CN103472123B - 基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法 - Google Patents

Abstract

基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，包括以下步骤：①以免疫电极或者核酸适配体电极为工作电极，在空气中接上电化学仪器并预先施加能够实现金属标记物的金属离子电沉积的阴极电位，再将小体积释放剂添加至该工作电极表面，并导通电解池，使金属标记物溶解释放出金属离子，并继续被电还原成原子态金属，从而在该工作电极表面富集上金属层；②直接在原工作电极表面，使用阳极溶出伏安法获得该工作电极上所富集到的金属层的阳极溶出电流信号，从而间接实现样品中目标分析物的定量分析。本发明可用于基于生物亲和、金属标记和阳极溶出伏安法的单目标分析物检测与多目标分析物多通道检测。

Description

基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法

技术领域

本发明涉及一种基于金属标记和生物亲和的电化学定量分析方法，具体地说，是涉及一种基于生物亲和（如免疫、核酸适配体等生物亲和类型）、金属标记和阳极溶出伏安分析法对样品中目标分析物进行定量分析的方法。

背景技术

近年来，免疫分析和核酸适配体分析等基于生物亲和原理的生物分析技术发展迅速，已广泛应用于健康和环保等领域[D.W.Kimmel,G.LeBlanc,M.E.Meschievitz,andD.E.Cliffel,Anal.Chem.2012,84,685-707]。可以这样认为，对于指定免疫对的免疫分析法，因免疫体系具有优良的特异识别特性而呈现出极好的选择性，故提高免疫分析的灵敏度已成为创新免疫分析法的关键切入点。因免疫检测对象（如蛋白质）大都没有显著分析信号的直接输出，采用信号输出大的标记物进行免疫标记已成为免疫分析中的重要策略[X.Yu,B.Munge,V.Patel,G.Jensen,A.Bhirde,J.D.Gong,S.N.Kim,J.Gillespie,J.S.Gutkind,F.Papadimitrakopoulos,J.F.Rusling,J.Am.Chem.Soc.2006,128,11199-11205]。迄今为止，免疫标记采用分子标记物（如酶标记物）和纳米标记物。酶标记物主要是利用酶的高效催化反应特性，将免疫分析物转换成可测的酶反应底物或产物而予以灵敏检出。纳米材料如金、银等金属纳米材料、金属硫化物（或金属硒化物、金属碲化物）等量子点（QDs）、金属氧化物纳米材料、纳米硅和纳米碳具有独特的光学、电学、电化学、催化和力学性质，用于免疫标记亦可得到高敏的免疫信号输出[W.W.Zhao,Z.Y.Ma,P.P.Yu,X.Y.Dong,J.J.Xu,H.Y.Chen,Anal.Chem.2012,84,917-923]。三明治型免疫电分析是重要的免疫分析实验模式，应用广泛。例如，要实现抗原的三明治型免疫电分析，可在电极上修饰一抗，再免疫结合抗原，再免疫结合标记的二抗，即得到三明治型免疫复合物修饰的免疫电极。金属免疫电分析法采用金属（及其化合物的）纳米材料作为标记物，这些标记物可通过阳极溶出伏安法进行灵敏检测。金标银染在可视化免疫分析中已得到实际应用，在免疫电分析研究中也备受关注。例如，Chu等用纳米金标记的抗体催化银沉积后，用酸将银溶出，再转移到含有电解质溶液的电解池中，用阳极溶出伏安法进行检测[X.Chu,X.Fu,K.Chen,G.L.Shen,R.Q.Yu,Biosens.Bioelectron.2005,20,1805-1812]。类似地，金属半导体量子点既可用于体内外标记、生物光分析和生物光学成像，亦可用于免疫电分析[R.Gill,M.Zayats,I.Willner,Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,7602-7625]。例如，Lu等将量子点标记的免疫电极表面的生物复合物先用酸溶解再转移，进行电化学检测[D.L.Lu,J.Wang,L.M.Wang,D.Du,C.Timchalk,R.Barry,Y.H.Lin,Adv.Funct.Mater.2011,21,4371-4378]。然而，以往免疫电分析法通常采用先溶解金属标记物再转移溶液进行伏安分析的策略，这样，不可避免的溶液稀释限制了金属免疫电分析的检测灵敏度，溶液的更换也加大了实验操作的繁复性。

