CN108089009A - 一种胎儿纤维连接蛋白荧光免疫层析试条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种胎儿纤维连接蛋白荧光免疫层析试条及其制备方法，所述试纸条包括底板、反应膜、样品垫、结合垫和吸收垫；所述结合体垫包被有荧光标记的鼠抗胎儿纤维连接蛋白单克隆抗体1（M×fFN1）和荧光标记的兔IgG；所述反应膜具有一条T线检测区及C线质控区，包被的抗体分别为鼠抗胎儿纤维连接蛋白单克隆抗体2（M×fFN2）与鼠抗兔IgG单克隆抗体（M×RbIgG）。该方法简便、快捷、高灵敏度、高特异性，适用于床边快速定量检测。

Description

一种胎儿纤维连接蛋白荧光免疫层析试条及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于早产预测的胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条及其制备方法。
背景技术
早产是新生儿患病甚至死亡的主要原因。精确辨别早产风险高的孕妇可以让妇产科提供有针对性的治疗，例如注射类固醇类药物以促进胎儿肺部发育等。早产的预测方法有很多种，如早产高危因素识别、子宫活动监测、孕妇体液中针对炎症的各种细胞因子的检测、宫颈阴道分泌物中胎儿纤维连接蛋白（Fetal Fibronectin，fFN）检测和超声测量宫颈长度等。在各种早产预测方法中，从循证医学的证据分析确定具有预测意义并且广泛应用于临床的只有利用超声测量的宫颈长度和宫颈阴道分泌物中fFN的检测这两种方法，其中通过fFN检测评估早产风险的准确度更高。
目前检测宫颈阴道分泌物中fFN的方法主要有两种：第一种是基于酶联免疫吸附法（ELISA）的定量检测。另一种是基于胶体金试条的病床边快速定性检测。由于胶体金试条具有操作简便快捷、30分钟内获得测试结果、成本低廉等优势，目前在科研及临床上得到了广泛的使用。正常情况下，妊娠22-35周间，宫颈阴道分泌物中fFN应为阴性(浓度<50ng/ml)。fFN早产检测阴性结果(浓度<50ng/ml)的预测值很高（92%-99%），可基本排除两周内早产的可能性。但fFN测试阳性(浓度>50ng/ml)的预测值非常低，只有9%-46%。阳性检测结果的定量检测通过细分fFN不同浓度区间，可提高阳性检测结果的预测值。但ELISA仪器昂贵，对操作人员专业性要求高，患者样品需要被送到相关的实验室进行ELISA分析，以及检测耗时长（24-36小时）等缺点限制了它的推广与使用。
量子点（QDs）是由Ⅱ~Ⅵ或Ⅲ~Ⅴ族元素组成的，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接收激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，近似球形，可分散于水或有机溶剂中形成胶体，直径约为2nm-10nm。量子点作为荧光标记物所特有的优势，如激发光谱宽，发射波长窄，荧光强度强，稳定性好，生物相容性好，荧光寿命长的特点，使其在疾病诊断等生物医学领域具有广阔的应用前景。
因此，研发一种简便、快捷、高灵敏度、高特异性的，适用于床边快速定量检测fFN的荧光免疫层析试条具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条及其制备方法，该方法简便、快捷、高灵敏度、高特异性，适用于床边快速定量检测。本发明的另一个目的在于提供制备上述荧光免疫层析检测试条的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条包括底板、反应膜、样品垫、结合垫和吸收垫。其中所述结合垫包被有荧光素标记的胎儿纤维连接蛋白单克隆抗体和荧光素标记的兔IgG；所述反应膜具有一条T线检测区及C线质控区，包被的抗体分别为鼠抗ffn单克隆抗体与鼠抗兔IgG 单克隆抗体。
所述荧光素标记的标记荧光素为水溶性带有羧基的ZnS/CdSe量子点。
所述fFN荧光免疫层析试条所用的量子点具有激发光谱宽，发射波长窄，荧光强度强，稳定性好，生物相容性好，荧光寿命长的特点。
所述反应膜为硝酸纤维素膜。
所述结合垫为聚酯膜。
所述抗体为鼠抗ffn单克隆抗体和鼠抗兔IgG 单克隆抗体。
本发明还提供了一种制备上述荧光试条的方法，其包括如下步骤 ：
1）包被：用10mM PBS（pH7.4）将鼠抗fFn单抗与鼠抗兔IgG分别稀释至2.0mg/mL、1.5mg/mL，分别包被在T线检测区及C线质控区，37℃烘干5h。其中T线检测区及C线质控区间隔为4.5mm。
