第二标记分子选自下组：FAM、FITC、DIG、TAMRA、ROX、VIC、HEX、CY5、CY3、或其组合。
在另一优选例中，层析显色标记分子(或第三标记分子)选自下组：生物素、FAM、FITC、或其组合。
在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片设有加样区(或样品垫)、任选的反应区(结合垫)、阴性质控区(即C区或第一质控区)、检测区(即T区)、任选的层析质控区(或第二质控区)和吸水端。
在另一优选例中，所述的阴性质控区(即C区)设有阴性质控线(C线)。
在另一优选例中，所述的阴性质控线固定有抗第一标记分子(或阴性质控标记分子)第一抗体(或阴性质控抗体)。
在另一优选例中，所述的检测区(即T区)设有一个T线。
在另一优选例中，所述的T线固定有针对第二标记分子的第二抗体(即检测抗体)。
在另一优选例中，所述的检测区(即T区)设有≥2个的检测线(T线)。
在另一优选例中，所述的检测线各自独立地固定有针对第二标记分子的第二抗体(即检测抗体)。
在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片从近端至远端依次设有加样区(或样品垫)、任选的反应区(结合垫)、阴性质控区(即C区或第一质控区)、检测区(即T区)、任选的层析质控区(或第二质控区)和吸水端。在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片设有反应区(结合垫)，所述反应区(结合垫)位于加样区的直接下游(相邻)。
在另一优选例中，所述的加样区同时作为反应区(结合垫)。
在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片含有层析显色抗体，所述的层析显色抗体特异性结合于所述的层析显色标记分子，并且带有显色标记物(显色团、显示分子、显色原子或其组合)。
在另一优选例中，所述的显色标记物选自下组：金(如胶体金)、碳(如石墨)、或其组合。
在另一优选例中，所述层析显色抗体位于加样区(或样品垫)、反应区(结合垫)或其组合。
在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片设有层析质控区(第二质控区)，所述的层析质控区设有第二质控线(C2线或层析质控线)。
在另一优选例中，所述第二质控线(或层析质控线)包被抗层析显色抗体(如金标抗体)的层析质控抗体。
在另一优选例中，所述的层析显色抗体为鼠抗体，层析质控抗体为羊抗鼠抗体。
在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片中，
第一质控线(或阴性质控线)包被抗第一标记分子的抗体(如抗FAM单克隆抗体)，
第二质控线(或层析质控线)包被抗金标抗体的抗体(如当金标抗体为鼠抗体时，抗金标抗体的抗体可以是羊抗鼠抗体)，
所述检测线(T线)包括一条或多条包被有抗不同第二标记分子的抗体。
在另一优选例中，当所述检测线(T线)包括2条包被有抗第二标记分子的抗体，即包括2条检测线时，检测线1包被TAMRA单克隆抗体，检测线2包被DIG单克隆抗体。
在另一优选例中，所述检测线(T线)包括2条或更多条检测线，所述各条检测线分别包被有针对不同第二标记分子的抗体。
在另一优选例中，所述的针对不同第二标记分子的抗体包括抗TAMRA单克隆抗体、抗FITC单克隆抗体、抗DIG单克隆抗体、抗TAMRA单克隆抗体、抗ROX单克隆抗体、抗VIC单克隆抗体、抗HEX单克隆抗体、抗CY5单克隆抗体、抗CY3单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的层析显色标记分子包括胶体金颗粒。
在另一优选例中，所述的金标抗体是经胶体金标记的抗生物素抗体或链霉亲和素。
在另一优选例中，所述PCR扩增为多重扩增。
在另一优选例中，所述PCR扩增为等温多重扩增。
在另一优选例中，所述多重等温扩增选自：LAMP、RPA、RAA、MIRA、NEAR、EXPAR、TMA、NASBA。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述级联剪切体系包括：缓冲液、Mn离子或Mg离子、gDNA、探针、基因编辑酶Ago蛋白和无核酸水；所述向导ssDNA序列位于扩增目标核酸靶序列区域；所述探针的两个末端碱基分别标记能与特定抗体结合的小分子化合物(第一标记分子)，不同靶标探针一端标记不同的小分子化合物，另一端则标记相同的小分子化合物(第二标记分子)，不同探针靠近第二标记分子一端选择一个T碱基标记生物素(Biotin)。
所述gDNA序列与靶标扩增产物序列一致，长度为10-30nt，较佳地15-20nt；
所述探针序列与靶标扩增产物序列一致，且覆盖gDNA引导的剪切产物序列区域，长度为20-60nt，较佳地30-40nt。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述免疫层析侧流片包括底板，及依次搭接粘合于底板上的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水垫；所述样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水垫各层膜相邻处部分重叠；所述NC膜上包被有相互平行的若干条检测线、质控线1和质控线2，所述质控线1靠近胶体金结合垫一侧，所述质控线2靠近吸水垫一侧，检测线位于质控线1和质控线2之间。
在另一优选例中，所述底板为聚氯乙烯(PVC)板；样品垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜；所述NC膜为硝酸纤维素膜；所述吸水垫为滤纸。
