CN108387748A - 用于检测猫血清淀粉样蛋白a的免疫荧光层析检测卡与制备方法 - Google Patents

用于检测猫血清淀粉样蛋白a的免疫荧光层析检测卡与制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡及其制备方法；旨在提供一种灵敏度高，检测结果可靠的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡；其技术要点包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述结合垫上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY，所述的硝酸纤维膜设有一条包被SAA单克隆抗体的检测T线，以及一条包被鸡IgY的质控C线；属于动物疫病检测领域。

Description

用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡与制备 方法
技术领域
本发明公开了一种免疫荧光层析检测卡，具体地说，是一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，本发明还公开了该免疫荧光层析检测卡的制备方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(SAA)是存在于许多物种中的一种主要的急相蛋白，包括人、犬、猫和马等。一旦机体受到感染、创伤及外科手术等引起炎症刺激后，SAA的浓度会在数小时内迅速升高；同时SAA半衰期非常短，随着炎症源的清除，SAA的浓度水平又会迅速下降。
SAA的基因序列在脊椎动物中高度保守。人SAA含有104个氨基酸。而猫的SAA相当于在人的SAA分子中间区域插入了额外的111个氨基酸序列。
SAA是一种灵敏的炎症和组织损伤标志物。在兽医学中，测定血液中的SAA可以用于诊断亚临床炎症、监控动物炎症和感染的治疗效果以及监控病患外科手术进程。
现有的SAA检测方法主要是酶联免疫法，由于酶联免疫测定周期长，不能在自动生化分析仪上使用，不适合急诊的快速检测，是SAA检测试剂盒普及的弊端，而胶乳增强免疫比浊法操作简单，经济，可以在绝大多数医院的自动生化分析仪上使用，特别是急诊能实现快速定量检测，其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物含量。
中国专利ZL 201210575603.5一种快速定量检测血清淀粉样蛋白A试剂盒，所述试剂盒包括由SAA单抗包被于胶体金制成的冻干抗SAA免疫胶体金、反应板、样品稀释液、冻干胶体金复溶液、洗涤液和封闭液；所述反应板为胶体金检测板，反应板上的硝基纤维膜由针对另一反应决定簇的另一纯化SAA单抗或多抗包被；但是该方法采用免疫渗滤法，需要溶解抗SAA金标液冻干品并稀释、稀释样本、滴加封闭液、渗入、滴加稀释好的抗SAA金标液、加洗涤液、最后检测等一系列步骤，非常繁琐费时，不利于疾病早期快速诊断与治疗。另外该专利采用胶体金作为示踪物，免疫标记物依靠静电吸附，存在灵敏度较低、难以定量、重复性和稳定性较差等缺陷，无法完全满足临床的检测需求。
中国专利ZL201510497125.4公开了一种人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用人血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中组成，但是该方法使用到两种缓冲液，液体需要冷藏，检测时需要采用日立7080型等自动生化分析仪，体积比较庞大，不合适现场检测，不能对进行进行尽早的诊断与治疗。
中国专利ZL201511020151.4公开了一种血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂盒体以及稀释液瓶，所述试剂盒体包括免疫层析检测卡，所述免疫层析检测卡包括PVC衬板以及固定在PVC衬板上的样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫搭接在探针固定垫上，所述探针固定垫和吸水纸分别搭接在所述硝酸纤维素膜两侧，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和控制线，所述检测线内包被有血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，所述控制线内包被有羊抗兔IgG；所述探针固定垫由血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒组成的混合荧光胶乳微粒干燥制得；但是该方法存在下述缺点：荧光乳胶微粒需要先与白蛋白进行偶联，然后再与血清淀粉样蛋白A单克隆抗体进行偶联，虽然可以减少检测过程中双夹心结构的空间阻力，同时也增加了偶联的步骤，可能影响检测的重复性。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、定量准确的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡。
本发明的第二个目的是提供上述检测试剂卡的制备方法。
为此，本申请提供的第一个技术方案是这样的:
一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，包括壳体，所述的壳体内设有用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，所述包括用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫,所述结合垫上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY，所述的硝酸纤维膜设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被SAA单克隆抗体的检测T线。
进一步的，上述的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，还包括样品稀释液瓶。
进一步的，上述的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，所述的样品稀释液瓶中装有样品稀释液，所述样品稀释液为含1％S9、1％SDS、0.1％Triton X-100的0.1M pH7.8的Tris-盐酸缓冲液。
本申请提供的第二个技术方案是这样的：
一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫。
