CN108918882B

CN108918882B - 一种基于量子点的超敏c反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法

Info

Publication number: CN108918882B
Application number: CN201810472404.9A
Authority: CN
Inventors: 李嫚莉; 李超; 胡延祯
Original assignee: XI'AN JIAOTONG UNIVERSITY SUZHOU ACADEMY
Current assignee: XI'AN JIAOTONG UNIVERSITY SUZHOU ACADEMY
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2038-05-17
Also published as: CN108918882A

Abstract

本发明公开了一种基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，包括：1）使羧基修饰的量子点与激活剂反应，生成活化量子点；2）然后使制备的活化量子点与第一抗体反应，制成量子点‑抗体荧光探针；3）使用处理液分别处理样品垫和结合垫，将制备的量子点‑抗体荧光探针涂覆于处理后的结合垫上表面；4）分别采用第二抗体和第三抗体在硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线，使用封闭液封闭包被后的硝酸纤维素膜；5）将处理后的样品垫、结合垫，以及处理后的硝酸纤维素膜、吸水垫和载体依次层叠，即可；本发明的制备方法，其成本低廉，制备的免疫层析试纸条具有极高的灵敏度，能够实现全浓度超敏C反应蛋白的免疫层析定量检测。

Description

一种基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法

技术领域

本发明属于检测探针制备领域，具体涉及一种基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法。

背景技术

超敏C反应蛋白(High-sersensity C-reactive Protein,Hs-CRP)与普通CRP是同一种蛋白，只是由于其浓度较低且测定方法更灵敏而得名。Hs-CRP已被证实是由慢性炎症引发心血管疾病的独立危险因素，检测其浓度对心血管疾病的干预及预后起到重要作用而被临床检测所重视。由于Hs-CRP与心血管疾病、糖尿病等高度相关，近年来研究者集中于Hs-CRP(0.1-3μg/ml)的检测研究，Hs-CRP的浓度小于1mg/L、1-3mg/L、大于3mg/L分别预示了低、中、高心血管疾病风险。而临床常规方法测定CRP时，检测的线性范围一般为3～200mg/L，检测方法缺乏足够的灵敏性，无法测出浓度更低的Hs-CRP。目前普通的特异性试剂盒的检测需要高素质的专业操作人员、昂贵的仪器、较长的操作时间和严格的操作流程，但在紧急情况下或远程检测的过程中缺乏专业医疗人员和资源的情况下，这些检测要求并不能达到，因此如若能够提供一种高灵敏度的免疫层析(免疫层析技术(Immunochromatography Assay，ICA)是POCT的一种检测技术，是在酶联免疫吸附方法(ELISA)原理上衍生出的一种膜检测技术，结合了免疫技术和色谱层析技术，该技术采用示踪物对抗体(或抗原)进行标记，以硝酸纤维素膜作为反应区，通过检测相应的示踪物信号，从而对待检物进行定性或定量分析，实现特异性的免疫诊断)诊断手段，实现Hs-CRP免疫层析定量检测则显得尤为重要。

量子点(Quantum dots,QDs)是主要由ⅡB族～ⅥA族元素(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或ⅢA族～ⅤA族元素(如InP、InAs等)构成的半导体纳米颗粒，量子点独特的性质基于它自身颗粒的尺寸达到纳米量级时，尺寸限域将引起尺寸效应、量子限域效应、宏观量子隧道效应和表面效应，导致价带能级、电子跃迁等方面的改变，从而产生了独特的荧光特性。同时量子点还具有斯托克斯位移大、激发光谱宽、发射光谱尖锐而对称、量子产率高、耐光漂白、荧光寿命长等，因此可扩展应用于生物标记。目前量子点作为新型的纳米材料，其生物荧光标记的制备方法分为非共价连接和共价连接。其中非共价连接主要有静电吸附、特异性生物靶标连接、链霉素-生物素连接等；共价连接包括量子点表面功能基团羧基、氨基、羟基等，在不同激活剂的活化下分别与生物分子的氨基、巯基等共价连接。其中量子点表面羧基与生物分子氨基共价连接(即量子点-抗体荧光探针)应用最为广泛。