2）标记：将水溶性带有羧基的ZnS/CdSe量子点、鼠抗fFn单抗按3:1的质量比混合于磷酸缓冲液（10mM，pH7.4），涡旋仪上低速混匀，然后加入终浓度均为5ug/mL的EDC、NHS溶液，涡旋混匀后，37℃摇床中反应4h。反应完成后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去游离的抗体，最后产物分散在含1%BSA的PBS缓冲液中；按照3ul/cm喷在结合垫聚酯膜上，37℃烘干3h；
3）组装：将结合垫，样品垫按顺序贴在硝酸纤维素膜上，最后在硝酸纤维素膜的另一端贴上吸收垫，各个垫与膜之间相互重叠1-2mm，试纸条组装完成。用切条机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约为4mm，并将其装入塑料卡中，并将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。
在使用时，加样方式为样本与生理盐水按1:9的比例混合均匀，取75μL样本滴加到试条卡加样孔后，样本中的fFN与量子点标记的鼠抗fFN单克隆抗体1结合形成反应复合物（QDs-M×fFN1- fFN），反应复合物在层析作用下沿着硝酸纤维素膜前移，移至检测线（T线）处，反应复合物被检测线包被的鼠抗fFN单克隆抗体2捕获，形成最终的反应复合物（QDs-M×fFN1- fFN- M×fFN2）；量子点标记的RbIgG被对照线处（C线）的鼠抗兔IgG抗体（M×RbIgG）捕获，形成复合物（QDs-RbIgG- M×RbIgG）。样本中的fFN浓度与荧光信号成正相关，通过免疫荧光分析仪，根据样本相对荧光信号，得到样本浓度值。
RbIgG及鼠抗fFN单克隆抗体1（M×fFN1）的标记是按照量子点标记工艺，将标记物喷涂在聚酯膜上，其目的是在检测时作为检测带和质控带的荧光信号。
鼠抗fFN单克隆抗体2（ M×fFN2）、鼠抗兔IgG抗体(M×RbIgG ) 的包被是指按照荧光层析试条制作工艺，利用点膜机将检测抗体、质控抗体划线到硝酸纤维素膜上，其目的是在检测时作为检测带和质控带。
试纸条组装和切割是在包被有检测抗体和质控抗体的硝酸纤维素膜的一侧贴上样品垫和标记抗体结合垫，另一侧贴上高强度吸水纸，利用切割机进行试纸条的切割。
免疫层析反应是双抗体夹心法免疫学方法。
所述胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条采用专用荧光试条检测设备，检测设备的激发光波长为365nm。可以进行定量检测，具有简便、快捷、高灵敏度、高特异性的，适用于床边快速定量检测等优势。
本发明的优点在于：该试条具有灵敏度高，特异性高，操作简便、快速、成本低等优点。
附图说明
图1胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条的结构示意图。图中，1为底板、2为硝酸纤维素膜、3为结合垫、4为样品垫、5为吸收垫、6为T线检测带、7为C线质控带。
图2胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条俯视图。图中，1为底板、2为硝酸纤维素膜、3为结合垫、4为样品垫、5为吸收垫、6为T线检测带、7为C线质控带。
图3胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条为阴性的结果示意图。在激发光的激发下，硝酸纤维素膜上仅有C线质控带显现荧光线，表示检测结果为阴性。
图4胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条为阳性的结果示意图。在激发光的激发下，硝酸纤维素膜上 C线质控带和T线检测带都有荧光线显现，表示检测结果为阳性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实例进一步详细阐述，以使本发明的特征和优点能更易于被该技术领域的技术人员理解。
实施例1 胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条的制备
参照附图1，本发明的胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条包括底板1、粘附于底板上的反应膜2、覆盖于反应膜一侧上的吸收垫5、覆盖于反应膜上另一侧的结合垫3、覆盖于结合垫上的样品垫4。其中所述结合垫包被有荧光标记的胎儿纤维连接蛋白单克隆抗体和荧光标记的兔IgG；所述反应膜具有一条T线检测区6及C线质控区7，分别包被的抗体分别为鼠抗fFn单抗与鼠抗兔IgG 抗体。
所述荧光标记的标记荧光素为水溶性带有羧基的ZnS/CdSe量子点。
所述fFN荧光免疫层析试条所用的量子点具有激发光谱宽，发射波长窄，荧光强度强，稳定性好，生物相容性好，荧光寿命长的特点。
所述反应膜为硝酸纤维素膜。
所述结合垫为聚酯膜。
所述抗体为鼠抗fFn单克隆抗体和鼠抗兔IgG 单克隆抗体。
一种制备上述荧光试条的方法，其包括如下步骤 ：
