CN105467132A - 一种基于Cr3+@Au@OMC的免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Cr³⁺AuOMC作为检测抗体标记物，制备一种人免疫球蛋白的夹心型电化学免疫传感器，利用Cr³⁺AuOMC优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器具有特异性强，灵敏度高和检出限低等优点。

Description

一种基于Cr3+AuOMC的免疫传感器的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Cr³⁺AuOMC作为检测抗体标记物，制备一种夹心型电化学免疫传感器，属于新型功能材料、免疫分析以及生物传感检测技术领域。

背景技术

人类受众多病毒的干扰，比如麻疹和传染性肝炎等，发病率高、生长和转移速度快，对人类的健康有极大的危害。免疫球蛋白是人体血清中含量最高的抗感染抗体,约占血清免疫蛋白的70%～80%。人免疫球蛋白是人体受抗原（比如病毒）刺激后产生的一种蛋白质，主要功能是与抗原起免疫反应，从而阻断抗原（比如病毒产生抗原）对人体的危害。随着人体内与麻疹和传染性肝炎相应的抗原的产生，人体内的免疫球蛋白的量也相应增加。所以，人体内免疫球蛋白含量的高低可以作为慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的参考值。因此在临床研究上，发展快速、简便、灵敏的检测人免疫球蛋白的方法十分重要。

目前已有的对于人免疫球蛋白的检测方法很多，如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶标记免疫分析法、化学免疫发光分析法、时间分辨荧光免疫分析法等，但多数检测方法繁琐，操作复杂，费用昂贵，检出限高，因此，建立一种快速、简便、灵敏的检测方法有重要意义。

免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特异性结合，使得它具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点。而构建电化学免疫传感器的关键有两点：其一是采用简单、快速、有效的方法将抗原抗体等生物分子固定在电极表面；其二是开发传感器的信号放大技术。

电沉积金具有良好的导电性能，其优良的生物相容性使之能够很好的固载抗体，有序介孔碳以其大的比表面积能够很好的固载金纳米粒子和铬离子，使之具有良好的催化性能，能够加速电子传递，对于提高传感器灵敏度具有重要作用。

因此本发明制备了一种应用电沉积金作为基底材料和以Cr³⁺AuOMC为标记物的免疫传感器，实现了对人免疫球蛋白的超灵敏检测。

发明内容

本发明的目的之一是基于Cr³⁺AuOMC作为检测抗体标记物，构建了一种快速超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。

本发明的目的之二是将该夹心型电化学免疫传感器应用于人免疫球蛋白的检测。

本发明的技术方案如下：

1.一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将直径为3~5mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将HAuCl₄(1wt%)用计时电流法从-0.2V~0.2V电沉积到电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

（3）滴涂6μL、8~12μg/mL的人免疫球蛋白捕获抗体Ab₁溶液于电极表面，4^oC冰箱中干燥；

（4）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab₁后，滴加3μL、0.1~1.0mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4^oC冰箱中晾干；

（5）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6μL、1×10^-5~100ng/mL的一系列不同浓度的人免疫球蛋白溶液，室温孵化1h，超纯水清洗，置于4^oC冰箱中干燥；

（6）将6μL、1~3mg/mL的检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4^oC冰箱中晾干，制得一种基于Cr³⁺AuOMC的人免疫球蛋白传感器。

2.如权利要求1所述的一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法，所述的所述Cr³⁺AuOMC-Ab₂二抗孵化物溶液的制备，其特征在于，制备步骤如下：

（1）金纳米粒子溶液的制备

将1.0mL氯金酸（1wt%）加入到99mL超纯水中，边搅拌边加入2.5mL的柠檬酸钠（1wt%），在100^oC下回流15min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；

（2）AuOMC的制备

准确称取10~20mg的OMC加入离心管中，向离心管中加入1~2mL超纯水使其分散均匀，再将50mL金纳米粒子溶液加入离心管中，超声10min，放在振荡器上振荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得黑色粉末AuOMC；

（3）Cr³⁺AuOMC的制备

首先配置1mg/mL的硝酸铬溶液，然后准确称取4~6mg的AuOMC并加入4mL的硝酸铬溶液，超声10min，然后将其震荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得Cr³⁺AuOMC；

（4）检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液的制备

在2mL、2~4mg/mL的Cr³⁺AuOMC溶液中，加入2mL的8~12mg/mL的人免疫球蛋白检测抗体Ab₂溶液，4^oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；离心分离后，加入1mL50mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液，4^oC下保存备用。

3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于Cr³⁺AuOMC-Ab₂的免疫传感器用于人免疫球蛋白的检测，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmol/L的pH5.59~8.02磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用计时电流法对人免疫球蛋白进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中加入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。

4.如权利要求1所述的一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法，所述人免疫球蛋白选自下列之一：IgG和IgM。

