CN111500769A - 一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测SARS‑CoV‑2核酸的荧光免疫层析方法，包括以下几个步骤：步骤一，结合重组酶介导等温核酸扩增技术，取适量待测样品进行核酸扩增；步骤二，结合CRISPR/Cas13a基因编辑工具，在扩增产物里加入LwaCas13a蛋白进行反应；步骤三，将反应产物与量子点微球标记抗FITC抗体溶液混合后加在核酸试纸条上，使用荧光分析仪读取结果或紫外激光灯进行结果观察。本发明采用RAA技术与核酸试纸条检测技术相结合的方法，相比于传统的RT‑PCR检测手段，能够利用简单的实验仪器更快速高效的对SARS‑CoV‑2进行检测。

Description

一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法。
背景技术
核酸检测属于分子诊断，应用分子生物学方法检测受检个体或其携带的病毒、病原体的遗传物质的结构或表达调控的变化水平，为疾病的防治、预测、诊断、治疗和预后判断提供信息和决策依据的技术。由于分子诊断技术可针对产生疾病的相关基因进行准确诊断，特异性强，灵敏度高，可应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性疾病、肿瘤分子诊断等领域，还能在部分应用领域替代其他体外诊断技术，成为体外诊断技术中重要的发展和研究方向。
核酸检测通常结合扩增技术，将微量的特异性核酸序列放大到能够被仪器检测到的水平。传统的核酸检测有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 和逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，PCR)，前者扩增DNA，后者则扩增RNA，是目前临床应用最广泛的分子诊断技术。PCR 技术核酸扩增分三个基本反应步骤，分别是变性、退火(复性)和延伸，每完成一次这三个步骤为一个循环，一般需要进行几十个循环，耗时2至3个小时，且需要精准的温度和时间控制。RAA核酸扩增技术是一种在等温条件(25-45℃)下， 5-30分钟之内就可以达到目的基因扩增放大几百万倍的等温扩增技术，相比较于 PCR核酸扩增技术更快速，更易操作，有更宽阔的应用场景。
CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种免疫系统，被用来识别和摧毁噬菌体和抗其他病原体入侵的防御系统。CRISPR是指规律间隔性成簇短回文重复序列，涉及细菌基因组中的独特DNA区域，也是储存病毒DNA片段从而允许细胞能够识别任何试图再次感染它的病毒的地方。Cas 蛋白是CRISPER系统中的一类核酸酶，对CRISPER系统发挥获得性免疫功能具有重要作用。其中Cas13包含四个不同的家族成员(Casa-d)，是一种RNA引导的核糖核酸酶，而Cas13a可以通过CRISPR RNA(crRNA)和Cas13a的侧裂活性来检测RNA靶标的存在，利用crRNA识别RNA靶标可以激活附近非靶向报告RNA(RNA reporter)的裂解活性，从而达到检测目的。
荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。相较于金标免疫层析技术，荧光免疫层析法灵敏度高，特异性强，并且可一次检测多种物质。本发明采用量子点微球作为荧光标记物，量子点激发光谱宽而发射波长窄，荧光效率高，生物兼容性好，量子点微球包裹有数百或者数千的量子点颗粒，因此相较于量子点，具有更高的发光强度，可有效提高检测灵敏度和稳定性。结合手持式荧光检测仪，可实现现场快速定量检测，具有良好的临床应用前景和意义。
本发明将CRISPR/Cas系统、RAA核酸扩增技术和荧光免疫层析技术结合，建立一种快速、特异地检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，该方法采用RAA结合量子点微球荧光免疫层析技术建立快速检测SARS-CoV-2的方法，特异性好，灵敏度高，可靠性好，可用于临床现场检测，并且可以实现病毒的定量、半定量检测。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，包括以下几个步骤：
步骤一，利用重组酶介导等温核酸扩增(RAA)技术，取适量待测样品进行核酸扩增；
步骤二，结合CRISPR/Cas13a基因编辑工具，在扩增产物里加入LwaCas13a蛋白进行反应；
