CN112630429B - 一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括位于底板上的试剂条，该试剂条从加样端开始依次为样品垫、荧光微球结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述样品垫上包被有生物素化幽门螺杆菌抗原B；所述荧光微球结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗人IgG与时间分辨荧光微球标记的幽门螺杆菌抗原A；所述硝酸纤维素膜靠近荧光微球结合垫的一端设包被有亲和素的检测线；所述硝酸纤维素膜靠近吸水垫的一端设包被有羊抗鼠IgG的质控线。本发明完成检测信号的三重放大，提高了试剂的灵敏度。本发明实现了从尿液中对幽门杆菌抗体进行检测，具有取样方便、完全无创、检测灵敏度高的优点。

Description

一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物检测的技术领域，具体涉及一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
幽门螺旋杆菌感染的诊断方法分为侵入性和非侵入性两大类，侵入式检查是基于内窥镜和胃粘膜活检而完成，胃镜下取胃粘膜组织进行检查，检查方法有快速尿素酶实验，直接涂片、组织学检查、细菌培养和分子生物学检测（幽门螺旋杆菌分型和基因突变检测）；非侵入性幽门螺旋杆菌检测方法有尿素呼气实验、粪便幽门螺旋杆菌抗原检测和幽门螺旋杆菌血清学抗体试验。
HP（幽门螺杆菌）感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的病因，更是胃癌的主要致病因素。因此，HP是迄今为止引发胃部恶性肿瘤最重要风险因子，其中腺癌是最常见类型，约占90% 。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构 （WHO/IARC） 将HP定为Ⅰ类致癌原。而在我国，幽门螺杆菌的感染率约为60%。
目前市场上常见的是检测血清（或血浆）中的幽门螺旋杆菌抗体，但是由于检测样本的特殊性，导致这种检测手段必须在医院完成，并不适用于普遍性筛查。对于年纪较小的儿童而言，采血会产生一定的抗拒心理，加大采样的难度。
研究资料表明，在尿液样本中同样存在幽门螺杆菌抗体，且与血清检测相比具有高度的一致性。而检测尿液中的幽门螺旋杆菌抗体，与血液检测相比，其最大的优势在于检测样本的易获得性，且可以随时随地取样并进行检测，实现家庭自测，方便用于幽门螺杆菌的普遍性筛查。
尿液幽门螺杆菌抗体检测的难点，在于尿液中的抗体含量极低，约为血清中含量的百分之一左右。因此，对于尿液检测，对试剂提出了极高的反应灵敏度。目前对于幽门螺杆菌抗体的检测，只能用于血液样本的检测，而没有尿液检测的产品。
时间分辨荧光免疫分析法是目前与化学发光、电化学发光并驾齐驱的三种超敏免疫分析方法之一。其原理是采用较长荧光半衰期的稀土离子作标记物，由于这种标记物Stokes位移大(＞150nm)且荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，因此，测定时只要延缓测量时间，待本底物质的荧光充分衰减后再测定标记物的信号就可有效地消除各种非特异性荧光的干扰，获得很高的灵敏度。
时间分辨荧光微球(Time Resolved Fluorescent Microsphere)是采用时间分辨荧光染料与苯乙烯一起发生共聚而制备出来的一种特殊的功能微球，每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度。荧光微球能够用于免疫检测是因为其表面带有功能基团（羧基或羰基），能够和抗原（抗体）进行偶联形成化学键，从而得到复合物用于检测。和胶体金的结合机制（静电吸引）的产物相比，化学键的结合产物的稳定性高，而且能降低位阻效应。更为重要的是由于微球包埋的稀土离子已经过了螯合，无需解离增强步骤，因此从根本上解决了传统的DELFIA法（时间荧光分辨法）只能在液相中而不能在固相界面反应的问题，从而解决了将时间分辨荧光应用于免疫层析平台的技术瓶颈。