在另一优选例中，所述胶体金结合垫包括膜本体，以及均匀包被于膜本体表面的鼠抗生物素抗体标记的胶体金颗粒涂层；所述膜本体为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜。
在另一优选例中，所述NC膜为硝酸纤维素膜。
在另一优选例中，所述检测线上包被有与探针一端不同标记小分子化合物(第二标记分子)相对应的特异性抗体；所述质控线1包被有与探针另一端相同标记小分子化合物(第一标记分子)相对应的特异性抗体，质控线2包被有羊抗鼠抗体。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述检测结果包括：当质控线和检测线同时显色或质控线与任意一条检测线显色，判定待检测样本中含有相应的待检测物；当只有质控线显色，判定待检测样本中不含有待检测物。
本发明第二方面提供一种免疫层析核酸检测方法，包括步骤：
(1)提供待测核酸样本作为模板，进行多重扩增，从而获得核酸扩增产物；
(2)将所述核酸扩增产物与Argonaute酶、针对不同靶标的向导ssDNA(gDNA)和探针进行混合，使Argonaute酶对所述核酸扩增产物和所述探针进行级联剪切，从而获得剪切产物；
所述探针包括一种或多种核酸探针，其中，所述核酸探针的一个末端标记有第一标记分子，所述第一标记分子，作为阴性质控标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第一抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子，其中，当所述探针包括多种靶标序列的核酸探针时，不同序列的核酸探针的所述另一个末端分别标记有不同的第二标记分子；
(3)将所述剪切产物加样于免疫层析侧流片，进行免疫层析检测，从而获得免疫层析检测结果。
在另一优选例中，当所述探针包括针对n个靶序列区域的n种特异性核酸探针时，其中n为≥2的正整数时，则所述n种特异性核酸探针各自标记有不同的第二标记分子。
在另一优选例中，所述的n为2-30，较佳地2-10，更佳地2-5，如2、3、4、或5。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针各自标记有不同的第二标记分子。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针中的2种或多种核酸探针是针对同一类病原体(如甲流病毒、乙流病毒)、不同类病原体(如新冠病毒、甲流病毒)或同一种病原体不同亚型(如不同亚型的新冠病毒)，并且标记有不同的第二标记分子。
在另一优选例中，所述第一标记分子(阴性质控标记分子)选自下组：生物素、FAM、FITC、TAMRA。
在另一优选例中，所述的探针包括多种核酸探针，并且不同种类的核酸探针的所述另一个末端分别标记有不同的第二标记分子。
在另一优选例中，第二标记分子选自下组：FAM、FITC、DIG、TAMRA、ROX、VIC、HEX、CY5、CY3。
在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片设有加样区(或样品垫)、任选的反应区(结合垫)、阴性质控区、检测区和吸水端。
在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片中，结合垫包被抗第二标记分子抗体标记的显色微粒，所述显色微粒包括：胶体金颗粒、金属纳米微球、乳胶纳米微球。
在另一优选例中，所述的探针包括多种核酸探针时，所述的结合垫包被有抗不同第二标记分子抗体的标记的显色微粒。
在另一优选例中，所述显色微粒有二种或以上的显色微粒，所述显色微粒被不同的动物源抗体(第一抗体)所标记。
在另一优选例中，所述的显色微粒包括(Z1)包被有抗某种第二标记分子(如生物素)抗体的标记的第一显色微粒；和(Z2)包被有抗另一种第二标记分子(如DIG)抗体标记的第二显色微粒；
其中，所述第一显色微粒和第二显色微粒被不同的抗第二标记抗体所标记。
在另一优选例中，所述的抗第二标记分子的抗体为来源于不同的动物的单克隆抗体。
在另一优选例中，位于阴性质控区中的质控线(或阴性质控线，C线)包被链霉亲和素或抗生物素抗体(当第一标记分子为生物素情况下)。
在另一优选例中，所述检测线(T线)包被第二抗体，即一条或多条包被有抗不同第二标记分子抗体的抗体。
在另一优选例中，所述第二抗体为动物源性抗体，包括鼠抗、兔抗、羊抗、猪抗、羊驼抗体等。
在另一优选例中，所述的第二抗体包括羊驼抗鼠抗体、羊驼抗兔抗体。
在另一优选例中，所述检测线(T线)包括2条包被有抗第二标记分子抗体的抗体，即包括2条检测线：当金标抗体为兔抗时，抗金标抗体的抗体可以是羊驼抗兔抗体，即检测线2包被羊驼抗兔抗体；当纳米微球标记的抗体为鼠抗时，抗纳米微球抗体的抗体可以是羊驼抗鼠抗体，即检测线2包被羊驼抗鼠抗体。
在另一优选例中，所述检测线(T线)包括2条或更多条检测线，所述各条检测线分别包被有针对不同第二标记分子抗体的抗体。
在另一优选例中，所述的第一标记分子包括生物素。
在另一优选例中，所述的金标抗体是经胶体金标记的兔抗，所述的纳米微球标记的抗体是经纳米微球标记的鼠抗。
在另一优选例中，所述扩增为PCR多重扩增。
在另一优选例中，所述扩增为等温多重扩增。
在另一优选例中，所述多重等温扩增选自：LAMP、RPA、RAA、MIRA、NEAR、EXPAR、TMA、NASBA。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述级联剪切体系包括：缓冲液、Mn离子或Mg离子、gDNA、探针、基因编辑酶Ago蛋白和无核酸水；所述向导ssDNA序列位于扩增目标核酸靶序列区域；所述探针的两个末端碱基分别标记能与特定抗体结合的小分子化合物，不同靶标探针一端标记不同的小分子化合物，另一端则选择末端碱基标记生物素(Biotin)；