金属标记的核酸适配体电分析也同样面临着这些问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，该方法可以最大化地将金属标记物转换成为可测信号，对样品中的目标分析物（如蛋白质）进行定量分析，并且通用性好，操作简便。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，包括以下步骤：

①以免疫电极或者核酸适配体电极为工作电极，在空气中接上电化学仪器并预先施加能够实现金属标记物的金属离子电沉积的阴极电位，再将小体积释放剂添加至免疫电极或者核酸适配体电极表面，并导通电解池，使金属标记物溶解释放出金属离子，并继续被电还原成原子态金属，从而在免疫电极或者核酸适配体电极表面富集上金属层；

②直接在原工作电极表面，使用阳极溶出伏安法获得该工作电极上所富集到的金属层的阳极溶出电流信号，从而间接实现样品中目标分析物的定量分析。

进一步，所述释放剂为能溶解金属标记物的酸。所述小体积释放剂为1mL~10mL体积的能溶解金属标记物的酸。

进一步，所述酸的浓度为1mmol/L稀酸~浓酸。

进一步，所述酸可为硝酸、硫酸、盐酸、高氯酸、氢氟酸、醋酸或磷酸。

进一步，所述酸优选硝酸，硝酸的浓度优选0.01mol/L~6mol/L。溶解银纳米粒子的硝酸浓度优选1mol/L，溶解硫化镉量子点的硝酸浓度优选0.06mol/L。

进一步，所述金属标记物的生物复合物的制备步骤为：将金属纳米粒子、金属硫化物纳米粒子、金属氧化物纳米粒子、金属硒化物纳米粒子或金属碲化物纳米粒子与生物配体结合，形成生物复合物，所述生物复合物对样品中目标分析物具有生物亲和性。

进一步，所述生物配体为抗原或抗体，或蛋白质，或核酸适配体。例如，可以将金属纳米粒子与抗体或抗原结合，形成生物复合物；再将待测的抗体或抗原与该生物复合物结合，形成免疫电极。也可以是，将金属纳米粒子与核酸适配体结合，形成生物复合物，再将待测的凝血酶与该生物复合物结合，形成核酸适配体电极。

进一步，所述空气中预先施加的能够实现金属标记物的金属离子电沉积的阴极电位为足够实现扩散控制的金属电沉积的阴极电位。所述足够实现扩散控制的金属电沉积的阴极电位为1.0V（vs.SCE）～-2.0V（vs.SCE）。“vs.SCE”意为相对于饱和甘汞电极的电位。

进一步，使用阳极溶出伏安法对金属离子进行定量分析时，采用2组或2组以上电极，每组电极之间形成一个测量通道；每组电极为两电极或三电极体系。

进一步，所述目标分析物可为蛋白质。

本发明的有益效果：（1）阴极电位的预先施加，小体积的释放剂如酸溶解液的使用，促使金属沉积扩散层的厚度趋于最小化，这样，金属标记物能以最大的富集效率被“捕获”到工作电极表面，因而显著改善了电化学信号输出，极大地提高了检测灵敏度；（2）在免疫电极或核酸适配体电极原位的微量溶液中，进行阳极溶出伏安分析，减小了常规法中转移过程中分析信号的损失，并且简化了操作步骤。

经实验证明，本发明与常规法相比，本发明的金属标记物的阴极富集效率可提高82倍左右。对人免疫球蛋白（hIgG）、癌胚抗原（hCEA）、甲胎蛋白（hAFP）和凝血酶的分析检测实验表明，本发明具有跨7个数量级左右的宽线性范围，检测下限低至fg/mL或fmol/L浓度级，显著优于文献报道值。本发明用于实际样品检测亦获满意结果。本发明用于电极组多通道同时检测，也同样获得很好的效果。