一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，
A)所述的样品垫的制备方法为：
1)配制样品垫处理液：含0.1％人血清白蛋白、0.5％牛IgG、2％聚乙二醇4000、0.3％Triton X-100、4％氯化钠和0.05％Prolin 300的0.2M pH9.0硼酸盐缓冲液；
2)将步骤1)中制备的缓冲液5.0μl/cm的浓度喷涂于玻璃纤维上；
B)所述的结合垫的制备方法为：
1)将用荧光微球标记的SAA单克隆抗体和用荧光微球标记的羊抗鸡IgY按照体积比20:1混合均匀，超声2s，间歇5s，重复3次；
2)按3.5μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上；
C)所述的反应膜的制备方法为：
1)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到1mg/mL，即为C质控线工作液；
2)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将SAA单克隆抗体稀释到1mg/mL，即为T检测线工作液；
3)取底板(1)粘贴硝酸纤维膜；
4)在硝酸纤维膜上划T线和C线，划线浓度均为1μL/cm；
5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜。
进一步的，上述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，荧光微球标记的SAA单克隆抗体的制备方法为：
1)稀释荧光微球：取一离心管，加入1ml标记缓冲液0.1M MES缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀；
2)微球的活化：在步骤1)离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B，旋转培养器上反应30min；
3)活化淬灭：将活化后的荧光微球20000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入500μl淬灭剂，超声2s；
4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入20-200μg SAA单克隆抗体，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；
5)封闭：加入2ml标记封闭液，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应30min；
6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2ml标记荧光微球稀释液，超声，工作2S，间歇5S，重复3次。
进一步的，上述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，荧光微球标记的羊抗鸡IgY的制备方法为：
1)稀释微球：取一离心管，加入1ml的标记缓冲液，取荧光微球1.0mg，涡旋混匀；
2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B，旋转培养器上反应30min；
3)活化淬灭：将活化后的荧光微球19000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入2ml淬灭剂，90W超声，工作2s，间歇5s，重复1次；
4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入100μg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；
5)封闭：加入500μl标记封闭液封闭30min；
6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2ml标记荧光微球稀释液，90W超声，工作2s，间歇5s，重复3次。
进一步的，上述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，所述的标记活化剂A为含50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺的0.05M的MES缓冲液；所述标记活化剂B为含50mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的0.05M MES缓冲液；所述的淬灭剂为含0.25％甲醇的0.1M的MES缓冲液；所述的标记封闭液为含0.1％人血清白蛋白的0.2M甘氨酸缓冲液。
进一步的，上述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，所述的微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球；密度：1.05g/cm3；折射率：1.59@589nm，25℃；直径300nm；功能基团：羧基；外观：白色。
进一步的，上述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，所述的标记荧光微球稀释液为含1％人血清白蛋白、3％蔗糖的pH9.00.1M的甘氨酸缓冲液。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点：
1、本发明操作步骤简单，对样品预处理方法进行优化，只需要用采集猫血清，稀释后加入到检测卡的加样孔中即可检测，检测速度快，10分钟出结果，结果即可定性观察又可定量测定，大大降低检测成本，减少工作量。
2、本申请提供的技术方案，通过对样品垫处理液和标记荧光微球稀释液的优化，相比传统工艺，灵敏度明显高，最低检测限(LOD)可达到1.55mg/L(原工艺3.26mg/L)，线性更好，剂量-反应曲线的决定系数由0.9953提升到0.9996；重复性好，低中高三个水平质控变异系数均低于10％(8.52％、7.95％和5.63％)。
3、本申请提供的技术方案对结合垫、硝酸纤维膜制备过程严格考究、优化，进一步提高了检测卡的精密度与可靠性。
4、本申请提供的样品垫处理液，与血浆高密度脂蛋白(HDL)解离更充分，试剂准确性提高，另外缓冲液中加入生物防腐剂Proclin 300，可以有效保持检测试剂的稳定性，并且防止减少了常规催化剂对检测结果的影响，确保检测结果的精确度，并保护检测者不受常规防腐剂例如叠氮钠等的危害。
附图说明
图1是本发明提供的检测试纸卡结构示意图；
图2是本发明提供的检测试纸条结构示意图；
图3是本发明提供的另一种检测试纸卡结构示意图；
图4是本发明提供的检测卡判定结果为阳性时示意图；