其中，所述gDNA序列与靶标扩增产物序列一致，长度为10-30nt，较佳地15-20nt；
所述探针序列与靶标扩增产物序列一致，且覆盖gDNA引导的剪切产物序列区域，长度为20-60nt，较佳地30-40nt。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述免疫层析侧流片包括底板，及依次搭接粘合于底板上的样品垫、胶体金和纳米微球结合垫、NC膜和吸水垫；所述样品垫、胶体金和纳米微球结合垫、NC膜和吸水垫各层膜相邻处部分重叠；所述NC膜上包被有相互平行的若干条检测线和质控线，所述质控线在胶体金和纳米微球结合垫与检测线之间。
在另一优选例中，所述底板为聚氯乙烯(PVC)板；样品垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜；所述NC膜为硝酸纤维素膜；所述吸水垫为滤纸。
在另一优选例中，所述胶体金和纳米微球结合垫包括膜本体，以及均匀包被于膜本体表面的鼠抗生素抗体标记的胶体金颗粒涂层和兔抗生素抗体标记的乳胶纳米微球颗粒涂层；所述膜本体为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜。
在另一优选例中，所述检测线1上包被有与纳米微球标记的鼠抗对应的特异性抗体，检测线2上包被有与胶体金标记的兔抗对应的特异性抗体；所述质控线包被有能与生物素结合的链霉亲和素。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述检测结果包括：当质控线和检测线同时显色、质控线与任意一条检测线显色或检测线同时显色，判定待测样本中含有相应的待检测物；当只有质控线显色，判定待检测样本中不含有待检测物。
本发明第三方面提供一种用于本发明第一方面所述免疫层析核酸检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)Argonaute酶；
(b)探针；所述探针包括一种或多种核酸探针，其中，所述核酸探针的一个末端标记有被第一抗体特异性识别并结合的第一标记分子，所述第一标记分子作为阴性质控标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第二抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子；所述探针还标记有层析显色标记分子(或第三标记分子)；和
(c)免疫层析侧流片；所述的免疫层析侧流片设有加样区(或样品垫)、任选的反应区、阴性质控区(即C区或第一质控区)、检测区(即T区)、任选的层析质控区(或第二质控区)和吸水端。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的试剂：引物、向导ssDNA(gDNA)、或其组合。
在另一优选例中，所述探针包括一种或多种核酸探针，其中，所述核酸探针的一个末端标记有被第一抗体特异性识别并结合的第一标记分子，所述第一标记分子作为阴性质控标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第二抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子；所述探针还标记有第三标记分子，所述第三标记分子为层析显色标记分子。
在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片设有加样区(或样品垫)、任选的反应区、任选的阴性质控区、检测区、层析质控区和吸水端。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，所述说明书中记载了用本发明第一方面中所述的免疫层析核酸检测方法进行检测。
在另一优选例中，当所述探针包括针对n个靶序列区域的n种特异性核酸探针时，其中n为≥2的正整数时，则所述n种特异性核酸探针各自标记有相同的第一标记分子和或不同的第二标记分子。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针中的2种或多种核酸探针是针对同一类病原体(如甲流病毒、乙流病毒)、不同类病原体(如新冠病毒、甲流病毒)或同一种病原体不同亚型(如不同亚型的新冠病毒)，并且标记有相同的第一标记分子。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针中的2种或多种核酸探针是针对同一类病原体(如甲流病毒、乙流病毒)、不同类病原体(如新冠病毒、甲流病毒)或同一种病原体不同亚型(如不同亚型的新冠病毒)，并且标记有不同的第二标记分子。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针的第三标记分子标记于靠近第二标记分子一端的T碱基上，较佳地，距离第二标记分子标记末端2-5nt以内。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针中的2种或多种核酸探针是针对同一类病原体(如甲流病毒、乙流病毒)或同一种病原体(如新冠病毒)，并且标记有相同的第二标记分子。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针中的2种或多种核酸探针是针对同一类病原体(如甲流病毒、乙流病毒)或同一种病原体不同亚型(如不同亚型的新冠病毒)，并且标记有不同的第二标记分子。
在另一优选例中，所述n种特异性核酸探针包括针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的第一特异性核酸探针、和针对流感病毒(如甲流病毒、乙流病毒、)的第二特异性核酸探针。