而由于适用于免疫层析诊断的量子点生物标记材料需要满足产率高、荧光强、稳定性好且成本低等特点，同时目前现有技术中制备量子点-抗体荧光探针的方法不一，导致了偶联效率差别较大，原料利用率低，制备成本显著增加，纯化效果差，严重影响了其应用，例如量子点-抗体荧光探针主要的制备方法：先与激活剂反应，再与特定抗体结合进而制备得到量子点-抗体荧光探针；但实际情况而言按照目前制备方法制备量子点-抗体荧光探针，其偶联率仍然普遍偏低，较为浪费原料，不利于大规模的生产，进而限制了其在生物荧光标记中的应用。

同时，目前市面上还没有一种成本低廉、操作简单、灵敏度高且尤其适用于超敏C反应蛋白的免疫层析试纸条的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其成本低廉，制备的免疫层析试纸条具有极高的灵敏度，能够实现超敏C反应蛋白的免疫层析定量检测。

为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)使羧基修饰的量子点与激活剂在0-10℃下、在pH值为5-6的缓冲液中反应，生成活化量子点；其中，所述激活剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物；

2)然后使制备的所述活化量子点与第一抗体在0-10℃下、在pH值为6-9的缓冲液中反应，制成量子点-抗体荧光探针；

3)使用处理液分别处理样品垫和结合垫，将步骤2)制备的所述量子点-抗体荧光探针涂覆于处理后的所述结合垫上表面；

4)分别采用第二抗体和第三抗体在硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线，且使用封闭液封闭包被后的所述硝酸纤维素膜；

5)将步骤3)处理后的所述样品垫、所述结合垫，以及步骤4)处理后的所述硝酸纤维素膜、吸水垫和载体依次层叠，即制成所述基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条。

本发明中，步骤3)和步骤4)不分先后。

根据本发明的一些具体方面，所述载体可以为胶板。

根据本发明的一些优选方面，步骤1)中，所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或其硫代物(sulfo—NHS)、所述羧基修饰的量子点的投料摩尔比为1000～10000︰1000～10000︰1。

根据本发明的一些优选方面，步骤1)中，控制所述反应在0-5℃下进行。

根据本发明的一些优选方面，步骤2)中，控制所述反应在0-5℃下进行。

根据本发明的一些优选方面，步骤2)中，所述活化量子点与所述第一抗体的投料摩尔比为1︰5-15。

根据本发明的一些优选方面，所述制备方法中，分别控制所述步骤1)和所述步骤2)的反应在超声条件下进行。

根据本发明的一些优选方面，所述步骤1)和所述步骤2)中pH值分别通过硼酸-硼砂缓冲溶液来调节。实际过程中，可根据需要调节的pH值灵活调整硼酸与硼砂的加入量，进而可以控制调节酸碱性等。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述第一抗体为小鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体(anti-CRP-C6)。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述第二抗体为小鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体(anti-CRP-C2)。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述第三抗体为羊抗鼠多克隆抗体IgG。

根据本发明的一些具体且优选的方面，所述步骤2)的具体实施方式为：将步骤1)反应后得到的含有活化量子点的反应液置于超滤管中，在0-10℃下离心，然后加入硼酸-硼砂缓冲溶液调节pH值，再次离心，制得pH值为6-9的含有活化量子点的粗提溶液，然后将第一抗体加入所述粗提溶液中，在0-10℃下反应，制成所述量子点-抗体荧光探针。

根据本发明的一些优选方面，步骤3)中，以质量分数计，所述处理液包括1-5％的牛血清白蛋白(BSA)、1-3％的吐温20、1-5％的海藻糖和1-3％的聚乙二醇(PEG)20000。根据本发明的一个具体方面，所述处理液为含有上述各组分且pH值为7-9的硼酸-硼砂缓冲溶液。可进一步增强样品垫和结合垫的亲水性，较好地保护蛋白活性，提高结合垫上荧光探针的释放。

根据本发明的一些优选方面，步骤4)中，所述封闭液为含有质量分数为0.5-2％的牛血清白蛋白、pH值为7-9的硼酸-硼砂缓冲溶液。

根据本发明的一些优选方面，步骤4)中，所述检测线为0.5-2mg/ml的第二抗体。

根据本发明的一些优选方面，所述质控线为0.5-1mg/ml的第三抗体。

根据本发明的一些优选方面，所述检测线和所述质控线的划线速度分别为0.5-1μl/cm。

根据本发明的一些优选方面，步骤4)中，所述硝酸纤维素膜使用所述封闭液封闭后还包括清洗步骤，所述清洗步骤采用pH值为7-8且由三(羟基甲基)氨基甲烷、氯化钠和吐温20构成的清洗溶液。根据本发明的一个具体方面，所述清洗水溶液中含有10mmol/L三(羟基甲基)氨基甲烷、150mmol/L氯化钠以及0.05％(V/V)吐温20。