图5是本发明提供的检测卡判定结果为阴性示意图；
图6是本发明本发明提供的检测卡判定结果为无效时一种示意图；
图7是本发明本发明提供的检测卡判定结果为无效时另一种示意图；
图8是本申请提供的病毒抗原浓度检测的标准曲线图。
图9是对比例提供的病毒抗原浓度检测的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明。
实施例1
本发明提供的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，参阅图1至图2，包括壳体7，所述的壳体7内设有用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，所述用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡包括底板1，在底板1上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体31和荧光微球标记的羊抗鸡IgY32，所述的硝酸纤维膜4设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被SAA单克隆抗体的检测T线。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔72，与结合垫3相适配的观察窗口71，所述的壳体7上表面还设有防滑条73，方便试剂卡的取出与放入。
实施例2
本申请提供的另一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，参阅图1至图3，包括盒体9，所述的体9内设有样品稀释液瓶6，吸管8以及用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，所述的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡位于壳体7内，所述用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡包括底板1，在底板1上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体31和荧光微球标记的羊抗鸡IgY32，所述的硝酸纤维膜4设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被SAA单克隆抗体的检测T线。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔72，与结合垫3相适配的观察窗口71，所述的壳体7上表面还设有防滑条73，方便试剂卡的取出与放入。
更为具体的说，所述的样品稀释液瓶中样品稀释液为含1％S9、1％SDS、0.1％Triton X-100的0.1MpH7.8的Tris-盐酸缓冲液。
实施例3
实施例1或者2中提供的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，在温度(18～26)℃、湿度≤30％的环境下进行装配，在底板1上依次衔接有硝酸纤维膜4、吸水垫5、结合垫3和样品垫2；将粘贴好的大板切成4.0mm宽的试纸条，装入塑料卡壳7内，即SAA检测卡；将每一检测卡置于铝膜袋中，加入干燥剂1包，热合封口备用。
具体地说：
1.1结合垫的制备
1.1.1 SAA单克隆抗体的标记
1)稀释荧光微球：取一离心管，加入1ml标记缓冲液0.1M MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀；所述的微球采用含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球；密度：1.05g/cm3；折射率：1.59@589nm，25℃；直径300nm；功能基团：羧基；外观：白色。
2)微球的活化：在步骤1)离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B，旋转培养器上反应30min；
所述的标记活化剂A为含50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.05M的MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)；所述标记活化剂B为含50mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的0.05M MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)。
3)活化淬灭：将活化后的荧光微球20000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入5000μl淬灭剂，超声2s；所述的淬灭剂为含0.25％甲醇的0.1M的MES缓冲液；
4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入20-200μg SAA单克隆抗体，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；
5)封闭：加入2ml标记封闭液，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应30min；所述的标记封闭液为含0.1％人血清白蛋白的0.2M甘氨酸缓冲液
6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2ml标记荧光微球稀释液，超声，工作2S，间歇5S，重复3次。所述的荧光微球稀释液含1％人血清白蛋白、3％蔗糖的pH9.00.1M的甘氨酸缓冲液。
1.1.2质控C线抗体的标记
1)稀释微球：取一离心管，加入1ml的标记缓冲液0.1M MES缓冲液，取荧光微球1.0mg，涡旋混匀；所述的微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球；密度：1.05g/cm3；折射率：1.59@589nm，25℃；直径300nm；功能基团：羧基；外观：白色。
2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B，旋转培养器上反应30min；
所述的标记活化剂A为含50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.05M的MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)；所述标记活化剂B为含50mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的0.05M MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)。