在另一优选例中，所述的流感病毒选自下组：甲流病毒、乙流病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的病原体选自下组：感染人的病原体、感染家畜的病原体、感染宠物的病原体、或其组合。
在另一优选例中，所述的病原体选自下组：冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、肠道病毒、HIV、HPV、或其组合。
在另一优选例中，所述的病原体包括非洲猪瘟病毒(ASFV)。
本发明第四方面提供一种用于本发明第二方面所述免疫层析核酸检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)Argonaute酶；
(b)探针；所述探针包括一种或多种核酸探针，其中，所述核酸探针的一个末端标记有第一标记分子，所述第一标记分子，作为阴性质控标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第一抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子，其中，当所述探针包括多种核酸探针时，不同种类的核酸探针的所述另一个末端分别标记有不同的第二标记分子；和
(c)免疫层析侧流片；所述的免疫层析侧流片设有加样区(或样品垫)、任选的反应区(结合垫)、任选的阴性质控区、检测区和吸水端。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的试剂：引物、向导ssDNA(gDNA)、或其组合。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的试剂：缓冲液混合液、DNA聚合酶、引物混合液、缓冲液混合液、或其组合。
本发明第五方面提供本发明第三方面所述试剂盒的用途，用于制备检测病原体核酸的试剂盒。
在另一优选例中，所述的病原体选自下组：感染人的病原体、感染家畜的病原体、感染宠物的病原体、或其组合。
在另一优选例中，所述的病原体选自下组：感染人的病原体、感染家畜的病原体、感染宠物的病原体、或其组合。
在另一优选例中，所述的病原体选自下组：冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、肠道病毒、HIV、HPV、或其组合。
在另一优选例中，所述的病原体包括非洲猪瘟病毒(ASFV)。
本发明第六方面提供本发明第四方面所述试剂盒的用途，用于制备检测病原体核酸的试剂盒。
在另一优选例中，所述的病原体选自下组：感染人的病原体、感染家畜的病原体、感染宠物的病原体、或其组合。
在另一优选例中，所述的病原体选自下组：感染人的病原体、感染家畜的病原体、感染宠物的病原体、或其组合。
在另一优选例中，所述的病原体选自下组：冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、肠道病毒、HIV、HPV、或其组合。
在另一优选例中，所述的病原体包括非洲猪瘟病毒(ASFV)。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
图1显示了本发明所述的Ago级联剪切靶标扩增产物的机制原理。
图2显示了本发明所述的一种基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法的机制原理及对应SARS-CoV-2、甲流双重检测试纸条检测结果判定。
图3显示了非洲猪瘟、猪Actin-β内参基因双重检测试纸条检测结果。
图4显示了在本发明另一优选例中，基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法的机制原理及对应SARS-CoV-2和甲流双重次级剪切试纸条检测结果判定。
图5显示了基于Argonaute的SARS-CoV-2和甲型流感病毒双重探针剪切的免疫层析核酸检测结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地开发出一种基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法。具体地，经过大量实验和筛选，本发明人将Argonaute级联剪切与免疫层析相结合，并通过特定结构的经修饰的探针和特定结构的免疫层析侧流片，从而可在一个免疫层析侧流片(或试纸)上实现针对单个或多个靶核酸(或靶目标)的高灵敏度和高特异性的多重核酸检测。相比于传统的方法，本发明的免疫层析检测试纸条灵敏度更高、特异性更强，且操作简便，无仪器局限性，在基层检测和家庭自检中有重要的应用价值。在此基础上，完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
如本文所用，术语“含有”或“包括”可以是开放式的或封闭式的，即包括了“由……构成”和“含有......”。
应当理解，对于本文所述的包括一个以上步骤的任何方法，步骤的顺序不一定限于这些实施例中描述的顺序。
如本文所用，在本发明中，“探针”、“probe”、“报告分子”、和“reporter”可互换使用。
Argonaute酶
如本文所用，“Argonaute”、“Ago”、“Argonaute酶”、“Argonaute蛋白”、“Argonaute蛋白酶”、“Ago酶”、“Ago蛋白”、和“Ago蛋白酶”可互换使用。
Argonaute蛋白属于PIWI(P element-induced wimpy testis)蛋白超家族，其由PIWI结构域的存在而界定，广泛存在于生活的所有领域，能够结合siDNA或siRNA指导链来特异性沉默或剪切互补核酸靶标链。研究表明，Ago在生物体细胞免疫防御及代谢调控中发挥重要作用，并可能具有人工基因编辑的应用潜力，因此针对Ago蛋白的功能研究成为生物学研究中新关注点。