步骤三，将反应产物与量子点微球标记抗FITC抗体溶液混合后加在荧光免疫层析试纸上，使用荧光分析仪读取结果或紫外激光灯进行结果观察。
优选的，所述步骤一中，重组酶介导等温核酸扩增的等温扩增反应体系为：6μLRAA重悬缓冲液，10μM引物F 0.5μL，10μM引物R 0.5μL，100,000U/mL 逆转录核酸酶0.2μL，0.4μL ddH2O，1μL待测样品。
优选的，所述步骤一中，RAA引物序列为引物F： 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTAC ATAGA-3’；引物R：5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’。
优选的，所述步骤一中，RAA重悬缓冲液的配制方法为将25μL RAA基础缓冲液加入RAA基础反应单元，使冻干粉充分混匀。
优选的，所述步骤二中，CRISPER反应体系为：2μL检测缓冲液，2μL LwaCas13a蛋白溶液，10ng/μL向导RNA 1μL，20μM报告探针1μL，9.6μL ddH2O， 0.6μL T7聚合酶，0.8μLRibonucleotide Solution，1μL核糖核酸酶抑制剂，120mM MgCl2 1μL，1μL扩增产物。
更优选的，所述LwaCas13a蛋白的存储缓冲液配方为2.5mL 1M pH7.4 Tris， 6mL5M NaCl，2.5mL甘油，100μL 1M DTT和38.9mL ddH2O；所述检测缓冲液为400mM，pH7.4 Tris溶液。
优选的，所述向导RNA序列为：5’- GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCU GUCCAACCUGAAGAAG-3’。
更优选的，报告探针序列为 5’-FITC-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-Biotin-3’。
优选的，所述步骤三中，量子点微球为激发光波长为300-450nm，发射波长为575nm和610nm。
本发明中检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析试纸由PVC底板、吸水纸、检测线、硝酸纤维素膜、质控线、样品垫依次首尾搭接；所述硝酸纤维素膜黏贴在底板中部，硝酸纤维素膜两端分别粘贴叠压有样品垫和吸水纸，硝酸纤维素膜靠近样品垫一端设有质控线，远离样品垫一端设有检测线，所述质控线上包被有链霉亲和素，所述检测线上包被有二抗，所述二抗为量子点微球标记抗FITC抗体的IgG抗体。
上述检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：
(1)量子点微球标记抗FITC抗体制备：利用EDC/NHS活化羧基的实验方法活化量子点微球，随后立即在活化好的微球溶液中加入抗FITC抗体进行偶联反应，偶联结束后离心重悬制备得量子点微球标记抗FITC抗体溶液；
(2)检测线和质控线的制备：将能与抗FITC抗体结合的IgG抗体，在硝酸纤维膜上进行线状点样制得；将能与生物素(Biotin)结合的链霉亲和素，在硝酸纤维膜上线状点样制得；
(3)沿同一方向依次将样品垫、硝酸纤维膜、吸水纸搭接粘连；所述硝酸纤维膜上的质控线靠近样品垫一端，检测线靠近吸水纸一端。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
需要说明的是，本发明的检测方法不以疫病的诊断和/或治疗为目的。
有益效果
(1)本发明提供的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，结合RAA 等温扩增技术、CRISPER系统以及荧光免疫层析技术，能够更快速和特异地对 SARS-CoV-2核酸进行检测。
(2)通过RAA方法能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平，本发明建立的检测方法检出限达1copies/μL，该方法具有较高的灵敏度。
(3)检测速度快，与PCR相比，不经过变温过程，60min内即可完成反应，尤其适于基层实验室和现场快速核酸检测。
附图说明
图1是本发明实施例1和2所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法中荧光免疫层析试纸的结构示意图；其中：1-荧光免疫层析试纸；2-底板； 3-样品垫；4-硝酸纤维素膜；5-质控线；6-检测线；7-吸水垫。
图2是本发明实施例1所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法的阴性样品和阳性样品检测结果。
