CN113030218A - 检测心肌肌钙蛋白i的免疫传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：(1)对裸金电极进行前处理；(2)将CMK‑3滴加到处理好的裸金电极表面，干燥；(3)在上述电极表面滴加AuNPs胶体溶液，干燥；(4)然后将捕获抗体Ab1溶液滴加到步骤(3)得到的电极表面，置于温度为37℃下孵育2h；(5)将牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育10‑50min；(6)模拟加样，将8μL不同浓度梯度的cTnI溶液滴加到步骤(5)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育1h；(7)最后将PdPt‑PMB‑Ab2结合物滴加到步骤(6)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育1h，在目标物cTnI存在下，由Ab1、cTnI和PdPt‑PMB‑Ab2组成的三明治型免疫复合物，即可。

Description

检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于心肌肌钙蛋白I快速检测技术领域，具体涉及一种检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器及其制备方法与应用。
背景技术
急性心肌梗死(AMI)是临床常见的心血管疾病之一，被认为是心血管疾病患者死亡的主要原因。AMI发病后1-3小时是溶栓和介入治疗的“黄金”窗口，这意味着早期AMI的快速诊断是治疗的关键。传统的AMI诊断主要依靠心绞痛症状、心电图和生物标志物检测，其中生物标志物检测非典型心肌梗死表现(即没有胸痛或没有心电图ST段抬高)的患者的鉴别尤为重要。心肌肌钙蛋白I(cTnI)被认为是AMI早期诊断的金标准，它具有很高的心肌组织特异性和临床敏感性，甚至可以反映微小区域的心肌缺血或坏死。健康人的cTnI浓度通常低于0.4ng mL-1，而高于2.0ng mL-1的水平意味着未来可能发生严重心脏事件的风险增加。
目前，已有多种检测方法用于检测血液标本中cTnI的水平，包括酶联免疫吸附法、电化学发光免疫法、化学发光免疫法和荧光免疫法等。但这些方法存在实验周期长、实验操作复杂、灵敏度低等局限性，在这种情况下，电化学免疫传感器因其操作方便、样品消耗少、响应速度快、灵敏度高、成本低等优点越来越受到人们的重视。三明治型电化学免疫传感器作为电化学免疫传感器的一个分支，在一些文献中已发展出利用纳米材料检测cTnI浓度的方法。然而，纳米材料的合成通常需要多步或苛刻的条件，如高温、高压等。因此，为了填补这一空白，急需提供一种新型电化学免疫传感器用于cTnI的检测。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器，该免疫传感器是由CMK-3@AuNPs和PdPt-PMB纳米复合材料制备而成，该检测方法灵敏度高，实验周期短，实验操作简单。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)对裸金电极进行前处理；
(2)将8μL浓度为1mg mL-1的CMK-3滴加到处理好的裸金电极表面，并在室温下干燥4h；
(3)在上述电极表面滴加8μL的AuNPs胶体溶液，并在室温下干燥2h；
(4)然后将8μL，浓度为25μg mL-1的捕获抗体Ab1溶液滴加到步骤(3)得到的电极表面，放置于温度为37℃下孵育2h；
(5)将8μL，质量分数为0.25％的牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育10-50min；
(6)模拟加样，将8μL不同浓度梯度的cTnI溶液滴加到步骤(5)得到的电极表面，并在温度为37℃下孵育1h，使目标蛋白cTnI与修饰电极上的Ab1通过抗原-抗体反应结合；
(7)最后将8μL的PdPt-PMB-Ab2结合物滴加到步骤(6)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育1h，在目标物cTnI存在下，通过抗原-抗体反应形成由Ab1、cTnI和PdPt-PMB-Ab2组成的三明治型免疫复合物，即可。