Ago蛋白最初是在真核生物中发现的，是RNA干扰(RNAi)途径的关键参与者。真核Argonaute蛋白(eAgos)作为多蛋白RNA诱导沉默复合物(RISC)的核心，能够结合siRNA分子作为指导链，剪切互补的靶标RNA，直接沉默靶标RNA的翻译；或通过与靶标RNA结合，募集其他沉默因子来促进其降解，进而间接沉默靶标RNA。因此，eAgos可以在转录后调节基因表达，保护其宿主不受入侵RNA病毒的侵害，并通过降低转座子的流动性保持基因组的完整性。
Argonaute蛋白还存在于原核生物中。对一些原核Ago(pAgos)蛋白(主要来自嗜热细菌和古菌)的结构和生化研究表明，它们在体外可以发挥核酸内切酶作用，在体内可以发挥宿主防御作用。pAgos可以结合siDNA指导链来特异性剪切和指导链互补配对的DNA靶标链。截至2018年，已报道的pAgos主要来源于高温宿主，多用于基因检测。常温条件下活性很低，无法作为基因编辑的工具。2019年至今，陆续报道了一些来源于常温宿主的pAgos，能在常温条件下发挥DNA指导的DNA剪切活性，并且能够剪切GC含量较低的质粒。
在本发明中，提供了基于基因编辑酶Ago对小分子化合物修饰探针的特异性剪切方法。为了便于理解，提供以下原理供参考。如图1所示，基于Ago的剪切活性，可根据靶标核酸分子设计出多个向导ssDNA，向导ssDNA靶向于靶标核酸分子并介导Ago对靶标核酸扩增产物进行剪切以形成新的ssDNA。新的ssDNA可以作为次级向导ssDNA，引导Ago对与级向导ssDNAs互补的小分子化合物修饰的探针进行剪切。
核酸检测与结合扩增技术
核酸检测通常结合扩增技术，将微量的特异性核酸序列放大到能够被仪器检测到的水平。传统的核酸检测有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，PCR)，前者扩增DNA，后者则扩增RNA，是目前临床应用最广泛的分子诊断技术。PCR技术核酸扩增分三个基本反应步骤，分别是变性、退火(复性)和延伸，每完成一次这三个步骤为一个循环，一般需要进行几十个循环，耗时2至3个小时，且需要精准的温度和时间控制。等温核酸扩增技术是一种在等温条件下，15-60分钟之内就可以达到目的基因扩增放大几百万倍的等温扩增技术(如LAMP、RPA技术)，相比较于PCR核酸扩增技术更快速，切无需大型仪器，通过显色、浊度等肉眼观察即可判定结果。不过由于引物和靶标是处于相对松散的结合，等温扩增容易出险非特异性扩增，因此容易出现假阳性，同时通过目前的显色、浊度等肉眼观察，难以实现多重靶标的区分检测。
免疫层析技术
免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。固定在膜上的受体与之结合发生特异性反应。抗原抗体复合物不断累积，显色颗粒标记沉淀显色，从而达到检测目的。标记物的多少与样品中抗原的量成正比，通过检测标记物的量从而实现待检物质的定量检测。
抗原(抗体)标记技术与免疫层析技术相结合，检测结果可在很短时间(如约5min内)得到，实现快速检测的目的。
基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法
本发明提供了基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法，如本发明第一方面(第一种设计原理)中所述。
典型地，本发明的基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法，主要包括以下步骤：步骤一，取适量待测核酸样品进行等温多重扩增，得到多重扩增产物；步骤二，在扩增产物里加入Argonaute蛋白、向导ssDNA和本发明的探针进行剪切反应；步骤三，将剪切产物滴加在免疫层析侧流片上，所述免疫层析侧流片设有若干条检测线和质控线，观察检测线和质控线的颜色，确定检测结果。
本发明中，采用Argonaute级联剪切与免疫层析相结合的方法，通过特殊结构的探针修饰和层析侧流片，实现了用单个免疫层析侧流片进行多重核酸检测。
本发明可应用于检测各种不同的靶目标，代表性的靶目标包括但并不限于：新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒、非洲猪瘟病毒和Actin-β基因。
本发明将核酸扩增技术、Ago剪切系统和免疫层析技术结合，建立一种快速、特异地检测多重核酸扩增产物的荧光免疫层析方法。
优选地，本发明的多重免疫层析核酸检测方法，包括以下步骤：
步骤一，取适量待测样品进行核酸多重等温扩增；
步骤二，结合Ago基因编辑特性，在扩增产物里加入Ago级联剪切体系进行反应；
步骤三，将反应产物滴加在多重核酸检测免疫层析侧流片的加样孔上，静置7-10分钟肉眼观察并拍照记录结果。
优选地，所述步骤一中，所述多重扩增采用LAMP、RPA扩增方法。
优选地，所述检测线设置为两条至三条。
优选地，步骤二所述级联剪切体系包括：缓冲液、Mn离子或Mg离子、向导ssDNA(gDNA)、探针、基因编辑酶Ago蛋白和无核酸水；所述向导ssDNA序列位于扩增目标核酸靶序列区域；所述向导ssDNA序列可以为1条，也可以为距离15-60nt的若干若干条ssDNA；所述探针与gDNA引导的剪切产物反向互补。
优选地，步骤二所述向导ssDNA序列具有2条，与扩增靶标序列区域互补，且距离一定的距离，如距离16±2nt。
优选地，步骤二所述Ago为PfAgo、FpAgo、MfAgo、TtAgo、TpAgo、MpAgo。
进一步地，本发明提供了Argonaute的多重免疫层析核酸检测的探针设计和对应的层析侧流片，如本发明第一方面(第一种设计)中所述。
如本文所用，术语“本发明的侧流片”、“本发明的层析侧流片”或“本发明的用于免疫层析核酸检测的层析侧流片”可互换使用，指
本发明的利用侧流原理的层析侧流片(板)或层析侧流片条。
