CN1811449A - 量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种检测技术领域的量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法。本发明将量子点标记目标物的抗体涂覆于玻璃纤维膜上，目标物的另一抗体与二抗分别包被在硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜上形成检测带与质控带；在聚酯或塑料板上将玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜制成免疫层析试纸条，利用双抗体夹心法原理结合量子点的荧光性质检测样品中是否含有目标物，在紫外灯照射下，通过观察免疫层析试纸条上检测带与质控带的荧光线，判断检测结果；用不同粒径或种类的量子点标记不同目标物的抗体，能实现多组分的同时检测。本发明简单快速，成本低，适用于激素、蛋白质、病毒、毒品、细菌、农药、环境污染等检测，可在医院、海关、机场、家庭等使用。

Description

量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法

技术领域

本发明涉及的是一种检测技术领域的方法，具体的说，涉及的是一种量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法。

背景技术

现有的胶体金标记的免疫层析分析法已经在临床医学检验中得到了广泛应用，其基本原理是以微孔膜为固相载体，包被目标物(即被测物)的抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细管虹吸作用使标本中的目标物与膜上包被的抗原或抗体结合，通过胶体金标记物与之反应形成胶体金本身的颜色(红色)，可通过肉眼观察检测结果。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，胶体金的颜色很浅很难用肉眼来判断结果，灵敏度低。量子点是半径小于或接近于激子玻尔半径的一类半导体纳米粒子，由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规块体材料所不具备的光吸收特性，研究发现量子点的激发光谱在吸收阀值以上几乎是连续的，谱峰较宽，只需一个比其发射光波长短的任意波长的光源激发，可发射高亮度的荧光(峰窄、对称)，荧光寿命长。量子点根据原料不同和同一原料粒子大小的不同，可产生不同颜色和不同波长的发射光，通过控制量子点的粒径来精确调谐发射波长，是一类理想的荧光探针。

经对现有技术的文献检索发现，中国专利申请号为03127115.4的专利，将目标物抗体直接或间接包被在聚苯乙烯板的微孔中，用量子点标记目标物的另一抗体，通过免疫反应，形成聚苯乙烯微孔板抗体-抗原(目标物)-量子点标记抗体的荧光复合物，通过对复合物的荧光强度检测，实现目标物的定量测定。该专利是用量子点标记的免疫分析法代替传统的酶联免疫分析法，需要荧光酶标检测仪。检索中还发现，中国专利申请号200410010736.3的专利，用胶体金标记抗体与目标物结合，通过免疫反应与膜上包被量子点标记的抗体结合，形成检测带，在用肉眼对检测带进行初步定性或半定量检测的基础上，再利用胶体金对荧光纳米粒子的荧光淬灭作用，通过检测荧光信号的淬灭程度对检测条带进行定量检测。该专利要用两种粒子标记，方法不够简单；采用荧光信号的淬灭程度进行定量检测，干扰因素多，检测灵敏度低。

发明内容

本发明针对现有技术的不足和缺陷，利用量子点多波长激发、高强度荧光发射、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，提供一种量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，对被测物进行定性或半定量检测。本发明只需改变量子点的粒径或种类，就可得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同的抗体，可产生多色荧光，实现多组分的检测，方法简单快速，不需要贵重的仪器，成本低。

本发明是通过以下技术方案实现的：将量子点标记目标物的抗体涂覆于玻璃纤维膜上，目标物的另一抗体与二抗分别包被在硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜上形成检测带与质控带。在聚脂或塑料板上将上两种膜制成免疫层析试纸条，利用双抗体夹心法原理结合量子点的荧光性质检测样品中是否含有目标物。在紫外灯照射下，通过观察免疫层析试纸条上检测带与质控带的荧光线，判断检测结果。用不同粒径或种类的量子点标记不同目标物的抗体，可产生多色荧光，实现多组分的同时检测。

以下对本发明的技术方案作进一步说明：

1、量子点标记目标物抗体

量子点标记抗体的方法是通过常规的静电作用、疏水作用、生物分子间的特异作用、化学连接剂等方法，将目标物的抗体连接到量子点颗粒的表面。量子点可以是单一化合物形成的量子点粒子或是几种物质组装成的复合物量子点粒子；目标物抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

2、玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜的处理

将量子点标记的抗体用微定量喷头喷涂在玻璃纤维膜上，目标物的另一抗体及二抗分别喷涂在硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜上形成检测带及质控带，制备时要求检测带与质控带平行，将膜干燥后放置于4℃待用。

3、免疫层析试纸条的制备

在单面聚脂或塑料板上，依次粘贴上玻璃纤维或纤维素滤膜(样品垫)、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜、吸水纤维素膜、已平行包被抗体的硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜，膜与膜之间都要紧密相连，将粘贴好的聚脂或塑料板切成3-5mm宽的试纸条，得到免疫层析试纸条，干燥封装，4-25℃避光保存。