1）包被：用10mM PBS（pH7.4）将鼠抗fFn单抗与鼠抗兔IgG分别稀释至2.0mg/mL、1.5mg/mL，分别包被在T线检测区及C线检测区，37℃烘干5h。其中T线检测区及C线质控区间隔为4.5mm。
2）标记：将水溶性带有羧基的ZnS/CdSe量子点、鼠抗fFn单抗按3:1的质量比混合于磷酸缓冲液（10mM PB，pH7.4），涡旋仪上低速混匀，然后加入EDC、NHS溶液，使之终浓度均为5ug/mL，涡旋混匀后，37℃摇床中反应4h。反应完成后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗三次以除去游离的抗体，最后产物分散在含1%BSA的PBS缓冲液中。按照3ul/cm喷在聚酯膜上，37℃烘干3h。
3）组装：将结合垫，样品垫按顺序贴在硝酸纤维素膜上，最后在硝酸纤维素膜的另一端贴上吸收垫，各个垫与膜之间相互重叠2mm，试纸条组装完成。用切条机将完成组装的试纸条进行切割，宽度为4mm，并将其装入塑料卡中，并将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。
实施例2 胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条灵敏度测试
胎儿纤维连接蛋白( 浓度8μg/ml)梯度稀释成浓度(ng/ml)分别为4000、2000、500、200、50、20、10、0,分别吸取上述浓度的胎儿纤维连接蛋白10μL与90μL生理盐水混合均匀，分别取75μL混合物加到胎儿纤维连接蛋白试纸条的样品垫上，室温下放置15分钟，通过荧光检测仪检测结果。检测灵敏度在10ng/ml 以下。
表1 胎儿纤维连接蛋白试纸条检测不同浓度梯度蛋白结果
实施例3 胎儿纤维连接蛋白（fFN）荧光免疫层析试条特异性测试
选取6份标本（孕妇阳性羊水样本）,分别吸取上述标本10μL与90μL生理盐水混合均匀，分别取75μL混合物加到胎儿纤维连接蛋白试纸条的样品垫上，室温下放置15分钟，通过荧光检测仪检测结果。从表2检测结果可以看出，T线均有明显的荧光信号，明显大于表1中50ng/mL的荧光信号，为阳性。
表2 胎儿纤维连接蛋白试纸条检测样本结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种胎儿纤维连接蛋白荧光免疫层析试条，其特征在于：所述试纸条包括底板、反应膜、样品垫、结合垫和吸收垫；所述结合垫包被有荧光标记的胎儿纤维连接蛋白单克隆抗体和荧光标记的兔IgG；所述反应膜具有一条T线检测区及C线质控区，包被的抗体分别为鼠抗ffn单克隆抗体与鼠抗兔IgG 单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白荧光免疫层析试条，其特征在于：所述荧光标记的标记荧光素为水溶性带有羧基的ZnS/CdSe量子点。
3.根据权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白荧光免疫层析试条，其特征在于：所述反应膜为硝酸纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白荧光免疫层析试条，其特征在于：所述结合垫为聚酯膜。
5.如权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白荧光免疫层析试条的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤 ：
1）包被：用pH7.4 10mM PBS将鼠抗fFn单克隆抗体与鼠抗兔IgG分别稀释至2.0mg/mL、1.5mg/mL，分别包被在T线检测区及C线检测区，37℃烘干5h；其中T线检测区及C线检测区间隔为4.5mm；
2）标记：将水溶性带有羧基的ZnS/CdSe量子点、鼠抗fFn单克隆抗体按3:1的质量比混合于10mM、pH7.4磷酸缓冲液，涡旋仪上低速混匀，然后加入终浓度均为5ug/mL的EDC、NHS溶液，涡旋混匀后，37℃摇床中反应4h；反应完成后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去游离的抗体，最后产物分散在含1%BSA的PBS缓冲液中；按照3ul/cm喷在结合垫聚酯膜上，37℃烘干3h；
3）组装：将结合垫、样品垫按顺序贴在硝酸纤维素膜上，最后在硝酸纤维素膜的另一端贴上吸收垫，各个垫与膜之间相互重叠1-2mm，试纸条组装完成；用切条机将完成组装的试纸条进行切割，宽度为4mm，并将其装入塑料卡中，并将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。
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