进一步，在步骤(3)中，所述AuNPs胶体溶液的制备方法如下：
(a1)首先，将100mL，质量分数为0.01％的HAuCl4溶液在连续搅拌下加热至沸腾15min；
(a2)然后将1mL，质量分数为2％的新鲜制备的柠檬酸三钠溶液逐滴滴加至上述溶液中，继续搅拌15min，观察到溶液颜色由淡黄色变为酒红色，即可；
(a3)冷却至25℃后，将上述AuNPs胶体溶液在4℃下储存到棕色烧瓶中，以备后续使用。
进一步，在步骤(3)中，所述PdPt-PMB-Ab2结合物的制备方法如下：
(b1)首先将0.1M，600μL的HCl和1.14mM，6mL的DTAB加入到9.8mM，0.5mL的MB溶液中，剧烈搅拌10min后形成胶束混合物；
(b2)然后将4wt％，100μL的H2PdCl4和4wt％，100μL的H2PtCl6加入至上述混合物中，并在室温下连续搅拌8h，得到PdPt-PMB复合材料，并在转速为8000rpm下离心10min后，洗涤；
(b3)将上述PdPt-PMB复合材料重新分散于10mM，2mL的PBS中，然后在温度为4℃下进行还原，得到PdPt-PMB复合材料；
(b4)将200μL上述PdPt-PMB复合材料与4-12μL的检测抗体Ab2混合，并在温度为4℃下进行搅拌12h，离心和洗涤；
(b5)最后，将上述PdPt-PMB-Ab2悬浮于10mM，1mL的PBS中，并保存在温度为4℃下的黑暗环境中以备日后使用。
进一步，所述PBS的pH值为4.5-8。
进一步，所述Ab2的体积为10μL。
进一步，在步骤(5)中所述cTnI溶液的浓度分别为0ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL。
采用上述方法制备得到检测心肌肌钙蛋白I的新型电化学免疫传感器。
利用新型电化学免疫传感器在定量检测心肌肌钙蛋白I中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的基于CMK-3/AuNPs和PdPt-PMB免疫传感器用于检测cTnI浓度。CMK-3/AuNPs复合材料不仅保证了足够的比表面积，而且具有良好的导电性；PdPt-PMB纳米复合材料通过一锅合成法在常温状态下合成了形态均一的棒状纳米材料，是一种新型的氧化还原纳米探针，进一步提供了强大的氧化还原电流和增强的催化活性。基于纳米材料的上述优点，该免疫传感器具有灵敏度高、检测范围宽、检出限低等优点。此外，该免疫传感器具有良好的选择性和稳定性，可用于区分cTnI与其他干扰物质，监测实际血清中的低浓度cTnI。此外，这种低成本而有效的方法可以通过改变识别因子来构建针对其他生物标志物的电化学传感器。
附图说明
图1为本发明免疫传感器的制备示意图；
图2为CMK-3的SEM图；
图3为AuNPs的TEM图；
图4为AuNPs的UV-vis；
图5为CMK-3和AuNPs的zeta电位测试结果图；
图6为PdPt-PMB纳米复合材料的表征图；
图7为本发明制备的免疫传感器循环伏安法表征图；
图8为本发明制备的免疫传感器电阻抗谱表征图；
图9为本发明制备的免疫传感器与不同浓度梯度的cTnI孵育的DPV响应；
图10为本发明制备的免疫传感器DPV峰值与cTnI浓度的相关性(右下角小图为DPV峰值与cTnI浓度的对数之间的线性关系)；
图11为本发明制备的免疫传感器的选择性分析图；
图12为本发明制备的免疫传感器的重复性分析图；
图13为本发明制备的免疫传感器的稳定性分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明方法进行详细说明。本发明的心肌肌钙蛋白I可缩写为cTnI，裸金电极可缩写为GE，捕获抗体Ab1(型号为ab10231)和检测抗体Ab2(型号为ab92408)均购自Abcam公司，MB为亚甲基蓝材料，DTAB为十二烷基三甲基溴化铵，牛血清白蛋白为BSA，CMK-3为氮掺杂有序介孔碳材料，其合成方法为：首先，制备壳聚糖(CS)胶体溶液(0.5wt％)，将CS粉末100mg溶于1％(v/v)醋酸溶液20mL中，超声分散处理1h，得到均匀的淡黄色胶体溶液；然后用1M NaOH将CS胶体溶液的pH值调节到4.0～4.5；在1mL CS溶液中加入1mg CMK-3，超声处理2h，直至溶液颜色变成均匀的黑色且无分层；最终将黑色均质CMK-3胶体溶液保存在4℃下以供后续使用。