4、样品的测试和结果判断

将试纸条的样品垫端插入待测样品液中，或用滴管将样品液滴于样品垫上，免疫层析后取出试纸条，在紫外灯下观察结果。如果检测带与质控带处都有荧光，说明待测样品中含有目标物，检测带上的荧光越强目标物的含量高；如果只有质控带有荧光，说明待测样品中没有目标物；如果检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。

本发明根据量子点的荧光性质，即改变量子点的粒径或种类，就可得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同目标物的抗体，可产生多色发光，实现多组分的检测。根据待测物的数量决定包被检测带的条数，如果要在样品中检测两种物质，那么检测带为两条，检测三种物质就是三条，如此类推。

所述的紫外灯照射是指波长在320-400nm中心波长360nm的普通紫外灯。用波长小的光源照射使量子点产生的荧光强度高，检测灵敏度高。

本发明将免疫反应的高特异性与量子点的荧光特性相结合，利用量子点多波长激发、高强度荧光发射，发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，建立快速、特异、简便、灵敏的免疫层析检测方法，也可通过荧光信号的减弱对被测物进行定量检测，方法简单，成本低，适用于血样、尿样、唾液等样本，应用于激素、蛋白质、病毒、毒品、细菌、环境污染等检测，可在医院、海关、机场、家庭等场所使用。

具体实施方式

本发明利用量子点的荧光特性，即多波长激发、高强度荧光发射，发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好，将量子点标记目标物(即被测物)的抗体，然后将此标记物涂覆于玻璃纤维膜上，目标物的另一抗体(单抗或多抗)包被在硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜上形成检测带，在此包被膜上同时平行包被抗抗体(二抗)形成质控带。再将玻璃纤维或纤维素滤膜、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜、吸水纤维素滤膜、包被抗体的硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜依次粘贴在聚脂或塑料板上，利用双抗体夹心法原理检测样品中是否含有目标物。当待测样品中含有目标物时，目标物先与量子点标记抗体结合，由于层析作用反应结合物沿包被硝酸纤维素膜向前移动，当遇到包被抗体时形成抗体-抗原(目标物)-量子点标记抗体复合物而富集在检测带上，多余的量子点标记物继续移动到控制带位置，由于二抗与量子点标记的抗体发生免疫反应，又富集在控制带上，2～20分钟后，取出试纸条在任意波长的紫外灯照射下，用肉眼在检测带和质控带上看到两条荧光线的，为阳性结果，通过测量荧光强弱进行定量检测；如果只看到质控带上一条荧光线，为阴性结果；如果检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。

所述的量子点可选用以下颗粒：

(1)单一化合物的量子点，这些量子点可以是第III族和第V族组成的化合物，如GaAs，GaSb，InAs，InP，InGaAs，AlGaAs，InAlAs等任意一种；第II族和第VI族组成的化合物，如MgSe，MgTe，CaS，CaSe，CaTe，SrS，SrSe，SrTe，BaS，BaSe，BaTe，ZnS，ZnSe，ZnTe，CdS，CdSe，CdTe等任意一种；第IV族和第IV族组成的化合物，如SiC，SiGe中的任意一种；第IV族和第VI族组成的化合物。

(2)由量子点化合物与其它化学物质组装而成的量子点颗粒，这些颗粒可以是无机小分子与量子点化合物组装而成，如ZnS包覆CdSe，二氧化硅包覆CdSe，二氧化硅包覆CdTe，量子点包覆磁性粒子等任意一种；可以是有机高分子聚合物与量子点化合物组装而成，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、树形分子等任意一种包裹一种量子点或几种量子点制成的颗粒。