附图说明

图1为本发明方法的实验步骤示意图。

图2（A1）为实施例1中本发明方法在金纳米颗粒（AuNPs）标记的hIgG免疫电极上，采用差分脉冲阳极溶出伏安法检测标准样品的原图。

图2（A2）为实施例1中常规方法在金纳米颗粒（AuNPs）标记的hIgG免疫电极上，采用差分脉冲阳极溶出伏安法检测标准样品的原图。

图2（A3）为实施例1中本发明方法（A3-1）和常规方法（A3-2）在金纳米颗粒（AuNPs）标记的hIgG免疫电极上检测得到的标准曲线图。

图2（B1）为实施例1中本发明方法在CdSQDs标记的hIgG免疫电极上，采用差分脉冲阳极溶出伏安法检测标准样品的原图。

图2（B2）为实施例1中常规方法在CdSQDs标记的hIgG免疫电极上，采用差分脉冲阳极溶出伏安法检测标准样品的原图。

图2（B3）为实施例1中本发明方法（B3-3）和常规方法（B3-4）在CdSQDs标记的hIgG免疫电极上检测得到的标准曲线图。

图3（A）为实施例2中本发明法采用AuNPs标记的核酸适配体电极上检测标准样品的原图。

图3（B）为实施例2中本发明法采用AuNPs标记的核酸适配体电极上检测标准曲线图。

图3（C）为实施例2中常规方法采用CdSQDs标记的核酸适配体电极上检测标准样品的原图。

图3（D）为实施例2中常规方法采用CdSQDs标记的核酸适配体电极上检测标准曲线图。

图4为丝网印刷电极的模型图。其中C1和C2为对电极，R1和R2为参比电极，W1和W2为工作电极。

图5（A）为实施例3中采用金标银染的癌胚抗原（hCEA）免疫电极组及本发明方法测得的标准曲线图。

图5（B）为实施例3中采用金标银染的甲胎蛋白（hAFP）免疫电极组及本发明方法测得的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

参考例：

1.以下实施例1使用的免疫电极和纳米材料按照以下方法制备：

实施例1使用的金纳米粒子（AuNPs）标记的二抗、CdS量子点（CdSQDs）标记的二抗（Ab₂-CdS）、免疫电极按照下述方法制备：

（1）AuNPs标记的二抗的制备（Ab₂-AuNPs）：在100mL沸水中，剧烈搅拌下，加入250mL4%（质量浓度）的HAuCl₄，再逐滴滴加1%（质量浓度）的柠檬酸钠2.5mL，当溶液变成酒红色后，再加热15min。停止加热后，搅拌冷却至室温。在1mL的金胶中加入30mg的二抗（Ab₂），吸附过夜。4800rpm低速离心30min后，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两次。最后，结合物再次分散在含有1%牛血清白蛋白（BSA）的1mL0.1mol/LPBS中，增加免疫金胶的稳定性，减小分析中的非特异性吸附。未使用时，制备的Ab₂-AuNPs保存于冰箱（4^oC）中。

（2）CdSQDs（CdS纳米粒子）标记的二抗的制备（Ab₂-CdS）：向50mL烧杯中依次加入10mL0.01mol/LCd(CH₃COO)₂溶液和5mL0.01mol/LCH₃CSNH₂溶液，混合均匀，再缓慢滴加0.3mL0.1mol/L六偏磷酸钠溶液作为稳定剂。然后用0.1mol/LNaOH溶液调节初始pH值为9.5，在滴加NaOH溶液的同时剧烈搅拌，反应约1h左右，有淡黄色的CdS纳米粒子溶胶生成。1h后，向乳黄色的溶胶中加入2.5mL的0.70mg/L半胱氨酸溶液，置入容量瓶中，放置24h后备用。取1.5mL功能性CdS纳米粒子于试管中，向其加入50mL0.10mol/L的EDC-HCl（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）和50mL0.10mol/L的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），室温下反应1h后，用缓冲液彻底地清洗以除去过量的EDC和NHS。接着，在试管中加入20mL1mg/mL二抗于4^oC下反应20h，用缓冲液清洗除去物理吸附的抗体。然后，在试管中加入150mL3%BSA，4^oC下2h，封闭非特异性结合位点。未使用时，制备的Ab₂-CdS保存于冰箱（4^oC）中。