一、制备心肌肌钙蛋白I的免疫传感器
实施例1
1.1)AuNPs胶体溶液的制备
(a1)首先，将100mL，质量分数为0.01％的HAuCl4溶液在连续搅拌下加热至沸腾15min；
(a2)然后将1mL，质量分数为2％的新鲜制备的柠檬酸三钠溶液逐滴滴加至上述溶液中，继续搅拌15min，观察到溶液颜色由淡黄色变为酒红色，即可；
(a3)冷却至25℃后，将上述AuNPs胶体溶液在4℃下储存到棕色烧瓶中，以备后续使用。
1.2)PdPt-PMB-Ab2结合物的制备
(b1)首先将0.1M，600μL的HCl和1.14mM，6mL的DTAB加入到9.8mM，0.5mL的MB溶液中，剧烈搅拌10min后形成胶束混合物；
(b2)然后将4wt％，100μL的H2PdCl4和4wt％，100μL的H2PtCl6加入至上述混合物中，并在室温下连续搅拌8h，得到PdPt-PMB复合材料，并在转速为8000rpm下离心10min后，洗涤；
(b3)将上述PdPt-PMB复合材料重新分散于10mM，2mL的PBS(pH值为4.5)中，然后在温度为4℃下进行还原，得到PdPt-PMB复合材料；
(b4)将200μL上述PdPt-PMB复合材料与4μL的检测抗体Ab2混合，并在温度为4℃下进行搅拌12h，离心和洗涤；为了防止非特异性吸附，在PdPt-PMB复合材料中加入1％BSA；
(b5)最后，将上述PdPt-PMB-Ab2悬浮于10mM，1mL的PBS中，并保存在温度为4℃下的黑暗环境中以备日后使用。
1.3)心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备
(1)对裸金电极进行前处理；
首先，依次用0.3μm和0.05μm氧化铝浆料抛光金电极至少3min；然后依次在超纯水、无水乙醇和超纯水中连续超声处理3min，去除金电极表面的杂质。接着将金电极浸入新鲜制备的食人鱼溶液(98％H2SO4:30％H2O2，体积比3:1)中5min，并用超纯水彻底冲洗；最后得到了光洁的镜面，将电极直立放置在室温下干燥。
(2)将8μL浓度为1mg mL-1的CMK-3滴加到处理好的裸金电极表面，并在室温下干燥4h；
(3)在上述电极表面滴加8μL的AuNPs胶体溶液，并在室温下干燥2h；
(4)然后将8μL，浓度为25μg mL-1的捕获抗体Ab1溶液滴加到步骤(3)得到的电极表面，放置于温度为37℃下孵育2h，通过Au-NH2键将抗体固定在电极表面；
(5)为了防止非特异性吸附，将8μL，质量分数为0.25％的牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育10min，可阻断可能存在的剩余活性位点；
(6)模拟加样，将8μL不同浓度梯度的cTnI溶液滴加到步骤(5)得到的电极表面，并在温度为37℃下孵育1h，使目标蛋白cTnI与修饰电极上的Ab1通过抗原-抗体反应结合；其中，cTnI溶液的浓度分别为0ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL。
(7)最后将8μL的PdPt-PMB-Ab2结合物滴加到步骤(6)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育1h，在目标物cTnI存在下，通过抗原-抗体反应形成由Ab1、cTnI和PdPt-PMB-Ab2组成的三明治型免疫复合物，即可。
其中，对电极每一步修饰后，用PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)彻底清洗修饰电极。图1为本发明免疫传感器的制备示意图。
实施例2
2.1)AuNPs胶体溶液的制备
(a1)首先，将100mL，质量分数为0.01％的HAuCl4溶液在连续搅拌下加热至沸腾15min；
(a2)然后将1mL，质量分数为2％的新鲜制备的柠檬酸三钠溶液逐滴滴加至上述溶液中，继续搅拌15min，观察到溶液颜色由淡黄色变为酒红色，即可；