由于以上技术方案的采用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明制备基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的方法简单，成本低廉，制备的免疫层析试纸条具有极高的灵敏度，能够实现超敏C反应蛋白的免疫层析定量检测，而且其检测范围完全包括了临床上超敏C反应蛋白的检测浓度范围，测得相关系数大于0.99，实现了超敏C反应蛋白的准确定量检测，进而可实现在紧急情况下或远程检测的过程中缺乏专业医疗人员和资源的情况下的准确检测，有利于其在医疗临床检测中的大规模应用。

附图说明

图1为量子点对照与实施例1中的量子点-抗体荧光探针的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为量子点对照与实施例1中的量子点-抗体荧光探针斑点杂交验证图；

图3为量子点对照与实施例1中的量子点-抗体荧光探针荧光光谱图。

图4为实施例4中制备的量子点免疫层析试纸条检测不同浓度CRP结果现象图；

图5为实施例4中制备的量子点免疫层析试纸条不同浓度CRP与T/C的标准曲线关系图。

具体实施方式

目前，现有技术中，还没有一种能够覆盖超敏C反应蛋白不同浓度范围的免疫层析检测手段，致使在特殊情况下(例如医疗卫生条件较差或者没有专业人员在场)无法准确而定量的检测超敏C反应蛋白的浓度，从而无法对相关疾病的具体判断提供有力的数据支撑；而目前基于量子点特殊的荧光特性等优异性能，其被应用于生物荧光标记的实例越来越多，其中尤以量子点表面羧基与生物分子氨基共价连接应用(量子点-抗体荧光探针)最为广泛，但以目前具体制备条件下制成的量子点-抗体荧光探针，其不仅偶联率较低，而且存在荧光淬灭，或分散不均匀进而易粘附在反应容器的器壁上的问题，从而会导致失活失效，因此，不利于节约成本以及大规模生产，而由于适用于免疫层析诊断的量子点生物标记材料需要满足产率高、荧光强、稳定性好且成本低等特点，因此，现有技术的缺陷大大地降低了免疫层析技术超敏C反应蛋白免疫层析检测中的应用。

经研究发现，当控制活化的反应在低温尤其是0-10℃下、pH值为5-6，以及控制与抗体的结合反应同样在0-10℃下时进行反应时，可以极大地提升偶联率，并且可避免荧光淬灭、生成物粘附器壁等现象的发生，从而可最大化地利用原料，降低生产成本，有利于其在免疫层析中的应用；同时结合在硝酸纤维素膜的处理过程中使用封闭液进行封闭，可大大地降低多余位点的非特异性吸附，从而可提高试纸条的灵敏度并增强质控线以及检测线的荧光强度，进而可提升在超敏C反应蛋白不同浓度下的免疫层析定量检测的准确率。因此，通过上述手段的结合实现了成本低廉、灵敏度高等优点且覆盖超敏C反应蛋白不同浓度范围的免疫层析检测，进而为医疗临床检测心血管疾病、糖尿病等相关疾病并实现干预和/或预干预提供了有力支撑。

基于此，本申请提供了一种基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：1)使羧基修饰的量子点与激活剂在0-10℃下、在pH值为5-6的缓冲液中反应，生成活化量子点；其中，所述激活剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物；2)然后使制备的所述活化量子点与第一抗体在0-10℃下、在pH值为6-9的缓冲液中反应，制成量子点-抗体荧光探针；上述方法中通过使量子点与激活剂，以及活化后的量子点与抗体在特定的反应温度以及pH值环境下反应，避免了现有技术中在制备过程中发生的量子点荧光性淬灭，和/或，生成的量子点-抗体荧光探针发生攒聚而分散不均匀进而易粘附在反应容器的器壁上，从而导致失活失效，而且制备的量子点-抗体荧光探针则具有较强的荧光强度、抗体特异性的生物活性、分子量增加、表面电位降低，而且偶联率得到了极大地提升，有利于大规模生产。

综上，本发明实现了制备方法简单，成本低廉，制备的免疫层析试纸条具有极高的灵敏度，能够实现超敏C反应蛋白的免疫层析定量检测，而且其检测范围完全包括了超敏C反应蛋白的浓度范围，测得相关系数大于0.99，保证了超敏C反应蛋白的准确定量检测，进而可实现在紧急情况下或远程检测的过程中缺乏专业医疗人员和资源的情况下的准确检测，有利于其在医疗临床检测中的大规模应用。