（3）免疫电极的制备：玻碳电极（GCE）先后在0.5和0.05mm的氧化铝悬浊液中打磨抛光处理，再用超纯水充分地冲洗电极表面，接下来分别在超纯水、乙醇、超纯水中各超声5min以除去电极表面残留的氧化铝粉末；然后，在电极表面滴加浓H₂SO₄洗液并保持15s，用超纯水冲洗；最后用电化学清洗以彻底除去污染物。电化学清洗步骤为：在10mL0.50mol/LH₂SO₄中以-1.0V到1.0V以0.1V/s的扫速循环伏安扫描至稳定。处理好的玻碳电极用大量水冲洗，然后用氮气吹干用于电沉积Au_plate。

通过双电位阶跃法将Au_plate沉积到处理好的玻碳电极上，即在含有2.0mmol/LHAuCl₄的0.50mol/LH₂SO₄中，从1.1V至0V脉冲电镀180s（Au_plate/GCE）即可。将电极洗净，氮气吹干，迅速将6.0??L含有1.0mg/mL一抗（Ab₁）的PBS溶液滴至Au_plate/GCE电极上，冰箱（4^oC）保存、过夜，以保证抗体在电极表面的饱和吸附，得到Ab₁/Au_plate/GCE修饰电极。将电极依次用PBS溶液清洗、吹干后，将6.0??L含有3%BSA的PBS溶液滴至电极上，4^oC保持1h以封闭非特异性吸附位点，得到BSA/Ab₁/Au_plate/GCE修饰电极。未使用时，电极保存在4^oC的PBS中。

将制备好的BSA/Ab₁/Au_plate/GCE修饰电极，滴加6.0??L含有5fg/mL、50fg/mL、500fg/mL、5pg/mL、50pg/mL、500pg/mL、5ng/mL、50ng/mL或500ng/mL不同浓度抗原（hIgG，人免疫球蛋白G）的PBS，在37^oC下温育1h，然后用PBS溶液清洗电极表面，得到hIgG/BSA/Ab₁/Au_plate/GCE修饰电极，该修饰电极上再滴加6mL含Ab₂-AuNPs或Ab₂-CdS的PBS溶液于37^oC下温育40min，得到Ab₂-AuNPs/hIgG/BSA/Ab₁/Au_plate/GCE或Ab₂-CdS/hIgG/BSA/Ab₁/Au_plate/GCE电极。（Ab₁、Ab₂为羊抗人免疫球蛋白G）。

免疫电极的金标银染步骤如下：Ab₂-AuNPs/hIgG/BSA/Ab₁/Au_plate/GCE电极用PBS溶液充分清洗，以除去非特异性吸附的二抗，待干后，滴加6.0mL的银增强溶液（组分：1.0g对苯二酚，35mg硝酸银，50mLpH3.5柠檬酸缓冲液（0.243mol/LC₆H₈O₇×H₂O+0.163mol/LNa₃C₆H₅O₇×2H₂O）和50mL去离子水），暗反应30min，用超纯水洗净，吹干。

2.实施例2使用的核酸适配体电极按照以下方法制备：

实施例使用的AuNPs-核酸适配体I、CdS-核酸适配体I、核酸适配体电极按照下述方法制备：

（1）制备AuNPs-核酸适配体I：在500mLAuNPs溶液中滴加10mL100mmol/L巯基化凝血酶核酸适配体I，室温下混合4h后，加入PBS反应16h。1000rpm离心15min，随后用BSA封闭非特异性吸附位点，用Tris-HCl充分洗涤，储存于冰箱中（4^oC）备用。