(a3)冷却至25℃后，将上述AuNPs胶体溶液在4℃下储存到棕色烧瓶中，以备后续使用。
2.2)PdPt-PMB-Ab2结合物的制备
(b1)首先将0.1M，600μL的HCl和1.14mM，6mL的DTAB加入到9.8mM，0.5mL的MB溶液中，剧烈搅拌10min后形成胶束混合物；
(b2)然后将4wt％，100μL的H2PdCl4和4wt％，100μL的H2PtCl6加入至上述混合物中，并在室温下连续搅拌8h，得到PdPt-PMB复合材料，并在转速为8000rpm下离心10min后，洗涤；
(b3)将上述PdPt-PMB复合材料重新分散于10mM，2mL的PBS(pH值为7)中，然后在温度为4℃下进行还原，得到PdPt-PMB复合材料；
(b4)将200μL上述PdPt-PMB复合材料与10μL的检测抗体Ab2混合，并在温度为4℃下进行搅拌12h，离心和洗涤；为了防止非特异性吸附，在PdPt-PMB复合材料中加入1％BSA；
(b5)最后，将上述PdPt-PMB-Ab2悬浮于10mM，1mL的PBS中，并保存在温度为4℃下的黑暗环境中以备日后使用。
2.3)心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备
(1)对裸金电极进行前处理；
首先，依次用0.3μm和0.05μm氧化铝浆料抛光金电极至少3min；然后依次在超纯水、无水乙醇和超纯水中连续超声处理3min，去除金电极表面的杂质。接着将金电极浸入新鲜制备的食人鱼溶液(98％H2SO4:30％H2O2，体积比3:1)中5min，并用超纯水彻底冲洗；最后得到了光洁的镜面，将电极直立放置在室温下干燥。
(2)将8μL浓度为1mg mL-1的CMK-3滴加到处理好的裸金电极表面，并在室温下干燥4h；
(3)在上述电极表面滴加8μL的AuNPs胶体溶液，并在室温下干燥2h；
(4)然后将8μL，浓度为25μg mL-1的捕获抗体Ab1溶液滴加到步骤(3)得到的电极表面，放置于温度为37℃下孵育2h，通过Au-NH2键将抗体固定在电极表面；
(5)为了防止非特异性吸附，将8μL，质量分数为0.25％的牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育40min，可阻断可能存在的剩余活性位点；
(6)模拟加样，将8μL不同浓度梯度的cTnI溶液滴加到步骤(5)得到的电极表面，并在温度为37℃下孵育1h，使目标蛋白cTnI与修饰电极上的Ab1通过抗原-抗体反应结合；其中，cTnI溶液的浓度分别为0ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL。
(7)最后将8μL的PdPt-PMB-Ab2结合物滴加到步骤(6)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育1h，在目标物cTnI存在下，通过抗原-抗体反应形成由Ab1、cTnI和PdPt-PMB-Ab2组成的三明治型免疫复合物，即可。
其中，对电极每一步修饰后，用PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)彻底清洗修饰电极。
实施例3
3.1)AuNPs胶体溶液的制备
(a1)首先，将100mL，质量分数为0.01％的HAuCl4溶液在连续搅拌下加热至沸腾15min；
(a2)然后将1mL，质量分数为2％的新鲜制备的柠檬酸三钠溶液逐滴滴加至上述溶液中，继续搅拌15min，观察到溶液颜色由淡黄色变为酒红色，即可；
(a3)冷却至25℃后，将上述AuNPs胶体溶液在4℃下储存到棕色烧瓶中，以备后续使用。
3.2)PdPt-PMB-Ab2结合物的制备
(b1)首先将0.1M，600μL的HCl和1.14mM，6mL的DTAB加入到9.8mM，0.5mL的MB溶液中，剧烈搅拌10min后形成胶束混合物；
(b2)然后将4wt％，100μL的H2PdCl4和4wt％，100μL的H2PtCl6加入至上述混合物中，并在室温下连续搅拌8h，得到PdPt-PMB复合材料，并在转速为8000rpm下离心10min后，洗涤；