为了便于理解本发明，给出本发明层析侧流片的检测原理，如图2所示。应理解，本发明的保护范围并不受该原理的影响或限制。
本发明第一方面中所述的探针的两个末端碱基分别标记能与特定抗体结合的小分子化合物，不同靶标探针一端标记不同的小分子化合物，另一端则标记相同的小分子化合物，不同探针靠近相同小分子化合物一端，选择一个T碱基标记生物素。
优选地，所述小分子化合物标记为FITC、FAM、TAMRA、DIG、CY5。
更优选地，所述不同小分子化合物标记为DIG和TAMRA，所述相同小分子化合物为FAM。
步骤三所述的多重核酸检测免疫层析侧流片包括底板，及依次搭接粘合于底板上的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水垫；所述样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水垫各层膜相邻处部分重叠；所述NC膜上包被有相互平行的若干条检测线、质控线1和质控线2，所述质控线1靠近胶体金结合垫一侧，所述质控线2靠近吸水垫一侧，检测线质控线1和质控线2之间。
所述胶体金结合垫包括膜本体，以及均匀包被于膜本体表面的鼠抗生物素抗体标记的胶体金颗粒涂层；所述膜本体为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜。
所述质控线1包被前述“步骤二所述级联剪切体系”中所述的相同的针对小分子化合物的抗体，质控线2包被抗鼠抗体，所述若干检测线包被前述“步骤二所述级联剪切体系”中相同的针对不同小分子化合物抗体；
所述层析试纸检测技术原理：
所述探针一端的生物素首先与结合垫的抗生物素抗体标记的胶体金结合；
当所述探针未被剪切时，完整探针相同小分子化合物FAM标记一端被质控线(阴性控制线)的抗FAM抗体拦截聚集显色；
当所述探针被剪切时，被切断的另一端不同小分子化合物TAMRA和DIG(两个不同探针)被检测线1的TAMRA单克隆抗体或检测线2的DIG单克隆抗体拦截，探针的生物素标记靠近TAMRA或DIG标记，因此胶体金在检测线1或检测线2聚集显色。
在另一优选例中，所述检测结果包括：当质控线和检测线同时显色或质控线与任意一条检测线显色，判定待检测样本中含有相应的待检测物；当只有质控线显色，判定待检测样本中不含有待检测物。
优选地，所述多重核酸检测免疫层析侧流片包被抗体浓度分别为：
质控线1FAM/FITC抗体：0.3-0.8mg/mL
检测线1TAMRA单克隆抗体：0.5-0.8mg/mL
检测线2DIG抗体单克隆抗体：0.2-0.5mg/mL
检测线3CY5单克隆抗体：0.3-0.6mg/mL
质控线2羊抗鼠抗体0.5mg/mL
抗体以1μL/cm流量喷于NC膜上。
优选地，级联剪切探针浓度为5-10nM，剪切产物上样量为50-80μL。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
需要说明的是，本发明的检测方法不以诊断和/或治疗为目的。
本发明提供了Argonaute的多重免疫层析核酸检测的探针设计和对应的层析侧流片，如本发明第二方面(第二种设计)中所述。
如本文所用，术语“本发明的侧流片”、“本发明的层析侧流片”或“本发明的用于免疫层析核酸检测的层析侧流片”可互换使用，指
本发明的利用侧流原理的层析侧流片(板)或层析侧流片条。
为了便于理解本发明，给出本发明层析侧流片的检测原理。应理解，本发明的保护范围并不受该原理的影响或限制。
本发明第二方面(第二种设计)中所述的探针的一个末端标记有生物素，作为第一标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第二抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子，其中，当所述探针包括多种靶标序列的核酸探针时，不同序列的核酸探针的所述另一个末端分别标记有不同的第二标记分子；
优选地，所述第二标记分子为FITC、FAM、TAMRA、DIG、CY5。
更优选地，所述第二标记分子为FAM和DIG。
优选地，所述的层析侧流片(或试纸条)的结构包括：1样品垫，2结合垫，3检测线，4反应膜，5对照线，6吸收垫，和7背衬。
在另一优选例中，所述的免疫层析侧流片中，
结合垫包被抗第二标记分子抗体标记的显色微粒，所述显色微粒包括：胶体金颗粒、金属纳米微球、乳胶纳米微球。
在另一优选例中，所述的探针包括多种核酸探针时，所述的结合垫包被有抗不同第二标记分子抗体标记的显色微粒。
在另一优选例中，所述显色微粒有二种或以上的显色微粒，所述显色微粒被不同的动物源性抗体所标记。
在另一优选例中，所述的显色微粒包括(Z1)包被有抗某种第二标记分子(如FAM)抗体的标记的第一显色微粒；和(Z2)包被有抗另一种第二标记分子(如DIG)抗体的标记的第二显色微粒；
优选地，动物源性抗体所标记选择鼠抗FAM抗体和兔抗DIG抗体，分别标记第一显色微粒和第二显色微粒；
质控线(或阴性质控线)包被抗生物素单克隆抗体或链霉亲和素。
所述检测线(T线)包括一条或多条包被有抗第二标记分子抗体的二抗。
在另一优选例中，当所述检测线(T线)包括2条包被有抗第二标记分子的抗体、即包括2条检测线时，检测线1包被羊驼抗鼠二抗，检测线2包被羊驼抗兔二抗。在另一优选例中，所述检测线(T线)包括2条或更多条检测线，所述各条检测线分别包被有抗不同第二标记分子抗体的抗体。
所述层析试纸检测技术原理：
所述探针一端的FAM或DIG首先与结合垫的鼠抗FAM抗体或兔抗DIG抗体标记的第一显色微粒和第二显色微粒结合；
当所述探针未被剪切时，完整探针另一端生物素被质控线(阴性控制线)的抗生物素抗体或链霉亲和素拦截聚集显色；
当所述探针被剪切时，被切断的另一端结合的鼠抗FAM抗体或兔抗DIG抗体分别被检测线1的抗鼠二抗体或检测线2的抗兔二抗拦截聚集，显示对应第一显色微粒或第二显色微粒的颜色。