将时间分辨荧光微球代替代胶体金作为示踪物，在此基础上开发出相应的免疫层析产品，其灵敏度高于普通胶体金或有色乳胶免疫层析方法1-3个数量级。
时间分辨荧光法和胶体金法的区别：1、抗体的标记原理不同：胶体金是通过静电作用使带正电荷的胶体金分子和带负电荷的标记抗体相结合，荧光时间分辨是通过活化功能基团，用共价键的方式将活化基团和标记抗体相结合，相比较胶体金法而言，抗原与示踪物的结合更为牢固，检测灵敏度与特异性更好；2、检测结果的表达：胶体金法的检测结果是可视的，不需要借助仪器，时间分辨荧光法的结果虽然不能直接目测，但只需要使用一个简单的荧光设备（如便携式荧光验钞笔），即可肉眼观察到检测结果；目前幽门螺杆菌抗体的快速检测产品为ELISA或胶体金方法，而没有采用时间分辨荧光微球方法。目前的幽门螺杆菌抗体检测，多为间接法（即标记抗人IgG/IgM，包被幽门螺杆菌抗原）；双抗原夹心法（即标记幽门螺杆菌抗原A，包被幽门螺杆菌抗原B），而没有将此两种方法进行结合的检测产品。
目前发明专利申请说明书CN201910395518.2公开了一种基于磁分离与量子点标记幽门螺杆菌快速检测方法和试剂盒，虽然该专利申请也涉及时间分辨标记幽门螺杆菌快速检测方法，但该专利申请存在如下缺陷：
1.该专利申请检测的是幽门螺杆菌抗原，其只能检测现状感染，无法检测既往感染，存在一定的局限性。
2.该专利申请检测的物质为粪便样本，粪便样本的取样对于使用者的接受度较低，且粪便样本在检测时需要经过预处理。
3.该专利申请需要用到专用医疗器械设备，因此仅能在专业的医疗机构使用，不适用于大规模普查，也不适用于家庭检测，存在一定的局限性。
传统的金标渗滤法检测尿液幽门螺杆菌抗体，检测过程复杂，对于操作人员的操作要求较高，容易产生人工操作误差，影响准确率。
目前市场上经国家权威机构批准上市的幽门螺旋杆菌抗体检测试剂盒（包含国产与进口产品），没有以尿液为检测样本的产品。国内对于尿液检测幽门螺旋杆菌的产品开发目前仍处于空白阶段。如何提高检测灵敏度、简化检测流程，避免人工操作误差，提高检测准确率以满足尿液检测幽门螺杆菌抗体的要求成为了本领域的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其实现了从尿液中对幽门杆菌抗体进行检测，具有取样方便、完全无创、检测灵敏度高的优点。无需专用的设备，操作方法简单，能满足大规模的普查筛查的需要。为此，本发明还提供该尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，包括位于底板上的试剂条，该试剂条从加样端开始依次为样品垫、荧光微球结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述样品垫上包被有生物素化幽门螺杆菌抗原B；所述荧光微球结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗人IgG与时间分辨荧光微球标记的幽门螺杆菌抗原A；所述硝酸纤维素膜靠近荧光微球结合垫的一端设包被有亲和素的检测线；所述硝酸纤维素膜靠近吸水垫的一端设包被有羊抗鼠IgG的质控线。
作为本发明的优选方案，所述时间分辨荧光微球标记的抗人IgG与时间分辨荧光微球标记的幽门螺杆菌抗原A均包被在玻璃纤维膜上形成所述荧光微球结合垫。
作为本发明的优选方案，所述试剂盒包括盒座和盒盖，所述试剂条固定于所述盒座与所述盒盖之间；所述盒盖与所述盒座上设有相配合的卡扣连接部件。
作为本发明的优选方案，所述盒盖上设有加样孔和结果显示窗口；所述加样孔贯穿所述盒盖并对应于试剂条的样品垫区域；所述结果显示窗口贯穿所述盒盖并对应于试剂条的检测线和质控线区域。
此外，本发明还提供该尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒的制备方法，包含以下步骤：
步骤一，制备荧光微球结合垫：取标记好的抗人IgG时间分辨荧光微球100-200uL，标记好的幽门螺杆菌抗原A时间分辨荧光微球100-200uL混合均匀后喷在玻璃纤维膜上，干燥过夜；