3)活化淬灭：将活化后的荧光微球19000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入2ml淬灭剂，90W超声，工作2s，间歇5s，重复1次；所述的淬灭剂为含0.25％甲醇的0.1M的MES缓冲液；
4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入100μg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；
5)封闭：加入500μl标记封闭液，封闭30min；所述的标记封闭液为含0.1％人血清白蛋白的0.2M甘氨酸缓冲液；
6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2ml标记荧光微球稀释液，90W超声，工作2s，间歇5s，重复3次，所述的荧光微球稀释液含1％人血清白蛋白、3％蔗糖的pH9.00.1M的甘氨酸缓冲液。
1.1.3喷膜
1)将璃纤维裁切为(10±1)mm×(300±10)mm大小为结合垫；
2)将标记后的T、C线抗体按20:1(V：V)混合均匀，90W超声，工作2s，间歇5s，重复3次；
3)按3.5μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上；
4)喷完后，37℃干燥箱中干燥过夜(16～18)h。
1.2反应膜的制备
1)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)将鸡IgY稀释到1mg/mL，即为C线工作液。
2)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)将另一株SAA单克隆抗体稀释到1mg/mL，即为T线工作液。
3)取PVC底板，粘贴硝酸纤维膜。
4)在硝酸纤维膜上划T线和C线，划线浓度均为1μL/cm。
5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜(16～18)h。
1.3样品垫制备
1)配制样品垫处理液：含0.1％人血清白蛋白、0.5％牛IgG、2％聚乙二醇4000、0.3％Triton X-100、4％氯化钠和0.05％Prolin 300的0.2M pH9.0硼酸盐缓冲液。
2)以10μl/cm的浓度将缓冲液喷涂于玻璃纤维上。
对比试验
本对比实验提供的检测试剂卡结构与实施例1提供的检测试剂卡结构基本一致，其不同之处在于，在制备过程中将实施例3中的样品垫处理液即含0.5％Tween-20、0.1％牛血清白蛋白、0.5％Trtion-100的50mM pH 8.0 10mmol/LTris-HCl缓冲液；比如标记荧光微球稀释液为含2％BSA、0.1％PEG4000、5％海藻糖、5％蔗糖、0.05％叠氮钠的pH 8.010mmol/LTris-HCl缓冲液，叠氮钠0.5mg/mL，其它参数和条件均与实施例3一致。
检测方法
为了便于使用本申请提供的检测卡，下面给出本申请提供的检测卡提供两种检测方法。
方法一：采用紫外灯照射，结果参阅图4至图7：用手持式紫外线灯照射观察窗口，当质控线和检测线都有量荧光出现时(图4)，说明样品中SAA抗原为阳性；当只有质控线有荧光而检测线无荧光出现时(图5)，说明样品中SAA抗原为阴性；质控线未出现荧光(图6、图7)，则代表操作有误或检测结果无效，需重复试验。
方法二：本申请实施例3制备的免疫荧光检测仪检测结果：
1)收集猫血清；
2)取10μl加入含有1.0ml样品稀释液(含1％S9、1％SDS、0.1％Triton X-100的0.1MpH7.8的Tris-盐酸缓冲液)的样品管中，充分混匀；
3)取出检测卡，打开干式免疫荧光检测仪；
4)吸取稀释后的样本75μl，加入到检测卡的加样孔中，将检测卡放入到仪器的卡槽中，开始计时；
5)10min后，点击仪器上的“测试”按键，仪器将开始测试；
6)荧光强度与样品中的SAA浓度成正比，通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算，剂量反应曲线Log(Y)＝0.6706Log(X)–0.5366，R＝0.9996(R2＝0.9998)，参阅图3。
免疫荧光检测仪检测结果：
1、线性范围
1.1.1将SAA校准品用阴性血清分别稀释到0mg/L、5mg/L、8mg/L、12mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L和800mg/L；
1.1.2将以上各浓度样本分别取75μL，加入至制备好的猫SAA检测试剂中，每浓度重复测试2次；
1.1.3反应10min后，将试纸放入干式免疫荧光分析仪中，读取T/C值，通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算。
1.1.4测试结果显示：试剂在检测5～300mg/L的SAA线性拟合关系较好，r＞0.9900，当SAA浓度增加到400mg/L时，线性拟合r值小于0.9900，T/C增长减缓，SAA在400～500mg/L时T/C值平缓，SAA达到800mg/L时，T/C值反而降低。因此本检测的最大检测范围可以达到400mg/L。
2、最低检出限
将阴性血清，重复测试20次，计算T/C均值，将其代入剂量-反应曲线中，得出本方法的最低检出限为1.55mg/L，具体见表1和图8；
表1
用同样方法检测对比例1制备的检测卡，其检测具体见表2和图9
表2
3、精密度
将SAA校准品用阴性血清稀释至20mg/L、60mg/L、150mg/L，用本方法检测卡每浓度重复测试10次，计算测试浓度的变异系数。结果表31所示，由此可以看出，本试剂盒检测的变异系数均小于10％(三个浓度分别为8.52％、7.95％和5.63％)，因此本检测方法具有较高的精密度。
表3
浓度 变异系数(CV)
质控Ⅰ 20mg/L 8.52％
质控Ⅱ 60mg/L 7.95％
质控Ⅲ 150mg/L 5.63％
为了更好的说明本发明型的有益效果，下面给出采用本发明型提供的检测试剂与传统的免疫比浊法、免疫层析法在检测SAA时的检测性能能对比结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，包括壳体(7)，所述的壳体(9)内设有用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，所述包括用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡包括底板(1)，在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5),其特征在于，所述结合垫(3)上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体(31)和荧光微球标记的羊抗鸡IgY(32)，所述的硝酸纤维膜(4)设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被SAA单克隆抗体的检测T线。
