CN105004859A - 一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Pd/V2O5/MWCNTs作为检测抗体标记物，制备一种检测肠癌肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器，利用Pd/V2O5/MWCNTs其优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器具有特异性强，灵敏度高和检出限低等优点。

Description

一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Pd/V2O5/MWCNTs作为检测抗体标记物，制备一种检测肠癌肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器，属于新型功能材料、免疫分析以及生物传感检测技术领域。
背景技术
肠癌是是胃肠道中常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率近年来明显上升。肠癌的早期诊断可以大大提高治愈率，提高患者的生存质量，在临床研究上，发展快速、简便、灵敏的检测肠癌肿瘤标志物方法是十分重要的。
目前已有的癌症标志物的临床检测方法很多,如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶标记免疫分析法、化学免疫发光分析法、时间分辨荧光免疫分析法等，但多数检测方法繁琐，操作复杂，费用昂贵，检出限高，因此，建立一种快速、简便、灵敏的检测方法具有重要意义。
免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特异性结合，使得它具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，因此本发明制备了一种应用二氧化锡掺杂的石墨烯、金纳米粒子作为基底材料和以Pd/V2O5/MWCNTs 为标记物的肠癌免疫传感器，实现了对肠癌肿瘤标志物的检测。
而构建电化学免疫传感器的关键有两点：其一是采用简单、快速、有效的方法将抗原抗体等生物分子固定在电极表面；其二是开发传感器的信号放大技术。
二氧化锡掺杂的石墨烯具有良好的导电性能，金纳米粒子、Pd及V2O5具有良好的催化性能，MWCNTs以其大的比表面积能够很好的固载抗体，能够加速电子传递，对于提高传感器灵敏度具有重要作用。
发明内容
本发明的目的之一是基于Pd/V2O5/MWCNTs作为检测抗体标记物，构建了一种快速超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将该夹心型电化学免疫传感器应用于肠癌肿瘤标志物的检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将6 μL、1.0~2.0 mg/mL的二氧化锡掺杂的石墨烯溶液滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；
（3）滴涂6 μL的金纳米粒子溶液于电极表面，晾干，超纯水冲洗，晾干；
（4）滴涂6 μL、8 ~ 12 μg/mL的肠癌肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液于电极表面， 4oC冰箱中干燥；
（5）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab1后，滴加将6 μL、质量分数为0.1~1.0%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4oC冰箱中晾干；
（6）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6 μL、0.1pg/mL~ 50 ng/mL的一系列不同浓度的肠癌肿瘤标志物抗原标准溶液于电极表面，室温孵化1h，超纯水清洗， 置于4oC冰箱中干燥；
（7）将6 μL、1 ~ 3 mg/mL的检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs/Ab2溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4oC冰箱中晾干，制得一种基于Pd/V2O5/ MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器。
2. 如权利要求1所述的一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，所述的二氧化锡掺杂的石墨烯、金纳米粒子溶液、检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液，其特征在于，制备步骤如下：
（1）二氧化锡掺杂的石墨烯的制备
取0.1g 干燥的氧化石墨烯分散在500 mL 超纯水中，超声90 min分散均匀，制得氧化石墨烯悬浊液；
将2.2 ~ 2.6 g 五水氯化锡溶解于20 mL 超纯水中，加入6 ~ 10 mL 的氧化石墨烯悬浊液混合，搅拌反应5 h后，以8000 r·min-1的转速下，离心分离，除去上清液，所得的固体在氩气保护下500oC加热2 h，制得二氧化锡掺杂的石墨烯；
（2）金纳米粒子溶液的制备
将4.0~4.2 mL、1% 氯金酸加入到95.8 mL超纯水中，边搅拌边加入10 mL、 38.8 mmol/L 的柠檬酸钠，在100oC下回流15 min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；
（3）检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
①Pd 纳米粒子溶液的制备
将100 ~ 110 mg聚乙烯吡咯烷酮PVP、170 ~ 190mg柠檬酸、34.4 mg氯化钯溶于3mL 乙醇和8 mL 超纯水的混合液中，80oC 下磁力搅拌3h，冷却至室温，加入6 ~ 10 mL苯甲醇离心，弃去上清液；用超纯水洗涤三次，倒掉上清液，剩余的黑色液体即为Pd 纳米粒子溶液；
②V2O5/MWCNTs的制备