步骤二，制备硝酸纤维素膜：在检测线包被1-2mg/mL的亲和素，在质控线包被1-2mg/mL的羊抗鼠IgG，干燥过夜；
步骤三，制备样品垫：在样品垫处理液中加入生物素化的幽门螺杆菌抗原B，使其终浓度为1-2mg/mL；
步骤四，制备试剂条：在底板的一面顺次相互搭接地粘附有样品垫、荧光微球结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫一端压住荧光微球结合垫一端0.5 ～ 1mm，荧光微球结合垫另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5 ～1mm，吸水垫的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5～ 1mm；
步骤五，将试纸条放入盒座和盒盖内，压实，盒座和盒盖卡扣连接，装入铝箔袋中封口。
作为本发明的优选方案，步骤一中，所述取标记好的抗人IgG荧光微球150uL；标记好的幽门螺杆菌抗原A荧光微球150uL混合均匀后，喷在玻璃纤维膜上，干燥过夜；步骤二中，在检测线包被1.5mg/mL的亲和素，在质控线包被1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，干燥过夜；步骤三中，在样品垫处理液中加入生物素化的幽门螺杆菌抗原B，终浓度为2mg/ml，干燥过夜。
作为本发明的优选方案，步骤一之前增加如下时间分辨荧光微球标记步骤：
第一步，筛选：用经临床确认的幽门螺旋杆菌的阴阳性样本进行测试，对比不同功能基团和粒径微球条件下的阴阳性检出率，筛选出含羧基的，粒径200nm的微球；
第二步，稀释：取时间分辨荧光微球，用超纯水稀释至微球悬浮液；
第三步，活化：取 30-50ul 的 50mg/ml NHS溶液加入第一步所得微球悬浮液中混匀，再将 30-50ul的 50mg/ml EDC溶液加入微球悬浮液中混匀，常温下反应15-45分钟；将反应后的微球悬浮液用超声波超声重悬；再离心，吸去上清，加入0.8-1.2ml超纯水，用超声波超声分散均匀；
第四步，标记：取 1ml 活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，边搅拌边滴加抗原抗体，标记抗原（抗体）的用量为0.01mg/ml -0.05mg/ml；
第五步，封闭：加入0.5% BSA室温放置 1小时，将封闭好的微球转速 8000-12000r/min离心10-20min后加入1ml保存液。
作为本发明的优选方案，第四步中，所述保存液为20nMTris-HCL+10%蔗糖+1%BSA。
作为本发明的优选方案，第三步中，所述标记用量为：抗人IgG与幽门螺杆菌抗原A均为 0.02mg/ml。
在本发明的另一方面，提供所述尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一，加样：将检测棒插入尿液中约1分钟，直至见到层析液体没过整个检测窗口区域；或直接用吸管吸取200uL样本加入加样口。
步骤二，结果判读：加样后10-15分钟内利用便携式荧光验钞笔对结果显示区进行照射，判读检测结果。
在本发明中，如使用胶体金法，检测灵敏度较低，对于尿液检测的检出率较低，而通过使用双抗原夹心法与间接法联合检测，同时搭配使用时间分辨荧光微球，通过这两种方法的放大，使产品灵敏度得到较大幅度提升。可以满足尿液检测的条件。
在发明的最初阶段，发明人从临床获取了50例确认幽门螺旋杆菌阳性的样本，分别对病人的血液和体液进行采样，借助ELISA的方法，对同源样本（来自同一个病例的两种样本）进行检测，发现血液样本的抗体浓度值要远远高于尿液样本，由此发现，开发尿液检测幽门螺旋杆菌抗体的试剂的难点在于试剂的灵敏度。
本发明为了提高检测试剂的灵敏度，将两种检测方法组合在一起，分别是间接法和双抗原夹心法，间接法是在时间分辨微球上标记了抗人IgG，这样就能捕获待测样本中所有的IgG类抗体，包被在硝酸纤维素膜上的幽门螺旋杆菌抗原特异性地识别幽门螺旋杆菌抗体（IgG），这种操作能提高检测试剂的灵敏度，但特异性较差；双抗原夹心法是指分别标记和包被针对同一个抗原决定簇的两个抗原重组抗原，产品开发阶段示意图如图4所示。