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明；应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

下述中，如无特殊说明，所有的原料均来自于商购或者通过本领域的常规方法制备而得。下述中，如无特殊说明，“％”均为质量百分含量。

实施例1量子点-抗体荧光探针的制备

将5μL量子点(发射峰为625nm±5nm，浓度为8μM，购自于武汉珈源量子点技术开发有限责任公司)溶于500μL，pH＝5.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液中，涡旋混匀30s。现配制0.01M 1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和0.01M N-羟基硫代琥珀酰亚胺(suLfo-NHS)，溶剂为pH＝5.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液。在量子点溶液中加入8μL，0.01M EDC，涡旋混匀，5min后加入40μL，0.01M suLfo-NHS。在1±1℃下超声30min。活化完成后，取出活化反应液，置于超滤管(100kd)中，在低温离心机中离心，转速3500rpm，5min，完成后，在反应液中加入1ml，pH＝8.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液，重复离心一次，取出反应液。向反应液中加入7.2μL小鼠CRP单克隆抗体(anti-CRP-C6，5.8mg/ml)，涡旋混匀，在1±1℃下超声3h，即得量子点-抗体荧光探针。

纯化量子点-小鼠C反应蛋白单克隆抗体：将量子点-抗体荧光探针置于透析袋(MwCO：300000)中，使用透析夹夹紧，放入烧杯中，在外部加入pH＝8.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液，加入转子，将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌，每3h更换一次缓冲液，重复3次。收集内液与外液。

计算偶联率：使用超滤管(100kd)浓缩内外液至500μL左右，用BCA法测定内外液蛋白含量，

式中：R——偶联率/％；C内——内液蛋白浓度/mg·ml^-1；V内——内液体积/ml；C外——外液蛋白浓度/mg·ml^-1；V外——外液体积/ml。测得具体偶联率为85.14％。

同时对本实施例制备的量子点-抗体荧光探针作了琼脂糖凝胶电泳图、斑点杂交验证图、荧光光谱图，并分别与量子点的相对照，具体如图1-3所示，说明按照本发明的制备方法制得的量子点-抗体荧光探针，其性能符合标准。

实施例2量子点-抗体荧光探针的制备

将5μL量子点(发射峰为625nm±5nm，浓度为8μM，购自于武汉珈源量子点技术开发有限责任公司)溶于500μL，pH＝5.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液中，涡旋混匀30s。现配制0.01M 1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和0.01M N-羟基硫代琥珀酰亚胺(suLfo-NHS)，溶剂为pH＝5.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液。在量子点溶液中加入16μL，0.01M EDC，涡旋混匀，5min后加入40μL，0.01M suLfo-NHS，涡旋混匀。在1±0.5℃下超声30min。活化完成后，取出活化反应液，置于超滤管(100kd)中，在低温离心机中离心，转速3500rpm，5min，完成后，在反应液中加入1ml，pH＝8.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液，重复离心一次，取出反应液。向反应液中加入7.2μL小鼠CRP单克隆抗体(anti-CRP-C6，5.8mg/ml)，涡旋混匀，在2±0.5℃下超声3h，即得量子点-抗体荧光探针。

偶联率测试方法同实施例1，测得具体偶联率为88.48％。

实施例3量子点-抗体荧光探针的制备

将5μL量子点(发射峰为625nm±5nm，浓度为8μM，购自于武汉珈源量子点技术开发有限责任公司)溶于500μL，pH＝5.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液中，涡旋混匀30s。现配制0.01M 1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和0.01M N-羟基硫代琥珀酰亚胺(suLfo-NHS)，溶剂为pH＝5.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液。在量子点溶液中加入16μL，0.01M EDC，涡旋混匀，5min后加入40μL，0.01M suLfo-NHS，涡旋混匀。在1±1℃下超声30min。活化完成后，取出活化反应液，置于超滤管(100kd)中，在低温离心机中离心，转速3500rpm，5min，完成后，在反应液中加入1ml，pH＝8.5，0.01M硼酸-硼砂缓冲溶液，重复离心一次，取出反应液。向反应液中加入5.2μL小鼠CRP单克隆抗体(anti-CRP-C6，5.8mg/ml)，涡旋混匀，在2±1℃下超声3h，即得量子点-抗体荧光探针。