在另一优选例中，所述检测结果包括：当质控线和检测线同时显色或质控线与任意一条检测线显色，判定待检测样本中含有相应的待检测物；当只有质控线显色，判定待检测样本中不含有待检测物。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
需要说明的是，本发明的检测方法不以诊断和/或治疗为目的。
检测试剂盒
本发明还提供了可用于多重检测的检测试剂盒。
在本发明中，检测试剂盒中可含有本发明的核酸适体、偶联物、复合物(作为对照品或标准品)、检测试剂、和/或检测芯片。
所述的试剂盒可用于检测单个或多个靶核酸(或靶目标)，从而用于检测目标病毒。
此外，所述的试剂盒中还可包括任选的用于检测的其他试剂，例如用于显色等所需的各种试剂，包括但不限于：酶、对照液、显色液等。
所述的试剂盒中还可包括使用说明书。优选地，所述说明书中可包括标准曲线等信息。
应用
本发明还提供基于Ago核酸酶的多重免疫层析核酸检测的应用。
本发明的方法特别适合检测微量靶标核酸分子，以及多重检测，具有广泛的应用性。
在本发明中，靶标核酸分子可以是DNA，也可以是RNA。当靶标核酸分子是RNA时，可通过逆转录转变为cDNA再进行检测。
本发明的方法可以灵敏、高效地进行多重免疫层析核酸检测，能够更好地应用于核酸检测技术当中，在核酸检测行业中的有巨大应用潜力。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明提供的一种基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法，结合等温扩增技术、Ago级联剪切系统以及免疫层析技术，实现了快速、便携、灵敏的等温多重可视化核酸检测。
(2)本发明提供的一种基于Argonaute的多重免疫层析核酸检测方法检出限达1.5copies/μL，具有较高的灵敏度，相比较于抗原试纸条检测灵敏度提高100倍左右。与PCR等传统核酸检测技术相比，不经过变温过程，无需大型检测设备，60-70min即可完成反应，尤其适于基层实验室和现场快速核酸检测。
(3)本方法实现了单核酸酶多靶标的核酸试纸条检测，降低了体系复杂性，同时使用短ssDNA，相对于CRISPR的长链RNA，成本更低，也更容易保存。
(4)LAMP、RPA等温扩增层析检测方法不能降解扩增产物，因此在扩增产物开盖加入试纸条的过程中非常容易造成扩增产物气溶胶污染，导致假阳性发生；而Argonaute可以将扩增产物剪切降解，避免了气溶胶污染造成的假阳性结果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
基于Argonaute的SARS-CoV-2、甲型流感病毒双重免疫层析核酸检测方法
LAMP扩增体系：
RADAR级联剪切体系：
/>
引物、探针设计：
多重层析侧流片：
质控线1(阴性质控)包被0.5mg/mL FAM单克隆抗体，质控线2(层析质控)包被0.5mg/mL羊抗鼠抗体，检测线1包被0.8mg/mL TAMRA单克隆抗体，检测线2包被0.5mg/mLDIG单克隆抗体。
操作步骤：
在0.2mL离心管中配制好LAMP体系后，分别加入5μL待测SARS-CoV-2、甲型流感病毒RNA样本和去离子水(阴性对照)，放置于金属浴或PCR仪器，65℃反应40分钟。随后加入RADAR级联剪切体系，混匀后放回金属浴或PCR仪器，95℃反应30分钟。反应结束后，剪切产物用上样稀释液稀释8倍后吸取60μL至层析侧流片上样孔，10分钟后观察。
检测结果：
如图2所示，所有样本质控线1和质控线2显色，SARS-CoV-2样本检测线2显色，甲型流感病毒样本检测线2显色，阴性对照检测线不显色，结果与设计原理预期相符。
表1：图2的检测结果说明
实施例2
基于Argonaute的非洲猪瘟病毒、Actin-β基因双重免疫层析核酸检测方法
在本实施例中，开发了用于检测非洲猪瘟病毒的免疫层析核酸检测试剂、试剂盒和检测方法，其中将猪Actin-β作为参照基因。
LAMP扩增体系：
RADAR级联剪切体系：
引物、探针设计：
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多重层析侧流片(或侧流片)的结构参考实施例1。
操作步骤：
样本为5μL 1500、150、15、1.5copies/μL梯度浓度的质粒样本和去离子水(阴性对照，NTC)，其他步骤参考实施例1。
判定标准：
阴性：质控线1和质控线2显色，检测线不显色。
ASFV阳性：质控线1和质控线2显色，检测线2显色。
Actin-β阳性：质控线1和质控线2显色，检测线1显色。
检测结果：
如图3所示，ASFV检测灵敏度可达1.5copies/μL，Actin-β检测灵敏度可达15copies/μL。
实施例3
基于Argonaute的SARS-CoV-2和甲型流感病毒双重探针剪切的免疫层析核酸检测
次级剪切体系：
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引物、探针设计：
多重层析侧流片：
质控线(阴性质控)包被0.5mg/mL链霉亲和素，检测线1包被0.5mg/mL羊驼抗鼠二抗，检测线2包被0.5mg/mL羊驼抗兔二抗。
操作步骤：
在0.2mL离心管中配制4种次级剪切体系，分别加入SARS-CoV-2和甲型流感病毒两种次级gDNA、SARS-CoV-2次级gDNA、甲型流感病毒次级gDNA和不加两种次级gDNA，最终缺少的体积用水补齐至20μL。体系混匀后放入金属浴或PCR仪器，95℃反应30分钟。反应结束后，剪切产物用蒸馏水稀释20倍后吸取50μL至层析侧流片上样区，5分钟后观察。
检测结果：
如图4所示，所有样本质控线显色，SARS-CoV-2和甲型流感病毒双模板样本检测线1与检测线2均显色，SARS-CoV-2样本检测线2显色，甲型流感病毒样本检测线1显色，阴性对照检测线不显色。