从开发阶段的示意图图4来看，最终选择在样品垫中加入时间分辨荧光微球标记的生物素化的重组幽门螺旋杆菌B是试剂灵敏度提升的关键，检测试剂必须标记三种微球才能达到灵敏度的要求，抗人IgG、生物素化的重组抗原和另外一个重组抗原，但是这三个微球混合在一起进行喷涂会产生反应，降低试剂的灵敏度，因此发明人创造性地将其中一个较稳定的微球放在样品垫的体系中，这样做既能使待测样本更好的和微球进行结合，又能提升试剂的灵敏度。
检测尿液中的幽门螺旋杆菌抗体最大 的优势 是它本身是无创的，待测样本的获取相比于血液样本要简单很多，不需要专业人士的操作。就使用而言，尿液检测试剂比较便于大规模人群的筛查，对于低幼龄的患者而言，这种取样方式更易获得。
临床用药对幽门螺旋杆菌进行清除治疗，血液样本中的抗体数值要过大概3个月才会下降，但是，尿液中的抗体数值的变化是很灵敏的，同时时间分辨荧光微球可以实现定量检测，因此，本发明可以对药物治疗效果进行监测，指导用药。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明采用免疫层析方法，检测卡含有时间分辨荧光微球标记鼠抗人IgG单抗与时间分辨荧光微球标记幽门螺杆菌重组抗原A，在硝酸纤维素膜检测线包被幽门螺杆菌抗原B，质控线包被羊抗鼠IgG。当进行检测时，若在尿液样本中存在幽门螺杆菌抗体，抗体的Fab片段先被样品垫中的生物素化的幽门螺杆菌重组抗原B特异性结合，然后再和荧光微球结合垫上的时间分辨荧光微球标记幽门螺杆菌重组抗原A结合，而抗体的Fc结晶片段被荧光微球标记鼠抗人IgG单抗捕获，而样本通过侧向层析的方式流动至硝酸纤维素膜的检测线区域，免疫复合物与亲和素结合，完成检测信号的三重放大，即在同一抗体上同时结合两种荧光微球标记蛋白从而形成放大效应，同时利用亲和素-生物素系统完成信号再次放大，提高了试剂的灵敏度。本发明实现了从尿液中对幽门杆菌抗体进行检测，具有取样方便、完全无创、检测灵敏度高的优点。具体如下：
1.本发明采用时间分辨荧光微球作为示踪物，与传统的胶体金相比，大大提高了检测灵敏度。
2.本发明将荧光时间分辨微球同时标记抗人IgG，幽门螺杆菌抗原A，而在硝酸纤维素膜上包被亲和素；所述样品垫上包被有生物素化幽门螺杆菌抗原B。由于两种荧光微球分别可以识别抗体的Fc片段与Fab片段，提高了抗体与荧光微球的连接效率，起到放大信号的作用，从而进一步提高了产品的检测灵敏度。本发明采用亲和素-生物素放大系统；抗体的Fab片段先被样品垫中的生物素化的幽门螺杆菌重组抗原B特异性结合，然后再和荧光微球结合垫上的时间分辨荧光微球标记幽门螺杆菌重组抗原A结合，而抗体的Fc结晶片段被荧光微球标记鼠抗人IgG单抗捕获，而样本通过侧向层析的方式流动至硝酸纤维素膜的检测线区域，免疫复合物与亲和素结合，完成检测信号的三重放大，即在同一抗体上同时结合两种荧光微球标记蛋白从而形成放大效应，同时利用亲和素-生物素系统完成信号再次放大，提高了试剂的灵敏度，达到了预料不到的技术效果。
3.现有技术对于幽门螺杆菌抗体的检测，只能用血液样本或粪便样本检测，而本发明使用尿液检测，接受度更高，取样更方便，完全无创。
4.本发明尿液样本无需预处理，可直接加样检测，与现有技术相比检测程序更加简单。
5.现有技术一般检测的是幽门螺杆菌抗原，用于检测现状感染，本发明检测的是幽门螺杆菌抗体，可同时检测现状感染与既往感染。
6.本发明无需专用的设备，可使用普通的便携式荧光验钞笔读数，操作方法与早孕试纸检测产品相似，完全可用于家庭检测，适用于大规模的普查筛查。
7.与传统的金标渗滤法检测尿液幽门螺杆菌抗体相比，本发明的试剂条直接插入尿杯检测即可，简化了检测流程，能有效避免人工操作误差，更方便准确。
附图说明
图1A为本发明试剂盒的结构主视图；图1B为本发明试剂盒中内含的试剂条的结构主视图。其中，附图标记说明如下：1. 加样孔（对应试纸条3样品垫区域）；2. 结果显示窗口（对应试纸条5检测线,7质控线区域）；3. 样品垫（包被生物素化的幽门螺杆菌抗原B）；4.荧光微球结合垫（包含标记了幽门螺杆菌抗原A和抗人IgG的时间分辨荧光微球）；5. 检测线（包被亲和素） ；6. 硝酸纤维素膜 ；7. 质控线（包被羊抗鼠IgG） ；8.吸水垫。