（2）制备CdS-核酸适配体I：在半胱氨酸修饰的CdS溶液中依次加入10mmol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺碳二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）；反应1h以激活-COOH官能团，加入1mmol/L核酸适配体I，反应24h以使含胺基的核酸适配体I通过酰胺反应固定至CdS表面；最后，将所得CdS-核酸适配体I用Tris-HCl充分洗涤，储存于冰箱中（4^oC）备用。

（3）制备金标银染的三明治型凝血酶核酸适配体电极：纳米金标记的核酸适配体电极的制备。玻璃碳电极的处理与实施例1一致，将10mL1mmol/L的巯基化凝血酶核酸适配体II溶液滴于Au_plate/GCE电极上，反应16h；接下来用100mmol/L的BSA溶液（Tris-HCl缓冲液配制）封闭电极上的非特异性吸附位点；随后将所制电极在1fmol/L、3fmol/L、5fmol/L、10fmol/L、100fmol/L、1pmol/L、10pmol/L、100pmol/L、1nmol/L或10nmol/L不同浓度的凝血酶溶液（Tris-HCl缓冲液配制）中温育2h；最后将制备的电极浸入AuNPs-核酸适配体I溶液中温育2h，得到的电极银染30min（金标银染步骤同前）。每一步骤后，均用PBS彻底清洗电极并用氮气小心吹干。

（4）制备量子点标记的核酸适配体电极。将2.5mL0.25%的壳聚糖滴于玻璃碳电极（GCE）上，干燥后滴加2.5mL2.5%的戊二醛反应2h，然后滴加10mL1mmol/L氨基修饰的核酸适配体II进行反应60min，然后置于冰箱中过夜；接下来用100mmol/L的BSA溶液（Tris-HCl缓冲液配制）封闭电极上的非特异性吸附位点；随后将所制电极在1fmol/L、3fmol/L、5fmol/L、10fmol/L、100fmol/L、1pmol/L、10pmol/L、100pmol/L、1nmol/L或10nmol/L不同浓度的凝血酶溶液（Tris-HCl缓冲液配制）中温育2h；最后将制备的电极浸入CdS-核酸适配体I溶液中温育2h，得到所需核酸适配体电极。每一步骤后，均用PBS彻底清洗电极并用氮气小心吹干。

3.实施例3使用的免疫电极组按照以下方法制备：

与实施例1中金标银染免疫电极制备过程相同，抗原抗体分别为人癌胚抗原（hCEA）和人甲胎蛋白（hAFP）即对应的抗体。反应过程中滴加的不同浓度抗原均为4fg/mL、40fg/mL、400fg/mL、4pg/mL、40pg/mL、400pg/mL、4ng/mL、40ng/mL或400ng/mL。工作电极为图4所示的几何面积为2mm²的丝网印刷碳电极，用双通道同时进行检测。各通道分别采用三电极系统检测。

实施例1：免疫电分析

本实施例为基于免疫亲和、金属标记和阳极溶出伏安法的检测目标分析物hIgG的电分析，比较本发明方法与常规检测方法在免疫电极中的响应。

本实施例包括以下步骤：

1.金标银染免疫分析：

（1）本发明方法：①在三电极系统中（工作电极为上述参考例中的金标银染的免疫电极），空气中接上电化学仪器并预先施加能够充分实现金标银染的金属Ag离子电沉积的阴极电位-0.3V（vs.SCE），再将8mL1mol/LHNO₃加至免疫电极表面并导通电解池，使金属标记物溶解为Ag⁺，并同时将Ag⁺电还原成原子态金属Ag，从而在免疫电极表面富集上金属银。②直接在原工作电极表面，使用差分脉冲阳极溶出伏安法（DPV）检测金属银阳极溶出为银离子的信号，检测条件为：-0.3V(vs.SCE（饱和甘汞电极）)沉积10min，扫描区间为-0.3~0.7V，获得该工作电极上所富集到的金属银的阳极溶出电流信号，从而间接实现样品中目标分析物hIgG的定量分析。