图3是本发明实施例2所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法灵敏性检测的荧光值结果图。
图4是本发明实施例2所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法灵敏性检测的检测线与控制线荧光比值图。
具体实施方式
本发明提供一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。
在以下实施例中，健康人上呼吸道取样标本的核酸提取物由南京市第二医院检验科提供。引物组和向导RNA由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，报告探针由上海生工生物工程技术服务公司合成。RAA核酸扩增试剂盒来自江苏奇天基因生物科技有限公司，量子点微球来自上海昆道生物科技有限公司；
所用试剂或原料以及仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品，涉及到的实验方法，如无特殊说明均为本领域常规方法。
一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，包括以下步骤：
(1)将25μL RAA基础缓冲液加入RAA基础反应单元，使冻干粉充分混匀，得到RAA重悬缓冲液；
(2)按照下列表1配制等温扩增反应体系：
表1
组分 用量
RAA重悬缓冲液 6μL
引物F(10μM) 0.5μL
引物R(10μM) 0.5μL
逆转录核酸酶(100,000U/mL) 0.2μL
ddH<sub>2</sub>O 0.4μL
待测样本 1μL
将上述反应体系充分混匀；
(3)打开反应单元，向反应单元的管盖上加入2.5μL乙酸镁，充分混匀并离心收集；
(4)反应管在39℃条件下反应20-25分钟，反应完成后立即将反应管置于冰上备用；
(5)取一份LwaCas13a储备蛋白的等分试样(2mg/mL,4μL)，使用122.5μL的存储缓冲液重悬；
(6)按照下列表2配制CRISPER反应体系：
表2
组分 用量
检测缓冲液 2μL
LwaCas13a蛋白溶液 2μL
向导RNA(10ng/μL) 1μL
报告探针(20μM) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 9.6μL
T7聚合酶 0.6μL
Ribonucleotide Solution 0.8μL
核糖核酸酶抑制剂 1μL
MgCl<sub>2</sub>(120mM) 1μL
扩增产物 1μL
将上述反应体系混合均匀并离心收集，然后在37℃条件下孵育30分钟，反应完成后将反应管置于冰上备用；
(7)在上述反应产物中加入80μL量子点微球标记抗FITC抗体溶液均匀混合，将混合液滴加在核酸试纸条即荧光免疫层析试纸样品垫上，孵育10-15分钟；
(8)将试纸条插入荧光分析仪读卡槽，等待自动读卡完毕后即可在主页面看到检测结果，或用波长在300～450nm的紫外激发光对划线区域进行照射，观察显色情况(注意佩戴配套护目镜)；判定方法如下：
阴性：质控线显色，检测线几乎不显色，或检测线和质控线深浅比值小于0.5 时，则待测样品中不存在SARS-CoV-2核酸或浓度低于检测限；
阳性：质控线和检测线都显色，或检测线和质控线深浅比值大于等于0.5时，则表示待测样品中有SARS-CoV-2核酸存在；
无效：质控线不显色。
其中，步骤(1)RAA引物序列如下所示：
引物F：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTA CATAGA-3’；
引物R：5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’；
步骤(5)存储缓冲液配方为2.5mL 1M Tris(pH 7.4)，6mL 5M NaCl，2.5mL 甘油，100μL1M DTT和38.9mL ddH2O。
步骤(6)检测缓冲液为400mM，pH7.4 Tris溶液。
步骤(6)向导RNA序列如下所示：
5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACC AGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3’
步骤(6)报告探针序列如下所示：