(b3)将上述PdPt-PMB复合材料重新分散于10mM，2mL的PBS(pH值为8)中，然后在温度为4℃下进行还原，得到PdPt-PMB复合材料；
(b4)将200μL上述PdPt-PMB复合材料与12μL的检测抗体Ab2混合，并在温度为4℃下进行搅拌12h，离心和洗涤；为了防止非特异性吸附，在PdPt-PMB复合材料中加入1％BSA；
(b5)最后，将上述PdPt-PMB-Ab2悬浮于10mM，1mL的PBS中，并保存在温度为4℃下的黑暗环境中以备日后使用。
3.3)心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备
(1)对裸金电极进行前处理；
首先，依次用0.3μm和0.05μm氧化铝浆料抛光金电极至少3min；然后依次在超纯水、无水乙醇和超纯水中连续超声处理3min，去除金电极表面的杂质。接着将金电极浸入新鲜制备的食人鱼溶液(98％H2SO4:30％H2O2，体积比3:1)中5min，并用超纯水彻底冲洗；最后得到了光洁的镜面，将电极直立放置在室温下干燥。
(2)将8μL浓度为1mg mL-1的CMK-3滴加到处理好的裸金电极表面，并在室温下干燥4h；
(3)在上述电极表面滴加8μL的AuNPs胶体溶液，并在室温下干燥2h；
(4)然后将8μL，浓度为25μg mL-1的捕获抗体Ab1溶液滴加到步骤(3)得到的电极表面，放置于温度为37℃下孵育2h，通过Au-NH2键将抗体固定在电极表面；
(5)为了防止非特异性吸附，将8μL，质量分数为0.25％的牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育50min，可阻断可能存在的剩余活性位点；
(6)模拟加样，将8μL不同浓度梯度的cTnI溶液滴加到步骤(5)得到的电极表面，并在温度为37℃下孵育1h，使目标蛋白cTnI与修饰电极上的Ab1通过抗原-抗体反应结合；其中，cTnI溶液的浓度分别为0ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL。
(7)最后将8μL的PdPt-PMB-Ab2结合物滴加到步骤(6)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育1h，在目标物cTnI存在下，通过抗原-抗体反应形成由Ab1、cTnI和PdPt-PMB-Ab2组成的三明治型免疫复合物，即可。
其中，对电极每一步修饰后，用PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)彻底清洗修饰电极。
二、本发明制备的免疫传感器的性能测试
2.1)对CMK-3和AuNPs的表征
用扫描电子显微镜(SEM)对CMK-3的形貌进行了研究。如图2所示CMK-3呈棒状，表面粗糙，孔径好，孔容大，可提供较大的比表面积。使用透射电子显微镜(TEM)对AuNPs的形态和尺寸进行了表征。如图3所示,AuNPs分散良好，粒径均匀，约15nm。此外，UV-vis也证明了AuNPs的合成，在图4中525nm处观察到了明显的吸收峰，表明AuNPs的成功合成。用zeta电位分析仪分别测定CMK-3和AuNPs的电位，以证明CMK-3和AuNPs之间的静电引力。如图5所示，CMK-3溶液的zeta电位为+51(±0.73)mV，而AuNPs溶液的zeta电位为-18(±0.53)mV，由此发现CMK-3和AuNPs可以通过静电引力结合到电极表面。
2.2)对PdPt-PMB的表征
利用SEM和TEM对制备的PdPt-PMB纳米材料的尺寸和形貌进行了研究。制备的PdPt-PMB呈现出棒状纳米结构，具有粗糙的表面和良好的均匀形貌(图6(a-c))。通过X射线能谱仪(XPS)测量PdPt-PMB纳米复合材料的结构组成，如图6(d)所示。C1s、N1s、Cl2p和S2p峰与MB的元素组成相对应。Pd3d和Pt4f峰与Pd和Pt纳米粒子的峰位一致，证明成功地使用MB还原Pd和Pt纳米粒子形成了PdPt-PMB纳米复合材料。同时，用能谱仪(EDS)对PdPt-PMB的元素组成进行了分析，可以观察到Pd、Pt、C、N、S和Cl的显著元素峰，这进一步表明成功合成了PdPt-PMB纳米复合材料(图6(e))。
2.3)用电化学循环伏安法(CV)表征电极表面修饰的过程