将0.6~0.8g 多壁碳纳米管分散在40 mL硫酸和硝酸以H2SO4:HNO3=3:1的比例的混合溶液中，40oC反应2h ；冷却到室温，离心洗涤至溶液成中性， 50oC真空干燥，制得纯化的多壁碳纳米管；
将0.95~1.15g V2O5粉末溶于80mL、30%的双氧水，当形成红色的澄清溶液30 min 后，加入0.18 g 上述纯化的多壁碳纳米管，搅拌6 ~ 8h，陈化24h，形成胶态悬浊液；将上述悬浊液转移到聚四氟乙烯高压反应釜，恒温180oC 下反应72h；离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35oC真空干燥8h，制得黑色粉末V2O5/MWCNTs；
③Pd/V2O5/MWCNTs 的制备
将20~30 mg的V2O5/MWCNTs加入至Pd 纳米粒子溶液中，超声15min，磁力搅拌3h，离心，除去上清液，加入20 mL 乙酸，加热至60oC，反应30min，离心，除去上清液，无水乙醇洗3次，35oC真空干燥，制得Pd /V2O5/MWCNTs；
④Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
在2 mL、2~4 mg/mL的Pd/V2O5/MWCNTs溶液中，加入1~3 mL、8~12 μg/mL的肠癌肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs/Ab2溶液，4oC下保存备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器用于肠癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.6~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对肠癌肿瘤标志物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中加入10μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
4.如权利要求1所述的一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，所述肠癌肿瘤标志物选自下列之一：CA19-9和CA242。
本发明的有益成果
（1）本发明的发明人首次将Pd/V2O5/MWCNTs纳米粒子作为检测抗体标记物引入到肠癌肿瘤标志物的电化学免疫传感器的制备当中，利用Pd/V2O5/MWCNTs优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器具有高的灵敏度和宽的检测范围，检测CA19-9的线性范围为0.10pg/mL ~ 50ng/mL，检测限为0.020 pg/mL；检测CA242的线性范围为0.12pg/mL ~ 50 ng/mL，检测限为0.024pg/mL。
（2）利用具有良好催化效果的金纳米粒子，实现信号放大；二氧化锡杂化的石墨烯，可以提高比表面积和电子转移速率，实现了电化学信号的双重放大，进一步提高了传感器的灵敏度。
（3）使用完全相同的纳米材料和修饰方法，利用抗原与抗体的特异性结合，只需改变肠癌肿瘤标志物种类即可实现不同肠癌肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测，此方法操作简单，检测速度快，可在短时间内实现大量样品的测定，有利于肿瘤标志物传感器的商品化。
（4）将Pd/V2O5/MWCNTs纳米粒子与肠癌肿瘤标志物检测抗体直接孵化，在检测抗体的标记物中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的检测误差，简化了检测抗体标记物的制作步骤，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此
实施例1. 一种基于Pd/V2O5/ MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将6 μL、1.0 mg/mL的二氧化锡掺杂的石墨烯溶液滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；
（3）滴涂6 μL的金纳米粒子溶液于电极表面，晾干，超纯水冲洗，晾干；
（4）滴涂6 μL、8 μg/mL的肠癌肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液于电极表面， 4oC冰箱中干燥；
（5）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab1后，滴加将6 μL、质量分数为0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4oC冰箱中晾干；
（6）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6 μL、0.1pg/mL ~ 50 ng/mL的一系列不同浓度的肠癌肿瘤标志物抗原标准溶液于电极表面，室温孵化1h，超纯水清洗， 置于4oC冰箱中干燥；
（7）将6 μL、1 mg/mL的检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs/Ab2溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4oC冰箱中晾干，制得一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器。
实施例2. 一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将6 μL、1.5mg/mL的二氧化锡掺杂的石墨烯溶液滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；
（3）滴涂6 μL的金纳米粒子溶液于电极表面，晾干，超纯水冲洗，晾干；
（4）滴涂6 μL、10 μg/mL的肠癌肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液于电极表面， 4oC冰箱中干燥；