5’-FITC-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-Biotin-3’；
步骤(7)量子点微球为激发光波长为300-450nm，发射波长为575nm和610nm。
实施例1量子点微球标记抗FITC抗体
量子点微球标记抗FITC抗体，具体步骤如下：
(1)活化：量子点微球使用前需要涡旋混匀，取10μL微球用MES缓冲液 (0.01M，pH5.5)调节微球浓度(终浓度为0.5mg/mL)，然后分别加入1μL对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液(EDC和 NHS粉末均用MES缓冲液溶解，EDC和NHS终浓度为10mM)，置于37℃反应0.5h，使微球表面的羧基活化；
(2)偶联：羧基活化后的量子点微球用PB缓冲液(0.01M，pH 6.0)洗涤两次后加入终浓度为20μg/mL的抗FITC抗体，室温下反应3h；
(3)封闭：反应完成后，向微球溶液中加入5μL 10％BSA溶液，室温下封闭15min；
(4)重悬：封闭完成后的微球溶液离心，用PBS缓冲液(0.01M pH 7.0，其中含有0.01％(w/v)的NaN3和0.5％(w/v)的BSA)重悬至初始微球溶液体积的10倍，置于4℃保存备用。
实施例2荧光免疫层析试纸的制备
检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析试纸即核酸试纸条1由PVC底板2、吸水垫7、检测线6、硝酸纤维素膜4、质控线5、样品垫3依次首尾搭接；所述硝酸纤维素膜4黏贴在底板2中部，硝酸纤维素膜4两端分别粘贴叠压有样品垫3和吸水垫7(吸水纸)，硝酸纤维素膜4靠近样品垫3一端设有质控线5，远离样品垫3一端设有检测线6，所述质控线5上包被有链霉亲和素，所述检测线6上包被有二抗，所述二抗为量子点微球标记抗FITC抗体的IgG抗体。
上述荧光免疫层析试纸的具体制备步骤如下：
(1)样品垫前处理：使用含有BSA(1％，w/v)，Tween-20(0.5％，v/v) 的PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)完全浸泡玻纤膜15分钟，干燥备用；
(2)划线：将羊抗FITC多克隆抗体用PBS缓冲液(含有3％蔗糖，w/v) 稀释至浓度为0.6mg/mL，制得检测线(T线)工作液；将链霉亲和素蛋白用PBS 缓冲液(含有3％蔗糖，w/v)稀释至浓度为0.8mg/mL，制得质控线(C线)工作液；用三维平面点膜喷金仪点膜机向硝酸纤维膜上喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜，C线和T线划线速度均为1μL/cm，检测线和质控线的间距控制在6mm左右；将硝酸纤维膜于37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用；
(3)组装：将免疫硝酸纤维素膜按照开线尺寸固定在PVC底板上，将样品垫贴于硝酸纤维素膜下方，与膜接触1-2mm；将吸水纸贴在硝酸纤维素膜的上方，与膜接触1-2mm；接通裁条机电源，设定切割宽度为4mm；将试纸条合格品平放入切割机平台轨道中，正面朝上，按操作面板上“开始”键，开始切割；每放一片试纸条合格品，按操作面板上“开始”键一次，直至切割完所有试纸条合格品；切割完成后，将试纸条装入塑料外壳，压卡机压紧，即得到SARS-CoV-2 核酸检测试纸条；试纸条结构如图1所示。
实施例3
一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法的阴性样品和阳性样品检测，包括以下步骤：
(9)本实施例采用健康人上呼吸道取样标本的核酸提取物作为阴性样本；采用体外转录方式获得SARS-CoV-2的S gene片段，经过分光光度计测定含量后，用健康人上呼吸道取样标本的核酸提取物稀释至100copies/μL作为阳性样本进行检测；
(2)将25μL RAA基础缓冲液加入RAA基础反应单元，使冻干粉充分混匀，得到RAA重悬缓冲液；
(3)配制等温扩增反应体系，平均每个反应单元包括6μL RAA重悬缓冲液，0.5 μL引物F(10μM)，0.5μL引物R(10μM)，0.2μL逆转录核酸酶(100,000U/mL)， 0.4μL ddH2O。向每个反应单元依次加入1μL的待测样本；上述各组分充分混合均匀，置于冰上备用；
其中，RAA引物序列如下所示：引物F： 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTA CATAGA-3’；