图2是本发明试剂盒的使用方法示意图。
图3是本发明试剂盒的结果判读示意图。
图4是本发明开发阶段的示意图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下各实施例中所用试剂未做特别说明的均为商品化试剂，幽门螺杆菌抗原HP33（包被抗原，即幽门螺杆菌抗原B）和幽门螺杆菌抗原HP39（标记抗原，即幽门螺杆菌抗原A），两个抗原均为幽门螺杆菌全片段融合抗原，包括了幽门螺杆菌vac（空泡毒素基因），ure（尿素酶相关基因），cag（细胞毒素相关基因）片段；区别在于两个抗原针对幽门螺旋杆菌不同的抗原决定簇，均购自杭州弘炬生物技术有限公司，抗人IgG购自杭州隆基生物技术有限公司；亲和素、羊抗鼠IgG购自美国Arista公司。
实施例1 本发明试剂盒的制备及使用
a.时间分辨荧光微球标记：取 100ul时间分辨荧光微球，用超纯水稀释至1mL。取40ul 的 50mg/ml NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）溶液加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul 的 50mg/ml EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液加入微球悬浮液中混匀，常温下反应 0.5 小时。将反应后的微球悬浮液用超声波超声重悬，然后将微球悬浮液离心，吸去上清，加入 1ml 超纯水，然后用超声波超声分散均匀，完成荧光微球的活化。取 1ml 活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗原抗体，标记用量0.01mg-0.05mg/ml，优选标记量：抗人IgG与幽门螺杆菌抗原A均为 0.02mg/ml。加入抗原抗体后，反应 1-2min 后，再超声 30 秒左右，继续反应1小时。加入0.5% BSA（牛血清白蛋白）进行封闭 1小时。将封闭好的微球进行离心，速度为 10000r/min,15min。将1mL保存液（20mM Tris-HCL+10%蔗糖+1% BSA）加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用。
由于微球表面的功能基团的种类和数量是可以通过制备工艺进行调整，这样就可以根据偶联物的分子结构来定制，最大程度的提高偶联效率，增加复合物的浓度，提升后续检测试剂的性能。本发明中的荧光微球是筛选了多种微球后得到最优选择，微球的选择主要从微球的粒径、功能基团及含量进行选择。本实验中，根据需要偶联的物质的分子结构，选择了含羧基的荧光微球，根据分子量，选择了粒径200nm的微球。微球的选择实验中，用20份经临床确认的幽门螺旋杆菌的阴阳性样本进行测试，对比不同实验条件下的阴阳性检出率，筛选出优选项。结果如下表1：
Figure 550152DEST_PATH_IMAGE001
实验结果：优选选项为含羧基的，粒径200nm的微球。
微球标记过程优化：微球标记的效率对试剂的性能有决定性的影响，标记效率越高，试剂的灵敏度越高，同时还要注意标记过程的缓冲体系不能对抗原（抗体）的活性部位造成影响，最终标记物的保存液要能提高标记物的稳定性，改善检测试剂的稳定性。
活化剂标记比例的选择实验：将NHS、EDC分别配成50mg/ml的溶液，在标记过程中对两者的标记比例进行实验，结果如下表2：
Figure 500922DEST_PATH_IMAGE002
实验结果：从上表2的数据来看，标记中单独用NHS或者EDC，都不能达到最优效果，必须将两者进行搭配，加入比例1:1时，达到的结果最佳，但是NHS和EDC的量过多的话，最终检测试剂的本底偏高。用上面实验中得到的标记物测试不同浓度的幽门螺旋杆菌，结果如下表3：
Figure 822182DEST_PATH_IMAGE003