本发明的有益成果

（1）本发明的发明人首次将Cr³⁺AuOMC纳米粒子作为检测抗体标记物引入到人免疫球蛋白的电化学免疫传感器的制备当中，利用Cr³⁺AuOMC优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器具有高的灵敏度和宽的检测范围，检测IgG线性范围为0.01pg/mL～100ng/mL，检测限为0.003pg/mL；检测IgM的线性范围为0.02pg/mL~90ng/mL，检测限为0.004pg/mL。

（2）使用了具有良好催化效果电沉积金作为基底材料，既能够很好的固载捕获抗体，又可以提高比表面积和电子转移速率，实现了电化学信号的放大，进一步提高了传感器的灵敏度。

（3）使用完全相同的纳米材料和修饰方法，利用抗原与抗体的特异性结合，只需改变免疫球蛋白种类即可实现不同免疫球蛋白的高灵敏、特异性检测，此方法操作简单，检测速度快，可在短时间内实现大量样品的测定，有利于免疫传感器的商品化。

（4）将Cr³⁺AuOMC纳米粒子与人免疫球蛋白检测抗体直接孵化，在检测抗体的标记物中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的检测误差，简化了检测抗体标记物的制作步骤，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此

实施例1.一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将直径为3mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将HAuCl₄(1wt%)用计时电流法从-0.2V电沉积到电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

（3）滴涂6μL、8μg/mL的人免疫球蛋白捕获抗体Ab₁溶液于电极表面，4^oC冰箱中干燥；

（4）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab₁后，滴加3μL、0.1mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4^oC冰箱中晾干；

（5）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6μL、1×10^-5~100ng/mL的一系列不同浓度的人免疫球蛋白溶液，室温孵化1h，超纯水清洗，置于4^oC冰箱中干燥；

（6）将6μL、1mg/mL的检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4^oC冰箱中晾干，制得一种基于Cr³⁺AuOMC的人免疫球蛋白传感器。

实施例2.一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将HAuCl₄(1wt%)用计时电流法从0V电沉积到电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

（3）滴涂6μL、10μg/mL的人免疫球蛋白捕获抗体Ab₁溶液于电极表面，4^oC冰箱中干燥；

（4）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab₁后，滴加3μL、0.5mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4^oC冰箱中晾干；

（5）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6μL、1×10^-5~100ng/mL的一系列不同浓度的人免疫球蛋白溶液，室温孵化1h，超纯水清洗，置于4^oC冰箱中干燥；

（6）将6μL、2mg/mL的检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4^oC冰箱中晾干，制得一种基于Cr³⁺AuOMC的人免疫球蛋白传感器。

实施例3.一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将直径为5mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将HAuCl₄(1wt%)用计时电流法从0.2V电沉积到电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

（3）滴涂6μL、12μg/mL的人免疫球蛋白捕获抗体Ab₁溶液于电极表面，4^oC冰箱中干燥；

（4）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab₁后，滴加3μL、1.0mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4^oC冰箱中晾干；

（5）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6μL、1×10^-5~100ng/mL的一系列不同浓度的人免疫球蛋白溶液，室温孵化1h，超纯水清洗，置于4^oC冰箱中干燥；

（6）将6μL、3mg/mL的检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4^oC冰箱中晾干，制得一种基于Cr³⁺AuOMC的人免疫球蛋白传感器。

实施例4.构建人免疫球蛋白免疫传感器的各种传感材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米粒子溶液的制备

将1.0mL氯金酸（1wt%）加入到99mL超纯水中，边搅拌边加入2.5mL的柠檬酸钠（1wt%），在100^oC下回流15min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；

（2）AuOMC的制备

准确称取10mg的OMC加入离心管中，向离心管中加入1mL超纯水使其分散均匀，再将50mL金纳米粒子溶液加入离心管中，超声10min，放在振荡器上振荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得黑色粉末AuOMC；

（3）Cr³⁺AuOMC的制备

首先配置1mg/mL的硝酸铬溶液，然后准确称取4mg的AuOMC并加入4mL的硝酸铬溶液，超声10min，然后将其震荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得Cr³⁺AuOMC；

（4）检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液的制备

在2mL、2mg/mL的Cr³⁺AuOMC溶液中，加入2mL的8mg/mL的人免疫球蛋白检测抗体Ab₂溶液，4^oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；离心分离后，加入1mL50mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液，4^oC下保存备用。

实施例5.构建人免疫球蛋白免疫传感器的各种传感材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米粒子溶液的制备

将1.0mL氯金酸（1wt%）加入到99mL超纯水中，边搅拌边加入2.5mL的柠檬酸钠（1wt%），在100^oC下回流15min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；