引物R：5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’；
(4)打开反应单元，向反应单元的管盖上加入2.5μL乙酸镁，充分混匀并离心收集；
(5)反应管在39℃条件下反应20-25分钟；反应完成后立即将反应管置于冰上备用；
(6)取一份LwaCas13a储备蛋白的等分试样(2mg/mL,4μL)，使用122.5μL 的存储缓冲液重悬，存储缓冲液配方为2.5mL 1M Tris(pH 7.4)，6mL 5M NaCl， 2.5mL甘油，100μL1MDTT和38.9mL ddH2O；
(7)配制CRISPER反应体系，平均每个反应单元包括2μL检测缓冲液，2μLLwaCas13a蛋白溶液，1μL向导RNA(10ng/μL)，1μL报告探针(20μM)，9.6μL ddH2O，0.6μL T7聚合酶，0.8μL Ribonucleotide Solution，1μL核糖核酸酶抑制剂，1μL MgCl2(120mM)。检测缓冲液为400mM，pH7.4 Tris溶液；向每个反应单元依次加入1μL的待测样本的扩增产物；其中，向导RNA序列为：5’- GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3’；报告探针序列为 5’-FITC-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-Biotin-3’；
(8)将上述反应单元混合均匀并离心收集，然后在37℃条件下孵育30分钟，反应完成后将反应管置于冰上备用；
(9)在上述反应单元中分别加入80μL量子点微球标记抗FITC抗体溶液均匀混合，将混合液滴加在核酸试纸条样品垫上，孵育10-15分钟；
(10)用波长在300～450nm的紫外激发光对划线区域进行照射，观察显色情况(注意佩戴配套护目镜)；结果如图2所示。
从图中可看出，阳性样品中质控线和检测线都显色，表示检测样品中有 SARS-CoV-2核酸存在；阴性样品质控线显色，检测线几乎不显色，说明检测样品中不含SARS-CoV-2核酸。
实施例4
对上述一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法进行敏感性分析，本实施例采用健康人上呼吸道取样标本的核酸提取物作为阴性样本；对采用体外转录方式获得SARS-CoV-2的S gene片段，经过分光光度计测定含量后，用健康人上呼吸道取样标本的核酸提取物分别稀释至1,000copies/μL，100copies/μL， 10copies/μL，1copies/μL，0.1copies/μL，5个敏感梯度的RNA溶液进行检测，加上阴性样本共6个检测样本，每个检测样本做三次重复；
(2)将25μL RAA基础缓冲液加入RAA基础反应单元，使冻干粉充分混匀，得到RAA重悬缓冲液，准备5个基础反应单元的量，体积共125μL(试剂盒中1个基础反应单元体系的试剂量可用于4个检测样本)；
(3)配制等温扩增反应体系，平均每个反应单元包括6μL RAA重悬缓冲液， 0.5μL引物F(10μM)，0.5μL引物R(10μM)，0.2μL逆转录核酸酶(100,000U/mL)， 0.4μL ddH2O。向每个反应单元依次加入1μL的待测样本；上述各组分充分混合均匀，置于冰上备用；其中，RAA引物序列如下所示：
引物F： 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTA CATAGA-3’；
引物R：5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’；
(4)打开反应单元，向反应单元的管盖上加入2.5μL乙酸镁，充分混匀并离心收集；
(5)反应管在39℃条件下反应20-25分钟，反应完成后立即将反应管置于冰上备用；
(6)取一份LwaCas13a储备蛋白的等分试样(2mg/mL,4μL)，使用122.5μL 的存储缓冲液重悬，存储缓冲液配方为2.5mL 1M Tris(pH 7.4)，6mL 5M NaCl， 2.5mL甘油，100μL1MDTT和38.9mL ddH2O；
(7)配制CRISPER反应体系，平均每个反应单元包括2μL检测缓冲液，2μLLwaCas13a蛋白溶液，1μL向导RNA(10ng/μL)，1μL报告探针(20μM)，9.6μL ddH2O，0.6μL T7聚合酶，0.8μL Ribonucleotide Solution，1μL核糖核酸酶抑制剂，1μL MgCl2(120mM)；检测缓冲液为400mM，pH7.4 Tris溶液；向每个反应单元依次加入1μL的待测样本的扩增产物；其中，向导RNA序列为：5’- GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3’；报告探针序列为 5’-FITC-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-Biotin-3’；