偶联率测试方法同实施例1，测得具体偶联率为92.90％。

对比例1量子点-抗体荧光探针的制备

基本同实施例1，其区别仅在于分别使活化的反应温度、活化量子点与抗体在室温下条件下进行。

测得偶联率为63.77％，其中会出现荧光性淬灭的现象。

对比例2量子点-抗体荧光探针的制备

基本同实施例1，其区别仅在于使活化的反应在pH为4.5的条件下进行。

测得偶联率为55.67％，其中部分生成的量子点-抗体荧光探针会发生攒聚难以分散均匀且粘附在反应容器的器壁上，致使失活或无法分离而难以被利用。

实施例4

a)量子点-抗体荧光探针的制备同实施例1；

b)将样品垫和结合垫置于处理液(即含1％BSA，1％吐温20，3％海藻糖，1％PEG20000的pH＝8.5，0.01mol/L硼酸-硼砂缓冲溶液)中，摇床震荡2h，取出并烘干；在结合垫上喷涂上述制备的量子点-抗体荧光探针并干燥，喷涂速率为2μl/cm；使用点样仪在硝酸纤维素膜上分别划检测线和质控线，检测线为2mg/ml小鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体(anti-CRP-C2)，质控线为0.5mg/ml羊抗鼠多克隆抗体IgG，划线速率分别为0.8μl/cm，干燥，然后将硝酸纤维素膜置于1％BSA的pH＝8.5，0.01mol/L硼酸-硼砂缓冲溶液处理2h，再用清洗溶液(含有10mmol/L的三(羟基甲基)氨基甲烷，150mmol/L的氯化钠，0.05％(V/V)的吐温20的水溶液)清洗3次并在37℃干燥；将处理后的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和胶板依次层叠，制成所述基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条。

将上述制备的量子点免疫层析试纸条分别检测0mg/L、0.016mg/L、0.063mg/L、0.25mg/L、1mg/L和4mg/L下CRP结果现象图，测试结果如图4所示；

在上述制备的基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的样品垫上滴加4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008、0μg/ml系列浓度的CRP标准溶液，上样量为70μl，每个浓度重复3个试纸条。荧光分析仪检测T线和C线上的荧光强度，计算各浓度的T/C的荧光比值，取其平均值制作CRP浓度与T/C的标准曲线，测试结果如图5所示，相关系数R²＝0.9931，y＝-0.1058x²+0.7634x+0.1893。

实施例5

a)量子点-抗体荧光探针的制备同实施例2；

b)将样品垫和结合垫置于处理液(即含1％BSA，1％吐温20，3％海藻糖，1％PEG20000的pH＝8.5，0.01mol/L硼酸-硼砂缓冲溶液)中，摇床震荡2h，取出并烘干；在结合垫上喷涂量子点-抗体荧光探针并干燥，喷涂速率为2μl/cm；使用点样仪在硝酸纤维素膜上分别划检测线和质控线，检测线为2mg/ml小鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体(anti-CRP-C2)，质控线为0.5mg/ml羊抗鼠多克隆抗体IgG，划线速率分别为0.8μl/cm，干燥，然后将硝酸纤维素膜置于1％BSA的pH＝8.5，0.01mol/L硼酸-硼砂缓冲溶液处理2h，再用清洗溶液(含有10mmol/L的三(羟基甲基)氨基甲烷，150mmol/L的氯化钠，0.05％(V/V)的吐温20的水溶液)清洗3次并在37℃干燥；将处理后的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和胶板依次层叠，制成所述基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条。

实施例6

a)量子点-抗体荧光探针的制备同实施例3；

b)将样品垫和结合垫置于处理液(即含1％BSA，1％吐温20，3％海藻糖，1％PEG20000的pH＝8.5，0.01mol/L硼酸-硼砂缓冲溶液)中，摇床震荡2h，取出并烘干；在结合垫上喷涂量子点-抗体荧光探针并干燥，喷涂速率为2μl/cm；使用点样仪在硝酸纤维素膜上分别划检测线和质控线，检测线为2mg/ml小鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体(anti-CRP-C2)，质控线为0.5mg/ml羊抗鼠多克隆抗体IgG，划线速率分别为0.8μl/cm，干燥，然后将硝酸纤维素膜置于1％BSA的pH＝8.5，0.01mol/L硼酸-硼砂缓冲溶液处理2h，再用清洗水溶液(含有10mmol/L的三(羟基甲基)氨基甲烷，150mmol/L的氯化钠，0.05％(V/V)的吐温20的水溶液)清洗3次并在37℃干燥；将处理后的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和胶板依次层叠，制成所述基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条。