（2）AuOMC的制备

准确称取15mg的OMC加入离心管中，向离心管中加入1.5mL超纯水使其分散均匀，再将50mL金纳米粒子溶液加入离心管中，超声10min，放在振荡器上振荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得黑色粉末AuOMC；

（3）Cr³⁺AuOMC的制备

首先配置1mg/mL的硝酸铬溶液，然后准确称取5mg的AuOMC并加入4mL的硝酸铬溶液，超声10min，然后将其震荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得Cr³⁺AuOMC；

（4）检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液的制备

在2mL、3mg/mL的Cr³⁺AuOMC溶液中，加入2mL的10mg/mL的人免疫球蛋白检测抗体Ab₂溶液，4^oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；离心分离后，加入1mL50mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液，4^oC下保存备用。

实施例6.构建人免疫球蛋白免疫传感器的各种传感材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米粒子溶液的制备

将1.0mL氯金酸（1wt%）加入到99mL超纯水中，边搅拌边加入2.5mL的柠檬酸钠（1wt%），在100^oC下回流15min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；

（2）AuOMC的制备

准确称取20mg的OMC加入离心管中，向离心管中加入2mL超纯水使其分散均匀，再将50mL金纳米粒子溶液加入离心管中，超声10min，放在振荡器上振荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得黑色粉末AuOMC；

（3）Cr³⁺AuOMC的制备

首先配置1mg/mL的硝酸铬溶液，然后准确称取6mg的AuOMC并加入4mL的硝酸铬溶液，超声10min，然后将其震荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得Cr³⁺AuOMC；

（4）检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液的制备

在2mL、4mg/mL的Cr³⁺AuOMC溶液中，加入2mL的12mg/mL的人免疫球蛋白检测抗体Ab₂溶液，4^oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；离心分离后，加入1mL50mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液，4^oC下保存备用。

实施例7.所构建的免疫传感器，用于人免疫球蛋白IgG的检测，检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmol/L的pH5.59~8.02磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用计时电流法对人免疫球蛋白进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中加入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。

（4）根据所得电流强度与IgG浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得其线性范围为0.01pg/mL～100ng/mL，检测限为0.003pg/mL。

实施例8.人免疫球蛋白IgM的检测

绘制工作曲线步骤同实施例7，按照绘制工作曲线的方法进行IgM样品分析，测得线性范围为0.02pg/mL~110ng/mL，检测限为0.007pg/mL。

Claims (4)

1.一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将直径为3~5mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将HAuCl₄(1wt%)用计时电流法从-0.2V~0.2V电沉积到电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；

（3）滴涂6μL、8~12μg/mL的人免疫球蛋白捕获抗体Ab₁溶液于电极表面，4^oC冰箱中干燥；

（4）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab₁后，滴加3μL、0.1~1.0mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4^oC冰箱中晾干；

（5）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6μL、1×10^-5~100ng/mL的一系列不同浓度的人免疫球蛋白溶液，室温孵化1h，超纯水清洗，置于4^oC冰箱中干燥；

（6）将6μL、1~3mg/mL的检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4^oC冰箱中晾干，制得一种基于Cr³⁺AuOMC的人免疫球蛋白传感器。

2.如权利要求1所述的一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法，所述的所述Cr³⁺AuOMC-Ab₂二抗孵化物溶液的制备，其特征在于，制备步骤如下：

（1）金纳米粒子溶液的制备

将1.0mL氯金酸（1wt%）加入到99mL超纯水中，边搅拌边加入2.5mL的柠檬酸钠（1wt%），在100^oC下回流15min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；

（2）AuOMC的制备

准确称取10~20mg的OMC加入离心管中，向离心管中加入1~2mL超纯水使其分散均匀，再将50mL金纳米粒子溶液加入离心管中，超声10min，放在振荡器上振荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得黑色粉末AuOMC；

（3）Cr³⁺AuOMC的制备

首先配置1mg/mL的硝酸铬溶液，然后准确称取4~6mg的AuOMC并加入4mL的硝酸铬溶液，超声10min，然后将其震荡24h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35^oC真空干燥，制得Cr³⁺AuOMC；

（4）检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液的制备

在2mL、2~4mg/mL的Cr³⁺AuOMC溶液中，加入2mL的8~12mg/mL的人免疫球蛋白检测抗体Ab₂溶液，4^oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；离心分离后，加入1mL50mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Cr³⁺AuOMC-Ab₂溶液，4^oC下保存备用。

3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于Cr³⁺AuOMC-Ab₂的免疫传感器用于人免疫球蛋白的检测，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmol/L的pH5.59~8.02磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用计时电流法对人免疫球蛋白进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中加入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。

4.如权利要求1所述的一种基于Cr³⁺AuOMC的免疫传感器的制备方法，所述人免疫球蛋白选自下列之一：IgG和IgM。