从上表3的数据来看，EDC:NHS=1:1时，试剂的检测本底（0值）明显优于EDC:NHS=2:2，且阳性样本（10-8、10-7、10-6、10-5、10-4）的信号值并没有明显差异，这说明活化剂的使用量也不能过高，加入量过多也不会改善标记效率，提高信号值。
b.如图1A和图1B所示，制备试剂条：
1.取标记好的抗人IgG荧光微球100-200uL（优选用量150uL），标记好的幽门螺杆菌抗原A荧光微球100-200uL（优选用量150uL）均匀喷在玻璃纤维膜上，干燥过夜，即为荧光微球结合垫4。
2.在检测线5包被1-2mg/mL（优选用量1.5mg/mL）的亲和素，在质控线7包被1-2mg/mL（优选浓度1.5mg/mL）的羊抗鼠IgG，干燥过夜，即为硝酸纤维素膜。
3. 在样品垫上包被1-2mg/mL的生物素化的幽门螺杆菌抗原B，干燥过夜，即为样品垫。
4.在底板的一面顺次相互搭接地粘附有样品垫3、荧光微球结合垫4、硝酸纤维素膜6和吸水垫8，确保样品垫3一端压住荧光微球结合垫4一端0.5 ～ 1mm，荧光微球结合垫4另一端压住硝酸纤维素膜6一端0.5 ～1mm，吸水垫8的一端压住硝酸纤维素膜6另一端0.5～ 1mm，得试剂条；
5.将试剂条放入塑料盒座和盒盖内，压实，盒座和盒盖卡扣连接，装入铝箔袋中封口，即得本发明试剂盒。所述试剂盒包括盒座和盒盖，所述试剂条固定于所述盒座与所述盒盖之间；所述盒盖与所述盒座上设有相配合的卡扣连接部件；所述盒盖上设有加样孔1和结果显示窗口2；所述加样孔1贯穿所述盒盖并对应于试剂条的样品垫3区域；所述结果显示窗口2贯穿所述盒盖并对应于试剂条的检测线5和质控线7区域。
实验结果：标记物和包被抗体的使用浓度是通过棋盘滴定的方法确认的，具体如下表4：
Figure 107670DEST_PATH_IMAGE004
从上述表4的数据来看，当标记物的浓度为150ul，包被抗体的浓度为1.5mg/ml时，试剂有最好的性能。
生物素-亲和素放大系统；从分子结构可知，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，利用这个特性，实验中将幽门螺杆菌抗原B偶联生物素，然后在硝酸纤维素膜上包被了亲和素，这样就可以通过亲和素-生物素系统对检测信号进行放大,通过调整样品垫处理液中的生物素化的幽门螺杆菌抗原B的浓度来实现信号放大的最大效果。
Figure 844682DEST_PATH_IMAGE005
从上表5的结果可以看出，当样品垫处理液中生物素化的幽门螺杆菌抗原B的浓度为2mg/ml时，放大检测信号的效果最大。
c.检测：如图2所示，在尿杯中留取尿液，将本发明试剂盒（检测棒）插入尿液中约1分钟，或直接用吸管吸取200uL样本加入加样孔1，尿液样本通过加样孔1被试剂条的样品垫3吸收，并开始进行层析，直至见到层析液体没过整个结果显示窗口2区域。加样后10-15分钟内用便携式荧光验钞笔对结果显示窗口2进行照射，观察判读检测结果， 15分钟后结果的任何变化都可忽略。结果判读如图3所示，阳性：在检测线（下线）和质控线（上线）位置上各出现一条红色条带。阴性：仅质控线（上线）位置上出现一条红色条带。无效：在检测线（下线）和质控线（上线）位置上均未出现红色条带，或者只有检测线（下线）出现一条红色条带而质控线（上线）未出现条带。在荧光微球结合垫上，包被有时间分辨荧光微球标记的抗人IgG与时间分辨标记的幽门螺杆菌抗原A，当尿液样本中含有幽门螺杆菌抗体时，抗体的Fab片段先被样品垫中的生物素化的幽门螺杆菌重组抗原B特异性结合，然后再和荧光微球结合垫上的时间分辨荧光微球标记幽门螺杆菌重组抗原A结合，抗人IgG与尿液中的幽门螺杆菌抗体Fc片段结合，即在同一抗体上同时结合两种荧光微球标记蛋白从而形成放大效应，生物素化幽门螺杆菌抗原B与幽门螺杆菌抗体Fab片段结合，此复合物再和亲和素结合，检测信号再次放大，此复合物通过层析作用在硝酸纤维素膜迁移，并在检测线形成“IgG荧光微球-幽门螺杆菌抗体—幽门螺杆菌重组抗原A荧光微球—生物素化幽门螺杆菌重组抗原B-亲和素”复合物而凝聚显色，表明是阳性结果；若样本中无幽门螺杆菌抗体，则形成的复合物不足以凝聚显色，表明是阴性结果。