(8)将上述反应单元混合均匀并离心收集，然后在37℃条件下孵育30分钟，反应完成后将反应管置于冰上备用；
(9)在上述反应单元中分别加入80μL量子点微球标记抗FITC抗体溶液均匀混合，将混合液滴加在核酸试纸条样品垫上，孵育10-15分钟；
(10)将试纸条插入荧光分析仪读卡槽，等待自动读卡完毕后即可在主页面看到检测结果，记录荧光值进行分析，结果如图3和图4所示。
从图中可看出，当目的核酸浓度为1copy/μL及以上时，检测线和质控线荧光比值可以与阴性样品区分(检测限定为阴性样品检测线和质控线的荧光比值平均值加上3倍的均数标准差)。
实施例5
对上述一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法进行特异性分析，将 SARS-CoV S基因重组质粒作为特异性质控样品进行检测，具体步骤如下：
(1)按照质粒提取试剂盒的说明对质粒DNA进行提取和纯化处理，用分光光度计测定质粒浓度，用健康人上呼吸道取样标本的核酸提取物稀释至0.1 μg/μL作为特异性质控样品进行检测；采用体外转录方式获得SARS-CoV-2的S 基因片段，经过分光光度计测定含量后，用健康人上呼吸道取样标本的核酸提取物稀释至100copies/μL，作为阳性样本进行检测；每个检测样本做三次重复；
(2)将25μL RAA基础缓冲液加入RAA基础反应单元，使冻干粉充分混匀，得到RAA重悬缓冲液，准备2个基础反应单元的量，体积共50μL；
(3)配制等温扩增反应体系，平均每个反应单元包括6μL RAA重悬缓冲液， 0.5μL引物F(10μM)，0.5μL引物R(10μM)，0.2μL逆转录核酸酶(100,000U/mL)， 0.4μL ddH2O。向每个反应单元依次加入1μL的待测样本。上述各组分充分混合均匀，置于冰上备用；其中，RAA引物序列如下所示：
引物F： 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTA CATAGA-3’；
引物R：5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’；
(4)打开反应单元，向反应单元的管盖上加入2.5μL乙酸镁，充分混匀并离心收集；
(5)反应管在39℃条件下反应20-25分钟，反应完成后立即将反应管置于冰上备用；
(6)取一份LwaCas13a储备蛋白的等分试样(2mg/mL,4μL)，使用122.5μL 的存储缓冲液重悬，存储缓冲液配方为2.5mL 1M Tris(pH 7.4)，6mL 5M NaCl， 2.5mL甘油，100μL1MDTT和38.9mL ddH2O；
(7)配制CRISPER反应体系，平均每个反应单元包括2μL检测缓冲液，2μLLwaCas13a蛋白溶液，1μL向导RNA(10ng/μL)，1μL报告探针(20μM)， 9.6μL ddH2O，0.6μL T7聚合酶，0.8μL Ribonucleotide Solution，1μL核糖核酸酶抑制剂，1μL MgCl2(120mM)；检测缓冲液为400mM，pH7.4 Tris溶液；向每个反应单元依次加入1μL的待测样本的扩增产物；其中，向导RNA序列为：5’- GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3’；报告探针序列为 5’-FITC-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-Biotin-3’；
(8)将上述反应单元混合均匀并离心收集，然后在37℃条件下孵育30分钟，反应完成后将反应管置于冰上备用；
(9)在上述反应单元中分别加入80μL量子点微球标记抗FITC抗体溶液均匀混合，将混合液滴加在核酸试纸条样品垫上，孵育10-15分钟；
(10)将试纸条插入荧光分析仪读卡槽，等待自动读卡完毕后即可在主页面看到检测结果，检测线和质控线荧光比值如下表3所示：
表3
重复1 重复2 重复3
特异性质控 0.137 0.081 0.098
阳性样品 1.153 1.008 1.312
由表3的数据可以看出，SARS-CoV S基因重组质粒样品结果检测线和质控线荧光比值均小于0.5，结果判定为阴性；当对阳性样品进行检测时，比值均大于0.5，结果判定为阳性。