表2.图4的检测结果说明
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实施例4
基于Argonaute的SARS-CoV-2、甲型流感病毒双重免疫层析核酸检测方法
LAMP扩增体系：
RADAR级联剪切体系：
引物、探针设计：
多重层析侧流片设计参考实施例3。
操作步骤：
样本为10μL 15000、1500、150、15、1.5copies/μL梯度浓度的质粒样本和去离子水(阴性对照，NTC)，其他步骤参考实施例3。
判定标准：
阴性：质控线1和质控线2显色，检测线不显色。
SARS-CoV-2阳性：质控线1和质控线2显色，检测线2显色。
Influenza A阳性：质控线1和质控线2显色，检测线1显色。
检测结果：
如图5所示，SARS-CoV-2检测灵敏度可达15copies/μL，Influenza A检测灵敏度可达1.5copies/μL。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种免疫层析核酸检测方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供待测核酸样本作为模板，进行扩增，从而获得核酸扩增产物；
(2)将所述核酸扩增产物与Argonaute酶、针对不同靶标的向导ssDNA(gDNA)和探针进行混合，使Argonaute酶对所述核酸扩增产物和所述探针进行级联剪切，从而获得剪切产物；
所述探针包括一种或多种核酸探针，其中，所述核酸探针的一个末端标记有被第一抗体特异性识别并结合的第一标记分子，所述第一标记分子作为阴性质控标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第二抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子；所述探针还标记有层析显色标记分子(或第三标记分子)；和
(3)将所述剪切产物加样于免疫层析侧流片，进行免疫层析检测，从而获得免疫层析检测结果。
2.一种免疫层析核酸检测方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供待测核酸样本作为模板，进行多重扩增，从而获得核酸扩增产物；
(2)将所述核酸扩增产物与Argonaute酶、针对不同靶标的向导ssDNA(gDNA)和探针进行混合，使Argonaute酶对所述核酸扩增产物和所述探针进行级联剪切，从而获得剪切产物；
所述探针包括一种或多种核酸探针，其中，所述核酸探针的一个末端标记有第一标记分子，所述第一标记分子，作为阴性质控标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第一抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子，其中，当所述探针包括多种靶标序列的核酸探针时，不同序列的核酸探针的所述另一个末端分别标记有不同的第二标记分子；
(3)将所述剪切产物加样于免疫层析侧流片，进行免疫层析检测，从而获得免疫层析检测结果。
3.一种用于权利要求1所述免疫层析核酸检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)Argonaute酶；
(b)探针；所述探针包括一种或多种核酸探针，其中，所述核酸探针的一个末端标记有被第一抗体特异性识别并结合的第一标记分子，所述第一标记分子作为阴性质控标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第二抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子；所述探针还标记有层析显色标记分子(或第三标记分子)；和
(c)免疫层析侧流片；所述的免疫层析侧流片设有加样区(或样品垫)、任选的反应区、阴性质控区(即C区或第一质控区)、检测区(即T区)、任选的层析质控区(或第二质控区)和吸水端。
4.一种用于如权利要求2所述免疫层析核酸检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)Argonaute酶；
(b)探针；所述探针包括一种或多种核酸探针，其中，所述核酸探针的一个末端标记有第一标记分子，所述第一标记分子，作为阴性质控标记分子；所述探针的另一个末端标记有被第一抗体特异性识别并结合的第二标记分子，第二标记分子为检测标记分子，其中，当所述探针包括多种核酸探针时，不同种类的核酸探针的所述另一个末端分别标记有不同的第二标记分子；和
(c)免疫层析侧流片；所述的免疫层析侧流片设有加样区(或样品垫)、任选的反应区(结合垫)、任选的阴性质控区、检测区和吸水端。
5.如权利要求3所述试剂盒的用途，其特征在于，用于制备检测病原体核酸的试剂盒。
6.如权利要求4所述试剂盒的用途，其特征在于，用于制备检测病原体核酸的试剂盒。
7.如权利要求6所述试剂盒的用途，其特征在于，所述的病原体选自下组：感染人的病原体、感染家畜的病原体、感染宠物的病原体、或其组合。
8.如权利要求6所述试剂盒的用途，其特征在于，所述的病原体选自下组：感染人的病原体、感染家畜的病原体、感染宠物的病原体、或其组合。
9.如权利要求6所述试剂盒的用途，其特征在于，所述的病原体选自下组：冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、肠道病毒、HIV、HPV、或其组合。
10.如权利要求6所述试剂盒的用途，其特征在于，所述的病原体包括非洲猪瘟病毒(ASFV)。
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