2.根据权利要求1所述的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，其特征在于，还包括样品稀释液瓶(6)。
3.根据权利要求1所述的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡，其特征在于，所述的样品稀释液瓶中(6)装有样品稀释液，所述样品稀释液为含1％S9、1％SDS、0.1％Triton X-100的0.1M pH7.8的Tris-盐酸缓冲液。
4.制备权利要求1所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的方法，在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5)，其特征在于：
A)所述的样品垫的制备方法为：
1)配制样品垫处理液：含0.1％人血清白蛋白、0.5％牛IgG、2％聚乙二醇4000、0.3％Triton X-100、4％氯化钠和0.05％Prolin 300的0.2M pH9.0硼酸盐缓冲液；
2)将步骤1)中制备的缓冲液10μl/cm的浓度喷涂于玻璃纤维上；
B)所述的结合垫(3)的制备方法为：
1)将用荧光微球标记的SAA单克隆抗体和用荧光微球标记的羊抗鸡IgY按照体积比20:1混合均匀，超声2s，间歇5s，重复3次；
2)按3.5μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上；
C)所述的反应膜的制备方法为：
1)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到1mg/mL，即为C质控线工作液；
2)用含3％蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将SAA单克隆抗体稀释到1mg/mL，即为T检测线工作液；
3)取底板(1)粘贴硝酸纤维膜；
4)在硝酸纤维膜上划T线和C线，划线浓度均为1μL/cm；
5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，其特征在于，荧光微球标记的SAA单克隆抗体的制备方法为：
1)稀释荧光微球：取一离心管，加入1ml标记缓冲液0.1M MES缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀；
2)微球的活化：在步骤1)离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B，旋转培养器上反应30min；
3)活化淬灭：将活化后的荧光微球20000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入5000μl淬灭剂，超声2s；
4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入20-200μg SAA单克隆抗体，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；
5)封闭：加入2ml标记封闭液，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应30min；
6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2ml标记荧光微球稀释液，超声，工作2S，间歇5S，重复3次。
6.根据权利要求4所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，其特征在于，荧光微球标记的羊抗鸡IgY的制备方法为：
1)稀释微球：取一离心管，加入1ml的标记缓冲液，取荧光微球1.0mg，涡旋混匀；
2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B，旋转培养器上反应30min；
3)活化淬灭：将活化后的荧光微球19000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入2ml淬灭剂，90W超声，工作2s，间歇5s，重复1次；
4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入100μg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；
5)封闭：加入500μl标记封闭液，封闭30min；
6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2ml标记荧光微球稀释液，90W超声，工作2s，间歇5s，重复3次。
7.根据权利要求5或6所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述的标记活化剂A为含50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺的0.05M的MES缓冲液；所述标记活化剂B为含50mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的0.05M MES缓冲液。
8.根据权利要求5或6所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述的淬灭剂为含0.25％甲醇的0.1M的MES缓冲液；所述的标记封闭液为含0.1％人血清白蛋白的0.2M甘氨酸缓冲液；所述的标记荧光微球稀释液为含1％人血清白蛋白、3％蔗糖的pH9.00.1M的甘氨酸缓冲液。
9.根据权利要求5或者6所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述的微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球；密度：1.05g/cm3；折射率：1.59@589nm，25℃；直径300nm；功能基团：羧基；外观：白色。
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