用循环伏安法(CV)在含5mm K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1M KCl的PBS(pH7.4，0.1M)工作液中，以50mv s-1的扫描速率，对电极地逐步修饰进行验证。如图7(a)所示，裸GE(曲线a)显示了良好地可逆氧化还原峰，这归因于[Fe(CN)6]3-/4-的氧化还原，证明抛光后的裸GE具有良好的导电性。在GE上沉积CMK-3后(曲线b)，电流响应明显增加，是由于引入CMK-3后有效孔隙比表面积增大以及CMK-3良好的导电性好所致。然后，在CMK-3/GE表面修饰AuNPs(曲线c)，得到了最高的氧化还原峰，因为AuNPs的优良导电性可以显著地促进修饰电极上的电子转移过程。在Ab1孵育到修饰后的电极上之后(曲线d)，氧化还原峰电流开始下降，是由于生物活性物质阻碍了电子转移效率，证明Ab1通过Au-NH2键成功地固定在AuNPs/CMK-3/GE表面。随后，在电极表面引入非电活性物质BSA阻断非特异位点后(曲线e)，氧化还原峰再次下降。在BSA/Ab1/AuNPs/CMK-3/GE(曲线f)的cTnI孵育后，氧化还原峰进一步降低，表明Ab1与cTnI之间的特异识别和结合。
2.4)电化学生物传感器的电化学阻抗法表征
此外，电阻抗谱法(EIS)也用于验证电极表面成功的逐步修饰过程(见图8)。在能奎斯特图中，半圆直径等于电荷转移电阻(Ret)。裸GE的Ret(曲线a)较小，说明GE具有良好的导电性。当AuNPs和CMK-3相继沉积在GE表面时，半圆直径减小，表明AuNPs和CMK-3能加速电子转移。然而，在修饰电极上固定Ab1并加入BSA阻断剩余活性位点后，由于非导电性物质阻碍了电子转移，半圆直径明显增大(曲线d和e)，这与CV的结果完全一致。此外，在cTnI存在的情况下，Ret增加到最大值(曲线f)，这与蛋白质疏水层隔离导电载体的事实相一致。综上所述，CV和EIS结果证明了电极成功的实现了逐步自组装过程。
2.5)免疫传感器对目标物的检测
将制备的电免疫传感器与不同浓度梯度的cTnI孵育。如图9所示，随着cTnI浓度从0增加到10ng mL-1，免疫传感器的DPV电流响应逐渐增强，这是因为随着cTnI浓度的升高，可以结合更多的PdPt-PMB-Ab2信号探针，产生更多的三明治型免疫复合物。与DPV的结果相对应，图9显示了在0.001至10ng mL-1范围内，峰值电流与cTnI浓度的对数之间良好的线性关系，最低检测限(LOD)为0.43pg mL-1(S/N＝3)。线性回归方程为I(μA)＝16.07logc(ngmL-1)+73.64(n＝3)，相关系数R2为0.992。结果表明，所设计的免疫传感器可用于cTnI的定量检测。与已有的方法(表1)相比，该方法在分析范围和检出限方面均取得了较好的效果，具有良好的临床应用前景。
表1不同cTnI检测方法对比
方法 Linearrange Detectionlimit Reference
荧光免疫分析 1-50pgmL<sup>-1</sup> 1ngmL<sup>-1</sup> [1]
化学发光免疫分析 0-25ngmL<sup>-1</sup> 14pgmL<sup>-1</sup> [2]
电化学免疫传感器 50pgmL<sup>-1</sup>-1μgmL<sup>-1</sup> 5pgmL<sup>-1</sup> [3]
电化学免疫传感器 5pgmL<sup>-1</sup>-20ng mL<sup>-1</sup> 2pgmL<sup>-1</sup> [4]
电化学免疫传感器 1pgmL<sup>-1</sup>-10ngmL<sup>-1</sup> 0.43pgmL<sup>-1</sup> 本方法
其中：[1]Guo X,Zong L,Jiao Y,et al.Signal-Enhanced Detection ofMultiplexed Cardiac Biomarkers by a Paper-Based Fluorogenic ImmunodeviceIntegrated with Zinc Oxide Nanowires[J].Anal Chem,2019,91(14):9300-9307.