实施例7

a)量子点-抗体荧光探针的制备同实施例3；

b)将样品垫和结合垫置于处理液(即含3％BSA，1％吐温20，1％海藻糖，1％PEG20000的pH＝8.5，0.01mol/L硼酸-硼砂缓冲溶液)中，摇床震荡2h，取出并烘干；在结合垫上喷涂量子点-抗体荧光探针并干燥，喷涂速率为2μl/cm；使用点样仪在硝酸纤维素膜上分别划检测线和质控线，检测线为2mg/ml小鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体(anti-CRP-C2)，质控线为0.5mg/ml羊抗鼠多克隆抗体IgG，划线速率分别为0.8μl/cm，干燥，然后将硝酸纤维素膜置于1％BSA的pH＝8.5，0.01mol/L硼酸-硼砂缓冲溶液处理2h，再用清洗溶液(含有10mmol/L的三(羟基甲基)氨基甲烷，150mmol/L的氯化钠，0.05％(V/V)的吐温20的水溶液)清洗3次并在37℃干燥；将处理后的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和胶板依次层叠，制成所述基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条。

对比例3

基本同实施例4，其区别仅在于硝酸纤维素膜不使用封闭液封闭。

测试实验结果为：此对比例制备的免疫层析试纸条在实际检测过程中硝酸纤维素膜上荧光背景较高，难以对浓度小于0.1mg/L的超敏C反应蛋白实现准确定量检测，存在较大误差，灵敏度降低。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

1）使羧基修饰的量子点与激活剂在0-5℃下、在pH值为5-6的缓冲液中反应，生成活化量子点；其中，所述激活剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物；

2）然后使制备的所述活化量子点与第一抗体在0-5℃下、在pH值为6-9的缓冲液中反应，制成量子点-抗体荧光探针；

3）使用处理液处理样品垫和结合垫，将步骤2）制备的所述量子点-抗体荧光探针涂覆于处理后的所述结合垫上表面；

4）分别采用第二抗体和第三抗体在硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线，且使用封闭液封闭包被后的所述硝酸纤维素膜，所述封闭液为含有质量分数为0.5-2%的牛血清白蛋白、pH值为7-9的硼酸-硼砂缓冲溶液；

5）将步骤3）处理后的所述样品垫、所述结合垫，以及步骤4）处理后的所述硝酸纤维素膜、吸水垫和载体依次层叠，即制成所述基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条。

2.根据权利要求1所述的基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺或其硫代物、所述羧基修饰的量子点的投料摩尔比为1000~10000︰1000~10000︰1。

3.根据权利要求1所述的基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述活化量子点与所述第一抗体的投料摩尔比为1︰5-15。

4.根据权利要求1所述的基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，分别控制所述步骤1）和所述步骤2）的反应在超声条件下进行；和/或，所述步骤1）和所述步骤2）中pH值分别通过硼酸-硼砂缓冲溶液来调节。

5.根据权利要求1所述的基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述第一抗体为小鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体（anti-CRP-C6）；和/或，所述第二抗体为小鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体（anti-CRP-C2）；和/或，所述第三抗体为羊抗鼠多克隆抗体IgG。

6.根据权利要求1所述的基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤2）的具体实施方式为：将步骤1）反应后得到的含有活化量子点的反应液置于超滤管中，在0-10℃下离心，然后加入硼酸-硼砂缓冲溶液调节pH值，再次离心，制得pH值为6-9的含有活化量子点的粗提溶液，然后将第一抗体加入所述粗提溶液中，在0-5℃下反应，制成所述量子点-抗体荧光探针。

7.根据权利要求1所述的基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤3）中，以质量分数计，所述处理液包括1-5%的牛血清白蛋白、1-3%的吐温20、1-5%的海藻糖和1-3%的聚乙二醇20000。

8.根据权利要求1所述的基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤4）中，所述检测线为0.5-2mg/ml的第二抗体，和/或，所述质控线为0.5-1mg/ml的第三抗体；和/或，所述检测线和所述质控线的划线速度分别为0.5-1μl/cm。

9.根据权利要求1所述的基于量子点的超敏C反应蛋白免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤4）中，所述硝酸纤维素膜使用所述封闭液封闭后还包括清洗步骤，所述清洗步骤采用pH值为7-8且由三（羟基甲基）氨基甲烷、氯化钠和吐温20构成的清洗溶液。