以下结合本发明的技术方案提供实施例。

实施例一：

将乙酸镉溶解在含三辛基膦的油酸中，再加入溶解在三辛基膦中的金属硒粉(Cd2+/Se2-＝1∶2)，在140℃下搅拌反应5min-60min，并间隔一定时间取样，经过离心得到不同粒径的(1.2nm-6.6nm)CdSe量子点，根据量子点粒径的不同，可得到黄色到深棕红色的溶液。CdSe量子点分散在正己烷，氯仿，甲苯等有机溶剂中储存。采用细乳液聚合法使1.5nm的CdSe量子点形成聚集体，这些聚集体被聚苯乙烯聚合物包覆得到粒径约为60-70nm带有量子点的复合物颗粒，通过丙烯酸修饰使聚合物量子点微球表面带有羧基官能团。在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下，将带有羧基的量子点复合物微球与抗癌胚抗原(CEA)的单抗连接，室温搅拌反应2小时，采用离心分离纯化，得到量子点微球标记的抗体。将标记好量子点的CEA单抗均匀的喷涂在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺3平方厘米，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在硝酸纤维素膜上用机器划两条平行带，两条带间隔8mm，两条带宽都为1.5mm，其中一条带上喷涂CEA的多抗(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至2mg/mL)形成检测带；另一条带上喷涂羊抗鼠二抗形成质控带，室温晾干20分钟后，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60分钟，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在单面塑料板上，依次粘贴上玻璃纤维(长30厘米，宽2厘米)、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜(长30厘米，宽度根据抗体的滴度与实验要求确定，这里选择5mm)、吸水玻璃纤维膜(长30厘米，宽3厘米)、已平行包被抗体的硝酸纤维素膜(长30厘米，宽1.5厘米)，最后贴上长30厘米，宽2厘米的吸水纸，吸收层析后多余的溶液，膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫试纸条，干燥下封装，4-25℃避光保存。

将4mm宽的免疫试纸条样品垫端插入待测血清中，或用滴管滴加3滴血清于样品垫上，全部试验过程仅需5-20分钟，取出试纸条在紫外灯下观察结果。测定CEA强阳性标本5分钟报结果，测定弱阳性和阴性标本20分钟报结果。如果膜上的检测带与质控带处都有黄绿色荧光，即两条荧光，说明待测样品中含有CEA为阳性结果，在检测带的荧光越强CEA的含量高；如果只有质控带有黄绿色荧光，即一条荧光，说明待测样品中没有CEA为阴性结果；如果检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。该检测方法的灵敏度为15ng/ml，批内与批间重复性较好。

实施例二：

氯化镉溶解在含有巯基乙酸的碱性(pH 10)水溶液中，加入离子型碲源NaHTe(由碲粉和硼氢化钠制备成)，100℃反应5-240分钟，反应时间不同得到量子点的粒径不同(1.8-4.2nm)，溶液颜色由绿色到橙色最终为红色，合成表面带有羧基的CdTe量子点。选用粒径为2.5纳米的量子点，在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与抗β亚基绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的单抗连接，室温搅拌反应2小时，用Sephadex G-200层析柱分离纯化，得到量子点标记的抗体。将标记好量子点的HCG单抗均匀的喷涂在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4平方厘米，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜上用机器划两条平行带，两条带间隔10mm，两条带宽都为1.5mm，其中一条带上喷涂抗α亚基绒毛膜促性腺激素(α-HCG)的多抗(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至3mg/mL)形成检测带；另一条带上喷涂羊抗鼠二抗形成质控带，室温晾干20分钟后，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60分钟，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在单面聚脂板上，依次粘贴上纤维素滤膜(长30厘米，宽2厘米)、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜(长30厘米，宽度根据抗体的滴度与实验要求确定，这里选择4mm)、吸水纤维素滤膜(长30厘米，宽3厘米)、已平行包被抗体的硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜(长30厘米，宽1.5厘米)，最后贴上长30厘米，宽2厘米的吸水纸，吸收层析后多余的溶液，膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫试纸条，封装干燥下，4-25℃避光保存。

将4mm宽的免疫试纸条样品垫端插入待测尿样中，或用滴管滴加4滴尿样于样品垫上，全部试验过程仅需5分钟，取出试纸条在紫外灯下观察结果。如果膜上的检测带与质控带处都有黄色荧光，即两条荧光，说明待测样品中含有HCG为阳性结果，在检测带的荧光越强HCG的含量高；如果只有质控带有荧光，即一条荧光，说明待测样品中没有HCG为阴性结果；如果检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。该检测方法的灵敏度为30mIU/mL，批内与批间重复性性较好，可用于早孕诊断。

实施例三：

氯化镉溶解在含有巯基乙胺的酸性(pH4)水溶液中，加入离子型碲源NaHTe(由碲粉和硼氢化钠制备成)，100℃反应5-240分钟，反应时间不同得到量子点的粒径不同(2.5-5.5nm)，溶液颜色由灰色到红色最终为紫色，合成表面带有氨基的CdTe量子点。选用粒径为4纳米的量子点，在磷酸缓冲液(0.05MpH＝7.4)中，将水溶性的表面包覆巯基乙胺的量子点和戊二醛混合，并向其加入一定量的抗甲胎蛋白(AFP)单抗，室温下搅拌反应4小时，用Sephadex G-200层析柱分离纯化，得到量子点标记的抗AFP单抗；选用实施例二方法合成的表面带有羧基的CdTe量子点(2.5纳米)，在连接剂碳二亚胺(EDC)的作用下与抗癌胚抗原(CEA)的单抗连接，室温搅拌反应2小时，同样用Sephadex G-200层析柱分离纯化，得到量子点标记的抗CEA单抗。将量子点标记的AFP单抗与量子点标记的CEA单抗等体积混合，并且均匀的喷涂在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺1.5平方厘米，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在硝酸纤维素膜上用机器划三条平行带，每条带间隔5mm，带宽都为1.5mm，第一条带上喷涂CEA的多抗(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至2mg/mL)形成检测带A；第二条带上喷涂AFP的多抗(用0.05M pH8.5磷酸盐缓冲液稀释至2.5mg/mL)形成检测带B；第三条带上喷涂羊抗鼠二抗形成质控带，室温晾干20分钟后，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭60分钟，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