（5）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab1后，滴加将6 μL、质量分数为0.5%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4oC冰箱中晾干；
（6）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6 μL、0.1pg/mL ~ 50ng/mL的一系列不同浓度的肠癌肿瘤标志物抗原标准溶液于电极表面，室温孵化1h，超纯水清洗， 置于4oC冰箱中干燥；
（7）将6 μL、2 mg/mL的检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs/Ab2溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4oC冰箱中晾干，制得一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器。
实施例3. 一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将6 μL、2.0 mg/mL的二氧化锡掺杂的石墨烯溶液滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；
（3）滴涂6 μL的金纳米粒子溶液于电极表面，晾干，超纯水冲洗，晾干；
（4）滴涂6 μL、12 μg/mL的肠癌肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液于电极表面， 4oC冰箱中干燥；
（5）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab1后，滴加将6 μL、质量分数为1.0%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4oC冰箱中晾干；
（6）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6 μL、0.1pg/mL ~ 50 ng/mL的一系列不同浓度的肠癌肿瘤标志物抗原标准溶液于电极表面，室温孵化1h，超纯水清洗， 置于4oC冰箱中干燥；
（7）将6 μL、3 mg/mL的检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs/Ab2溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1 h，超纯水清洗干净，置于4oC冰箱中晾干，制得一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器。
实施例4. 构建肠癌肿瘤标志物免疫传感器的各种传感材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）二氧化锡掺杂的石墨烯的制备
取0.1g 干燥的氧化石墨烯分散在500 mL 超纯水中，超声90 min分散均匀，制得氧化石墨烯悬浊液；
将2.2 g 五水氯化锡溶解于20 mL 超纯水中，加入6 mL 的氧化石墨烯悬浊液混合，搅拌反应5 h后，以8000 r·min-1的转速下，离心分离，除去上清液，所得的固体在氩气保护下500oC加热2 h，制得二氧化锡掺杂的石墨烯；
（2）金纳米粒子溶液的制备
将4.0 mL、1% 氯金酸加入到95.8 mL超纯水中，边搅拌边加入10 mL、 38.8 mmol/ L 的柠檬酸钠，在100oC下回流15 min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；
（3）检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
①Pd 纳米粒子溶液的制备
将100 mg聚乙烯吡咯烷酮PVP、170 mg柠檬酸、34.4 mg氯化钯溶于3 mL 乙醇和8 mL 超纯水的混合液中，80oC下磁力搅拌3 h，冷却至室温，加入6 ~ 10 mL苯甲醇离心，弃去上清液；用超纯水洗涤三次，倒掉上清液，剩余的黑色液体即为Pd 纳米粒子溶液；
②V2O5/MWCNTs的制备
将0.6g 多壁碳纳米管分散在40 mL硫酸和硝酸以H2SO4:HNO3=3:1的比例的混合溶液中，40oC反应2 h ；冷却到室温，离心洗涤至溶液成中性，50oC真空干燥，制得纯化的多壁碳纳米管；
将0.95 g V2O5粉末溶于80mL、30%的双氧水，当形成红色的澄清溶液30 min 后，加入0.18 g 上述纯化的多壁碳纳米管，搅拌6 ~ 8 h，陈化24 h，形成胶态悬浊液；将上述悬浊液转移到聚四氟乙烯高压反应釜，恒温180oC 下反应72 h；离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35oC真空干燥8 h，制得黑色粉末V2O5/MWCNTs；
③Pd/V2O5/MWCNTs 的制备
将20 mg的V2O5/MWCNTs加入至Pd纳米粒子溶液中，超声15 min，磁力搅拌3 h，离心，除去上清液，加入20 mL 乙酸，加热至60oC，反应30 min，离心，除去上清液，无水乙醇洗3次，35oC真空干燥，制得Pd /V2O5/MWCNTs；
④Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
在2 mL、2 mg/mL的Pd/V2O5/MWCNTs溶液中，加入1 mL、8~12 μg/mL的肠癌肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs/Ab2溶液，4oC下保存备用。
实施例5. 构建肠癌肿瘤标志物免疫传感器的各种传感材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）二氧化锡掺杂的石墨烯的制备
取0.1 g 干燥的氧化石墨烯分散在500 mL 超纯水中，超声90 min分散均匀，制得氧化石墨烯悬浊液；