实施例2：灵敏度，特异性验证对比实验：
样本：取同一人的血液与尿液样本，共收集50例样本，其中包括幽门螺杆菌阳性病例28例，阴性病例22例。用下述几种不同检测方法对血液样本与尿液样本进行同步对比试验。
对照组1：双抗原夹心胶体金法：金标垫包含幽门螺杆菌抗原A标记的胶体金，硝酸纤维素膜上包被幽门螺杆菌抗原B
对照组2：双抗原夹心法与间接法联合胶体金法：金标垫包含幽门螺杆菌抗原A标记的胶体金与抗人IgG标记的胶体金混合物，硝酸纤维素膜上包被幽门螺杆菌抗原B
对照组3：双抗原夹心法与间接法联合荧光微球法：荧光垫包含幽门螺杆菌抗原A标记的实际那分辨荧光微球与抗人IgG标记的时间分辨荧光微球混合物，硝酸纤维素膜上包被幽门螺杆菌抗原B。
本发明：双抗原夹心法与间接法联合荧光微球法：样品垫上包被生物素化幽门螺杆菌抗原B，荧光垫包含时间分辨荧光微球标记的幽门螺杆菌抗原A与时间分辨荧光微球标记的抗人IgG标记的混合物，硝酸纤维素膜上包被亲和素。
Figure 368067DEST_PATH_IMAGE006
根据上述表6结果显示，使用传统的双抗原夹心胶体金法，对于血液检测与已确诊结果具有很高的符合率，但是对于尿液检测，灵敏度太低，导致60%以上的阳性样本漏检。而采用双抗原夹心法与间接法联合胶体金法，检出率有了大幅度提高，但是仍然有1/4样本漏检。进一步采用本发明的生物素-亲和素双抗原夹心法与间接法联合荧光微球法进行检测后，产品的检测灵敏度已与确诊结果高度符合，达到96%以上，而特异性方面，也未出现假阳的情况。可见，本发明试剂盒与对照组1、对照组2和对照组3相比，检测灵敏度达到了预料不到的效果，本发明试剂盒具备创造性。
为进一步验证产品特异性，我们用本发明试剂盒双抗原夹心法与间接法联合荧光微球法对一些常见的内外源干扰物质进行检测，结果如下：
1、外源性干扰：
将下述培养菌体悬浮液添加到阴性样本中，用本发明试剂盒进行检测，判定这些菌是否会对试剂造成交叉反应，结果见表7：
Figure 811293DEST_PATH_IMAGE007
从上表7的结果来看，本试剂盒和同类菌没有交叉反应，试剂盒的特异性良好。
2、内源性干扰
在尿液中检测常见干扰和药物残留，观察本试剂是否有交叉反应，结果见表8：
Figure 52918DEST_PATH_IMAGE008
从上表8的结果来看，本试剂盒和常见的内源性干扰物质没有交叉反应，试剂盒的特异性良好。
综上所述，上述实施例仅为本发明的较佳实施例之一而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，包括位于底板上的试剂条，该试剂条从加样端开始依次为样品垫、荧光微球结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述样品垫上包被有生物素化幽门螺杆菌抗原HP33；所述荧光微球结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗人IgG与时间分辨荧光微球标记的幽门螺杆菌抗原HP39，所述标记采用NHS和EDC标记；所述硝酸纤维素膜靠近荧光微球结合垫的一端设包被有亲和素的检测线；所述硝酸纤维素膜靠近吸水垫的一端设包被有羊抗鼠IgG的质控线；所述荧光微球为含羧基、粒径200nm的荧光微球。
2.如权利要求1所述的一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述时间分辨荧光微球标记的抗人IgG与时间分辨荧光微球标记的幽门螺杆菌抗原HP39均包被在玻璃纤维膜上形成所述荧光微球结合垫。
3.如权利要求1或2所述的一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒座和盒盖，所述试剂条固定于所述盒座与所述盒盖之间；所述盒盖与所述盒座上设有相配合的卡扣连接部件。
4.如权利要求3所述的一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述盒盖上设有加样孔和结果显示窗口；所述加样孔贯穿所述盒盖并对应于试剂条的样品垫区域；所述结果显示窗口贯穿所述盒盖并对应于试剂条的检测线和质控线区域。