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三、对本发明制备的免疫传感器的性能评价
3.1)特异性分析
特异性是构建传感器进行免疫分析的关键参数。在相同的实验条件下，使用牛血清白蛋白(BSA)、前白蛋白(PA)、前列腺特异性抗原(PSA)、EB病毒核抗原1(EBNA-1)和EB病毒衍生的潜伏膜蛋白1(LMP-1)等几种可能存在的干扰物质对本方法的特异性进行了检测。用构建的免疫传感器对含有干扰物质(2ng mL-1)的cTnI溶液(1ng mL-1)进行检测，结果如图10所示。当cTnI单独存在或与这些干扰因素共存时的电流响应没有明显的信号变化，表明该传感器对cTnI有良好的特异性。
3.2)重复性分析
生物传感器的重复性在生物分析中起着重要的作用。在相同的实验条件下，对五个不同电极进行三次平行试验，计算出结果的相对标准偏差(RSD)，来评估所提出的免疫传感器的重复性(图11)。结果显示RSD为0.771％，表明该方法具有优异的重复性。
3.3)稳定性分析
此外，将构建的生物传感器在4℃的PBS中黑暗保存，每隔两天检测。保存8天后，电流响应保留了初始值的97.34％(图12)。结果表明，该免疫传感器对cTnI的检测具有较好的储存稳定性。
3.4)回收试验
采用加标回收试验研究了该免疫传感器临床应用的可行性。在正常人血清样品加入不同浓度的0.05、0.5和1ng ml-1的cTnI。由表2结果可知，三种浓度cTnI的RSD分别为0.79％、5.79％、4.02％，回收率分别为100.38％、100.75％、98.64％。结果表明，该免疫传感器对实际血清中cTnI的定量检测具有很大的潜力。
表2实际样本的检测
Figure BDA0002991037780000141
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)对裸金电极进行前处理；
(2)将8μL浓度为1mg mL-1的CMK-3滴加到处理好的裸金电极表面，并在室温下干燥4h；
(3)在上述电极表面滴加8μL的AuNPs胶体溶液，并在室温下干燥2h；
(4)然后将8μL，浓度为25μg mL-1的捕获抗体Ab1溶液滴加到步骤(3)得到的电极表面，放置于温度为37℃下孵育2h；
(5)将8μL，质量分数为0.25％的牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育10-50min；
(6)模拟加样，将8μL不同浓度梯度的cTnI溶液滴加到步骤(5)得到的电极表面，并在温度为37℃下孵育1h，使目标蛋白cTnI与修饰电极上的Ab1通过抗原-抗体反应结合；
(7)最后将8μL的PdPt-PMB-Ab2结合物滴加到步骤(6)得到的电极表面，在温度为37℃下孵育1h，在目标物cTnI存在下，通过抗原-抗体反应形成由Ab1、cTnI和PdPt-PMB-Ab2组成的三明治型免疫复合物，即可。
2.根据权利要求1所述的检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述AuNPs胶体溶液的制备方法如下：
(a1)首先，将100mL，质量分数为0.01％的HAuCl4溶液在连续搅拌下加热至沸腾15min；
(a2)然后将1mL，质量分数为2％的新鲜制备的柠檬酸三钠溶液逐滴滴加至上述溶液中，继续搅拌15min，观察到溶液颜色由淡黄色变为酒红色，即可；
(a3)冷却至25℃后，将上述AuNPs胶体溶液在4℃下储存到棕色烧瓶中，以备后续使用。
3.根据权利要求1所述的检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述PdPt-PMB-Ab2结合物的制备方法如下：
(b1)首先将0.1M，600μL的HCl和1.14mM，6mL的DTAB加入到9.8mM，0.5mL的MB溶液中，剧烈搅拌10min后形成胶束混合物；
(b2)然后将4wt％，100μL的H2PdCl4和4wt％，100μL的H2PtCl6加入至上述混合物中，并在室温下连续搅拌8h，得到PdPt-PMB复合材料，并在转速为8000rpm下离心10min后，洗涤；
(b3)将上述PdPt-PMB复合材料重新分散于10mM，2mL的PBS中，然后在温度为4℃下避光保存；
(b4)将200μL上述PdPt-PMB复合材料与4-12μL的检测抗体Ab2混合，并在温度为4℃下进行搅拌12h，离心和洗涤；
(b5)最后，将上述PdPt-PMB-Ab2悬浮于10mM，1mL的PBS中，并保存在温度为4℃下的黑暗环境中以备日后使用。
4.根据权利要求3所述的检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述PBS的pH值为4.5-8。
5.根据权利要求3所述的检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述Ab2的体积为10μL。
6.根据权利要求1所述的检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中所述cTnI溶液的浓度分别为0ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL。
7.一种检测心肌肌钙蛋白I的免疫传感器，采用权利要求1-6任一所述的制备方法制得。
8.根据权利要求7所述的免疫传感器在定量检测心肌肌钙蛋白I中的应用。
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