将2.4 g 五水氯化锡溶解于20 mL 超纯水中，加入8 mL 的氧化石墨烯悬浊液混合，搅拌反应5 h后，以8000 r·min-1的转速下，离心分离，除去上清液，所得的固体在氩气保护下500oC加热2 h，制得二氧化锡掺杂的石墨烯；
（2）金纳米粒子溶液的制备
将4.1 mL、1% 氯金酸加入到95.8 mL超纯水中，边搅拌边加入10 mL、 38.8 mmol/L 的柠檬酸钠，在100oC下回流15 min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；
（3）检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
①Pd 纳米粒子溶液的制备
将105 mg聚乙烯吡咯烷酮PVP、180 mg柠檬酸、34.4 mg氯化钯溶于3 mL 乙醇和8 mL 超纯水的混合液中，80oC 下磁力搅拌3 h，冷却至室温，加入6 ~ 10 mL苯甲醇离心，弃去上清液；用超纯水洗涤三次，倒掉上清液，剩余的黑色液体即为Pd 纳米粒子溶液；
②V2O5/MWCNTs的制备
将0.7 g 多壁碳纳米管分散在40 mL硫酸和硝酸以H2SO4:HNO3=3:1的比例的混合溶液中，40oC反应2 h ；冷却到室温，离心洗涤至溶液成中性，50oC真空干燥，制得纯化的多壁碳纳米管；
将1.05 g V2O5粉末溶于80 mL、30%的双氧水，当形成红色的澄清溶液30 min 后，加入0.18 g 上述纯化的多壁碳纳米管，搅拌6 ~ 8 h，陈化24 h，形成胶态悬浊液；将上述悬浊液转移到聚四氟乙烯高压反应釜，恒温180oC 下反应72 h；离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35oC真空干燥8 h，制得黑色粉末V2O5/MWCNTs；
③Pd/V2O5/MWCNTs 的制备
将25 mg的V2O5/MWCNTs加入至Pd 纳米粒子溶液中，超声15 min，磁力搅拌3 h，离心，除去上清液，加入20 mL 乙酸，加热至60oC，反应30 min，离心，除去上清液，无水乙醇洗3次，35oC真空干燥，制得Pd/V2O5/MWCNTs；
④Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
在2 mL、3 mg/mL的Pd/V2O5/MWCNTs溶液中，加入2 mL、8~12 μg/mL的肠癌肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs/Ab2溶液，4oC下保存备用。
实施例6. 构建肠癌肿瘤标志物免疫传感器的各种传感材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）二氧化锡掺杂的石墨烯的制备
取0.1 g 干燥的氧化石墨烯分散在500 mL 超纯水中，超声90 min分散均匀，制得氧化石墨烯悬浊液；
将2.6 g 五水氯化锡溶解于20 mL 超纯水中，加入10 mL 的氧化石墨烯悬浊液混合，搅拌反应5 h后，以8000 r·min-1的转速下，离心分离，除去上清液，所得的固体在氩气保护下500oC加热2 h，制得二氧化锡掺杂的石墨烯；
（2）金纳米粒子溶液的制备
将4.2 mL、1% 氯金酸加入到95.8 mL超纯水中，边搅拌边加入10 mL、 38.8 mmol/L 的柠檬酸钠，在100oC下回流15 min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；
（3）检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
①Pd 纳米粒子溶液的制备
将110 mg聚乙烯吡咯烷酮PVP、190 mg柠檬酸、34.4 mg氯化钯溶于3 mL 乙醇和8 mL 超纯水的混合液中，80oC 下磁力搅拌3h，冷却至室温，加入6 ~ 10 mL苯甲醇离心，弃去上清液；用超纯水洗涤三次，倒掉上清液，剩余的黑色液体即为Pd 纳米粒子溶液；
②V2O5/MWCNTs的制备
将0.8 g 多壁碳纳米管分散在40 mL硫酸和硝酸以H2SO4:HNO3=3:1的比例的混合溶液中，40oC反应2 h ；冷却到室温，离心洗涤至溶液成中性，50oC真空干燥，制得纯化的多壁碳纳米管；
将1.15 g V2O5粉末溶于80 mL、30%的双氧水，当形成红色的澄清溶液30 min 后，加入0.18 g 上述纯化的多壁碳纳米管，搅拌6 ~ 8 h，陈化24 h，形成胶态悬浊液；将上述悬浊液转移到聚四氟乙烯高压反应釜，恒温180oC 下反应72h；离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35oC真空干燥8h，制得黑色粉末V2O5/MWCNTs；
③Pd/V2O5/MWCNTs 的制备
将30 mg的V2O5/MWCNTs加入至Pd 纳米粒子溶液中，超声15min，磁力搅拌3h，离心，除去上清液，加入20 mL 乙酸，加热至60oC，反应30min，离心，除去上清液，无水乙醇洗3次，35oC真空干燥，制得Pd/V2O5/MWCNTs；
④Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
在2 mL、4 mg/mL的Pd/V2O5/MWCNTs溶液中，加入3 mL、8~12 μg/mL的肠癌肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs/Ab2溶液，4oC下保存备用。
实施例7. 所构建的免疫传感器，用于肠癌肿瘤标志物CA19-9的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.6~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对肠癌肿瘤标志物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中加入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）根据所得电流强度与CA19-9浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得其线性范围为0.10pg/mL ~ 50ng/mL，检测限为0.020 pg/mL。