（2）常规检测法：①在上述参考例中的金标银染的免疫电极上，滴加8mL1mol/LHNO₃溶解电极表面的金属银，使金属银溶解为Ag⁺，反应30min待金属银全部溶解后，将溶液转移到含有0.1mol/L的KNO₃和0.6mol/LHNO₃、体积为992mL电解质溶液中。②连接好线路，固定烧杯以及各电极、磁力搅拌子的位置，用Au_plate/GCE电极对溶解得到的银离子进行DPV定量，检测条件为：-0.3V(vs.SCE（饱和甘汞电极）)沉积10min（溶液前面搅拌，后50s溶液静置），扫描区间为-0.3~0.7V。每次测量后，电极在+1.0V(vs.SCE)处极化2min，清洗电极。

2.CdSQDs标记的免疫分析：

（1）本发明方法：①在三电极系统中（工作电极为上述参考例中的CdSQDs标记的免疫电极），空气中接上电化学仪器并预先施加能够充分实现金属标记物的金属Cd离子电沉积的阴极电位-1.0V（vs.SCE），再将5mL0.06mol/LHNO₃加至免疫电极表面并导通电解池，使金属标记物溶解为Cd²⁺，并同时将Cd²⁺阴极还原成原子态金属Cd，从而在免疫电极表面富集上金属镉。②直接在原工作电极表面，使用差分脉冲阳极溶出伏安法（DPV）检测金属镉阳极溶出为Cd²⁺的信号，检测条件为：-1.0V(vs.SCE（饱和甘汞电极）)沉积500s，扫描区间为-1.0~-0.45V，获得该工作电极上所富集到的金属镉的阳极溶出电流信号，从而间接实现样品中目标分析物hIgG的定量分析。

（2）常规检测法：①在上述参考例中的CdSQDs标记的免疫电极上，滴加5mL0.06mol/LHNO₃溶解电极表面的CdSQDs，使CdSQDs溶解为Cd²⁺，待全部溶解为Cd²⁺后，将溶液转入含有995mL0.1mol/L的醋酸缓冲液（pH=4.5）的电解质溶液中。②连接好线路，固定烧杯以及各电极、磁力搅拌子的位置，用Au_plate/GCE电极对溶解得到的Cd²⁺进行DPV定量，检测条件为：在-1.0V(vs.SCE)电位下富集500s（前面搅拌，后50s溶液静置），每次测量后，电极在+0.6V(vs.SCE)处极化200s，清洗电极。

测定结果分析：结合图2进行讨论。图2给出了两种方法中两种不同标记物构建的免疫电极对不同浓度抗原的信号响应。从图中可知，随着抗原浓度增加，电流响应也随之增加；对于同一抗原浓度，本发明法的响应信号明显大于常规法。本发明中电流与抗原浓度线性范围为5fg/mL~500ng/mL，AuNPs和CdSQDs标记的检测限分别为1.2fg/mL和4.5fg/mL（信噪比为3），而常规方法检测线则分别为0.1pg/mL和0.4pg/mL。本发明方法线性范围宽，检测限低，显著优于常规检测方法。