5.如权利要求1所述的一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述NHS和EDC的浓度均为50mg/ml，所述NHS和EDC的比例为1：1。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤一，制备荧光微球结合垫：取标记好的抗人IgG时间分辨荧光微球100-200uL，标记好的幽门螺杆菌抗原HP39时间分辨荧光微球100-200uL混合均匀喷在玻璃纤维膜上，干燥过夜；
步骤二，制备硝酸纤维素膜：在检测线包被1-2mg/mL的亲和素，在质控线包被1-2mg/mL的羊抗鼠IgG，干燥过夜；
步骤三，制备样品垫：将生物素化的幽门螺杆菌抗原HP33加入至样品垫处理液中，混合均匀后，涂布在玻璃纤维表面，干燥过夜；
步骤四，制备试剂条：在底板的一面顺次相互搭接地粘附有样品垫、荧光微球结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫一端压住荧光微球结合垫一端0.5 ～ 1mm，荧光微球结合垫另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5 ～1mm，吸水垫的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5～ 1mm；
步骤五，将试纸条放入盒座和盒盖内，压实，盒座和盒盖卡扣连接，装入铝箔袋中封口。
7.根据权利要求6所述的一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述取标记好的抗人IgG荧光微球150uL；标记好的幽门螺杆菌抗原HP39荧光微球150uL混合均匀后，喷在玻璃纤维膜上，干燥过夜；步骤二中，在检测线包被1.5mg/mL的亲和素，在质控线包被1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，干燥过夜；步骤三中，在样品垫处理液中加入生物素化的幽门螺杆菌抗原HP33，终浓度为2mg/ml，干燥过夜。
8.根据权利要求6或7所述的一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤一之前增加如下时间分辨荧光微球标记步骤：
第一步，筛选：用经临床确认的幽门螺旋杆菌的阴阳性样本进行测试，对比不同功能基团和粒径微球条件下的阴阳性检出率，筛选出含羧基的，粒径200nm的微球；
第二步，稀释：取时间分辨荧光微球，用超纯水稀释至微球悬浮液；
第三步，活化：取 30-50ul 的 50mg/ml NHS溶液加入第一步所得微球悬浮液中混匀，再将 30-50ul的 50mg/ml EDC溶液加入微球悬浮液中混匀，常温下反应15-45分钟，所述NHS溶液和所述EDC溶液的比例为1：1；将反应后的微球悬浮液用超声波超声重悬；再离心，吸去上清，加入0.8-1.2ml超纯水，用超声波超声分散均匀；
第四步，标记：取 1ml 活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，边搅拌边滴加抗原抗体，标记抗原抗体的用量为0.01mg/ml -0.05mg/ml；
第五步，封闭：加入0.5% BSA室温放置 1小时，将封闭好的微球转速 8000-12000r/min离心10-20min后加入1ml保存液。
9.根据权利要求8所述的一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，第四步中，所述保存液为20nMTris-HCL+10%蔗糖+1%BSA。
10.根据权利要求8所述的一种尿液幽门螺杆菌抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，第三步中，所述标记用量为：抗人IgG与幽门螺杆菌抗原HP39均为 0.02mg/ml。
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