实施例6
对上述一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法进行稳定性分析，分别对5个SARS-CoV-2核酸阳性样品和5个SARS-CoV-2核酸阴性样品进行重复检测，具体步骤如下：
(1)本实施例采用健康人上呼吸道取样标本的核酸提取物作为阴性样本，准备5个检测样本，编号为阴性1-5；采用体外转录方式获得SARS-CoV-2的S基因片段，经过分光光度计测定含量后，用健康人上呼吸道取样标本的核酸提取物稀释至10copies/μL作为阳性样本进行检测，同样准备5个检测样本，编号为阳性1-5。每个检测样本做三次重复；
(2)将25μL RAA基础缓冲液加入RAA基础反应单元，使冻干粉充分混匀，得到RAA重悬缓冲液，准备8个基础反应单元的量，体积共200μL；
(3)配制等温扩增反应体系，平均每个反应单元包括6μL RAA重悬缓冲液， 0.5μL引物F(10μM)，0.5μL引物R(10μM)，0.2μL逆转录核酸酶(100,000U/mL)， 0.4μL ddH2O；向每个反应单元依次加入1μL的待测样本。上述各组分充分混合均匀，置于冰上备用；其中，RAA引物序列如下所示：
引物F： 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTA CATAGA-3’；
引物R：5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’；
(4)打开反应单元，向反应单元的管盖上加入2.5μL乙酸镁，充分混匀并离心收集；
(5)反应管在39℃条件下反应20-25分钟，反应完成后立即将反应管置于冰上备用；
(6)取一份LwaCas13a储备蛋白的等分试样(2mg/mL,4μL)，使用122.5μL 的存储缓冲液重悬，存储缓冲液配方为2.5mL 1M Tris(pH 7.4)，6mL 5M NaCl， 2.5mL甘油，100μL1MDTT和38.9mL ddH2O；
(7)配制CRISPER反应体系，平均每个反应单元包括2μL检测缓冲液，2μLLwaCas13a蛋白溶液，1μL向导RNA(10ng/μL)，1μL报告探针(20μM)， 9.6μL ddH2O，0.6μL T7聚合酶，0.8μL Ribonucleotide Solution，1μL核糖核酸酶抑制剂，1μL MgCl2(120mM)；检测缓冲液为400mM，pH7.4 Tris溶液；向每个反应单元依次加入1μL的待测样本的扩增产物；其中，向导RNA序列为：5’- GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3’；报告探针序列为 5’-FITC-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-Biotin-3’；
(8)将上述反应单元混合均匀并离心收集，然后在37℃条件下孵育30分钟，反应完成后将反应管置于冰上备用；
(9)在上述反应单元中分别加入80μL量子点微球标记抗FITC抗体溶液均匀混合，将混合液滴加在核酸试纸条样品垫上，孵育10-15分钟；
(10)将试纸条插入荧光分析仪读卡槽，等待自动读卡完毕后即可在主页面看到检测结果，检测线和质控线荧光比值如下表4所示：
表4
重复1 重复2 重复3
阴性样品1 0.084 0.065 0.161
阴性样品2 0.042 0.077 0.069
阴性样品3 0.234 0.045 0.060
阴性样品4 0.083 0.109 0.056
阴性样品5 0.060 0.091 0.085
阳性样品1 0.86 0.78 0.70
阳性样品2 0.71 0.89 0.77
阳性样品3 0.79 0.74 0.65
阳性样品4 0.72 0.83 0.76
阳性样品5 0.82 0.93 0.76
由表4的检测线和质控线荧光比值数据可以看出，5个阴性样品重复测定时，比值均小于0.5，结果判定为阴性。当对阳性样品进行检测时，比值均大于0.5，结果判定为阳性。检测的10个样品中没有出现假阴性和假阳性结果。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (10)

1.一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，其特征在于：包括以下几个步骤：
步骤一，利用重组酶介导等温核酸扩增技术，取待测样品进行核酸扩增；