实施例2：基于本发明方法的核酸适配体电分析

本实施例为基于核酸适配体亲和、金属标记和阳极溶出伏安法的检测凝血酶的电分析，用本发明的技术方案得到核酸适配体电极中的响应。

本实施例包括以下步骤：

样品测定：

1.金标银染的核酸适配体分析：

本发明方法：与实施例1中的“金标银染免疫分析”中的“本发明方法”的实施步骤相同。

2.CdSQDs标记的核酸适配体分析：

本发明方法：与实施例1中的“CdSQDs标记的免疫分析”中的“本发明方法”的实施步骤相同。

测定结果分析：结合图3进行讨论。图3给出了本发明方法所测的核酸适配体电极对不同浓度凝血酶的信号响应。从图中可知，随着凝血酶浓度增加，电流响应也随之增加，线性范围为1fmol/L~10nmol/L。金标银染和CdSQDs标记的核酸适配体分析得到的凝血酶浓度检测限分别为0.3fmol/L和0.9fmol/L（信噪比为3）。本发明方法检测金属标记的核酸适配体电极线性范围宽，检测限低。优于常规的检测方法。

实施例3：基于同时检测癌胚抗原(hCEA)和甲胎蛋白(hAFP)两种目标分析物的金标银染免疫电极组的本发明方法

样品测定：与实施例1中的“金标银染免疫分析”中的“本发明方法”的实施步骤相同。测试条件中添加释放剂5mL1mol/LHNO₃。

测定结果分析：结合图5进行讨论。图5给出了本发明基于电极组阳极溶出伏安法检测不同浓度抗原的金标免疫电极的信号响应标准曲线图。从图中可知，随着抗原浓度增加，电流响应也随之增加，hCEA和hAFP的线性范围为4fg/mL~400ng/mL，检测下限分别为2.8fg/mL和3.0fg/mL。本发明可用于多种分析物以及不同浓度的分析物的同时检测。方便快捷，节省时间，优于常规的检测方法。

综上所述，本发明涉及的分析方法灵敏度高、操作简便、通用性好，在实际血样中的检测结果令人满意，可广泛用于基于生物亲和、金属标记和阳极溶出伏安法的单目标分析物检测与多目标分析物多通道检测。

Claims (10)

1.基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

①以免疫电极或者核酸适配体电极为工作电极，在空气中接上电化学仪器并预先施加能够实现金属标记物的金属离子电沉积的阴极电位，再将小体积释放剂添加至该工作电极表面，并导通电解池，使金属标记物溶解释放出金属离子，并继续被电还原成原子态金属，从而在该工作电极表面富集上金属层；

②直接在原工作电极表面，使用阳极溶出伏安法获得该工作电极上所富集到的金属层的阳极溶出电流信号，从而间接实现样品中目标分析物的定量分析。

2.根据权利要求1所述基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，所述释放剂为能溶解金属标记物的酸。

3.根据权利要求2所述基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，所述酸的浓度为1mmol/L稀酸~浓酸。

4.根据权利要求2所述基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，所述能溶解金属标记物的酸为硝酸、硫酸、盐酸、高氯酸、氢氟酸、醋酸或磷酸。

5.根据权利要求4所述基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，所述硝酸的浓度为0.01mol/L~6mol/L。

6.根据权利要求1所述基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，所述小体积释放剂为1mL~10mL体积的能溶解金属标记物的酸。

7.根据权利要求1～6之一所述基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，所述金属标记物的生物复合物的制备步骤为：将金属纳米粒子、金属硫化物纳米粒子、金属氧化物纳米粒子、金属硒化物纳米粒子或金属碲化物纳米粒子与生物配体结合成生物复合物，所述生物配体为抗原或抗体，或蛋白质，或核酸适配体。

8.根据权利要求1～6之一所述基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，空气中预先施加的能够实现金属标记物的金属离子电沉积的阴极电位为足够实现扩散控制的金属电沉积的阴极电位。

9.根据权利要求8所述基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，所述足够实现扩散控制的金属电沉积的阴极电位为1.0V～-2.0V；所述电位为相对于饱和甘汞电极的电位。

10.根据权利要求1～6之一所述基于金属标记和生物亲和的原位阳极溶出伏安分析方法，其特征在于，使用阳极溶出伏安法对金属离子进行定量分析时，采用2组或2组以上电极，每组电极之间形成一个测量通道；每组电极为两电极或三电极体系。