在单面塑料板上，依次粘贴上玻璃纤维(长30厘米，宽2厘米)、涂有量子点标记抗体的玻璃纤维膜(长30厘米，宽度根据抗体的滴度与实验要求确定，这里选择6mm)、吸水纤维素滤膜(长30厘米，宽3厘米)、已平行包被三种抗体的硝酸纤维素膜(长30厘米，宽2.5厘米)，最后贴上长30厘米，宽2厘米的吸水纸，吸收层析后多余的溶液，膜与膜之间都要紧密相连，制成免疫层析试纸大板。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成5mm宽的免疫试纸条，封装干燥下，4-25℃避光保存。

将5mm宽的免疫试纸条样品垫端插入待测血清中，或用滴管滴加3滴血清于样品垫上，全部试验过程仅需15分钟，取出试纸条在紫外灯下观察结果。测定CEA强阳性标本5分钟报结果，测定弱阳性和阴性标本20分钟报结果。如果膜上的检测带与质控带处都有荧光(检测带A为黄色荧光，检测带B为红色荧光，质控带橙色荧光)，即三条荧光，说明待测样品中既含有CEA，又含有AFP；如果检测带A为黄色荧光，检测带B无荧光，质控带为黄色荧光，说明待测样品中只含有CEA，没有AFP；如果检测带A无荧光，检测带B有红色荧光，质控带为红色荧光，说明待测样品中只含有AFP，没有CEA；如果只有质控带有荧光，即一条荧光，说明待测样品中既没有CEA，又没有AFP；如果检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。该方法检测CEA的灵敏度为5.6ng/ml，检测AFP的灵敏度为8ng/ml，批内与批间重复性性较好，一次可检测两种物质。

Claims (9)

1、一种量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，其特征在于，将量子点标记目标物的抗体涂覆于玻璃纤维膜上，目标物的另一抗体与二抗分别包被在硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜上形成检测带与质控带，在聚脂或塑料板上将上面制备的玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜制成免疫层析试纸条，利用双抗体夹心法原理结合量子点的荧光性质检测样品中是否含有目标物，在紫外灯照射下，通过观察免疫层析试纸条上检测带与质控带的荧光线，判断检测结果；用不同粒径或种类的量子点标记不同目标物的抗体，能实现多组分的同时检测。

2、根据权利要求1所述的量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，其特征是，所述的量子点是单一化合物形成的量子点粒子或是几种物质组装成的复合物量子点粒子。

3、根据权利要求1所述的量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，其特征是，所述量子点标记目标物的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

4、根据权利要求1所述的量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，其特征是，所述量子点标记抗体的方法，是通过静电作用、疏水作用、生物分子间的特异作用、化学连接剂中的任意一种方法，将目标物的抗体连接到量子点颗粒的表面。

5、根据权利要求1所述的量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，其特征是，所述将量子点标记目标物的抗体涂覆于玻璃纤维膜上，是指：将制备好的量子点标记抗体均匀喷涂或涂覆在玻璃纤维膜上，室温干燥后封袋，置4℃保存备用。

6、根据权利要求1所述的量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，其特征是，所述的目标物的另一抗体与二抗分别包被在硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜上形成检测带与质控带，具体为：用包被缓冲液稀释抗体到设定浓度喷涂或涂覆在膜上，室温晾干后，再将膜放入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，20-37℃封闭60分钟，干燥后封袋，放置4℃保存备用。

7、根据权利要求1所述的量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，其特征是，改变量子点的粒径或种类，得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同目标物的抗体，产生多色发光，实现多组分的检测，其中根据待测物的数量决定包被检测带的条数。

8、根据权利要求1所述的量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，其特征是，所述的紫外灯照射是指波长在320-400nm中心波长360nm的普通紫外灯。

9、根据权利要求1所述的量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，其特征是，所述的在紫外灯下观察结果，具体为：如果检测带与质控带处都有荧光，说明待测样品中含有目标物，检测带上的荧光越强目标物的含量高；如果只有质控带有荧光，说明待测样品中没有目标物；如果检测带与质控带处都没有荧光，说明检测无效。