实施例8. CA242的检测
绘制工作曲线步骤同实施例7，按照绘制工作曲线的方法进行CA242样品分析，测得线性范围为0.12pg/mL ~ 50 ng/mL，检测限为0.024pg/mL。

Claims (4)

1.一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径为3~5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）将6μL、1.0~2.0 mg/mL的二氧化锡掺杂的石墨烯溶液滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；
（3）滴涂6 μL的金纳米粒子溶液于电极表面，晾干，超纯水冲洗，晾干；
（4）滴涂6 μL、8 ~ 12 μg/mL的肠癌肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液于电极表面，4oC冰箱中干燥；
（5）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab1后，滴加将6 μL、质量分数为0.1~1.0%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4oC冰箱中晾干；
（6）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6 μL、0.1 pg/mL ~ 50 ng/mL的一系列不同浓度的肠癌肿瘤标志物抗原标准溶液于电极表面，室温孵化1h，超纯水清洗， 置于4oC冰箱中干燥；
（7）将6 μL、1 ~ 3 mg/mL的检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4oC冰箱中晾干，制得一种基于Pd/V2O5/ MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，所述的二氧化锡掺杂的石墨烯、金纳米粒子溶液、检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液，其特征在于，制备步骤如下：
（1）二氧化锡掺杂的石墨烯的制备
取0.1 g 干燥的氧化石墨烯分散在500 mL 超纯水中，超声90 min分散均匀，制得氧化石墨烯悬浊液；
将2.2 ~ 2.6 g 五水氯化锡溶解于20 mL 超纯水中，加入6 ~ 10 mL 的氧化石墨烯悬浊液混合，搅拌反应5 h后，以8000 r·min-1的转速下，离心分离，除去上清液，所得的固体在氩气保护下500oC加热2 h，制得二氧化锡掺杂的石墨烯；
（2）金纳米粒子溶液的制备
将4.0~4.2 mL、1% 氯金酸加入到95.8 mL超纯水中，边搅拌边加入10 mL、 38.8 mmol/L 的柠檬酸钠，在100oC下回流15 min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子溶液；
（3）检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
①Pd 纳米粒子溶液的制备
将100 ~ 110 mg聚乙烯吡咯烷酮PVP、170 ~ 190 mg柠檬酸、34.4 mg氯化钯溶于3 mL乙醇和8 mL超纯水的混合液中，80oC下磁力搅拌3h，冷却至室温，加入6 ~ 10 mL苯甲醇离心，弃去上清液；用超纯水洗涤三次，倒掉上清液，剩余的黑色液体即为Pd 纳米粒子溶液；
②V2O5/MWCNTs的制备
将0.6~0.8 g 多壁碳纳米管分散在40 mL硫酸和硝酸以H2SO4:HNO3=3:1的比例的混合溶液中，40oC反应2h ；冷却到室温，离心洗涤至溶液成中性，50oC真空干燥，制得纯化的多壁碳纳米管；
将0.95~1.15 g V2O5粉末溶于80 mL、30%的双氧水，当形成红色的澄清溶液30 min 后，加入0.18 g 上述纯化的多壁碳纳米管，搅拌6~ 8 h，陈化24 h，形成胶态悬浊液；将上述悬浊液转移到聚四氟乙烯高压反应釜，恒温180oC 下反应72 h；离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35oC真空干燥8 h，制得黑色粉末V2O5/MWCNTs；
③Pd/V2O5/MWCNTs 的制备
将20~30 mg的V2O5/MWCNTs加入至Pd 纳米粒子溶液中，超声15 min，磁力搅拌3 h，离心，除去上清液，加入20 mL 乙酸，加热至60oC，反应30 min，离心，除去上清液，无水乙醇洗3次，35oC真空干燥，制得Pd/V2O5/MWCNTs；
④Pd/V2O5/MWCNTs /Ab2溶液的制备
在2 mL、2~ 4 mg/mL的Pd/V2O5/MWCNTs溶液中，加入1~3 mL、8~12 μg/mL的肠癌肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4oC恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Pd/V2O5/MWCNTs/Ab2溶液，4oC下保存备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器用于肠癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.6~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对肠癌肿瘤标志物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中加入10μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
4.如权利要求1所述的一种基于Pd/V2O5/MWCNTs的肠癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，所述肠癌肿瘤标志物选自下列之一：CA19-9和CA242。
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