步骤二，结合CRISPR/Cas13a基因编辑工具，在扩增产物里加入LwaCas13a蛋白进行反应；
步骤三，将反应产物与量子点微球标记抗FITC抗体溶液混合后加在荧光免疫层析试纸上，使用荧光分析仪读取结果或紫外激光灯进行结果观察。
2. 如权利要求1所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，其特征在于：所述步骤一中，重组酶介导等温核酸扩增的等温反应体系为：6μL RAA重悬缓冲液，10 μM引物F 0.5 μL，10 μM引物R 0.5μL，100,000 U/mL逆转录核酸酶0.2 μL，0.4 μL ddH2O，1 μL待测样品。
3.如权利要求2所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，其特征在于：
所述引物F：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA-3’；
所述引物R：5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’。
4. 如权利要求2所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，其特征在于：所述RAA重悬缓冲液的配制方法为：将25μL RAA基础缓冲液加入RAA基础反应单元，使冻干粉充分混匀。
5. 如权利要求1所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，其特征在于：所述步骤二中，CRISPER反应体系为：2 μL检测缓冲液，2μL LwaCas13a蛋白溶液，10 ng/μL向导RNA 1μL，20 μM报告探针1 μL，9.6μL ddH2O，0.6μL T7 聚合酶，0.8μLRibonucleotide Solution，1 μL核糖核酸酶抑制剂，120mM MgCl2 1μL，1 μL扩增产物。
6. 如权利要求5所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫方法，其特征在于：所述LwaCas13a蛋白的存储缓冲液配方为2.5 mL 1M pH7.4 Tris，6 mL 5M NaCl，2.5 mL甘油，100μL 1M DTT和38.9 mL ddH2O；所述检测缓冲液为400mM，pH7.4 Tris溶液。
7.如权利要求5所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，其特征在于：所述向导RNA序列为：
5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3’；
所述报告探针序列为：5’-FITC-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-Biotin-3’。
8.如权利要求1所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，其特征在于：所述步骤三中，荧光免疫层析试纸由PVC底板、吸水纸、检测线、硝酸纤维素膜、质控线、样品垫依次首尾搭接；所述硝酸纤维素膜黏贴在底板中部，硝酸纤维素膜两端分别粘贴叠压有样品垫和吸水纸，硝酸纤维素膜靠近样品垫一端设有质控线，远离样品垫一端设有检测线，所述质控线上包被有链霉亲和素，所述检测线上包被有二抗，所述二抗为量子点微球标记抗FITC抗体的IgG抗体。
9.如权利要求8所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，其特征在于：所述荧光免疫层析试纸的制备方法如下：
（1）量子点微球标记抗FITC抗体制备：利用EDC/NHS活化羧基的实验方法活化量子点微球，随后立即在活化好的微球溶液中加入抗FITC抗体进行偶联反应，偶联结束后离心重悬制备得量子点微球标记抗FITC抗体溶液；
（2）检测线和质控线的制备：将能与抗FITC抗体结合的IgG抗体，在硝酸纤维膜上进行线状点样制得；将能与生物素结合的链霉亲和素，在硝酸纤维膜上线状点样制得；
（3）沿同一方向依次将样品垫、硝酸纤维膜、吸水纸搭接粘连；所述硝酸纤维膜上的质控线靠近样品垫一端，检测线靠近吸水纸一端。
10. 如权利要求1所述的一种检测SARS-CoV-2核酸的荧光免疫层析方法，其特征在于：所述步骤三中，量子点微球为激发光波长为300-450 nm，发射波长为575 nm和610 nm。
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