WO2020000959A1 - 一种基于标记物标记的电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于标记物标记的电化学检测方法，该方法包括以下步骤：(1)标记物标记待测物的一株抗体；(2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体；(3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；(4)电化学检测过程。利用标记物的电化学特性以及电化学法对标记物检测的高度灵敏性，采用标记物标记免疫复合物并通过纳米微球收集免疫复合物，然后通过分离将带有免疫复合物的纳米微球富集于电极表面，大大提高了检测灵敏度，该方法稳定性高、重复性好、结果准确可靠，可实现快速、灵敏检测。

Description

一种基于标记物标记的电化学检测方法
本申请基于申请号为201810699669.2、申请日为2018年06月29日、的中国专利申请及申请号为201811037500.7、申请日为2018年09月06日提出，并要求该些中国专利申请的中国专利申请的优先权，该些中国专利申请的全部内容引入本申请作为参考。
技术领域
本发明属于医学检验领域，尤其是涉及一种基于标记物标记的电化学检测方法。
背景技术
电化学检测技术是近年来新兴的灵敏分析检测技术，是一种以不同方式的电信号作为激发与检测信号的分析检测技术。电化学检测技术由于其操作简单、灵敏度高和检测速度快等优势而备受青睐，已经在生命科学、生物科学、临床分析、环境监测以及表面科学等领域得到了广泛的研究与应用。
电化学传感器可实现经济、高效、实用、快速、灵敏、精确的检测与分析，是一种将电化学分析与传感技术结合所产生的一种传感器件，其检测原理是基于被测物质影响电极体系的电化学信号，从而实现对被测物质的定量分析。
目前的研究中金属离子作为标记物进行免疫检测通常采用质谱免疫分析法，采用电化学方法非常少。并且在目前的电化学检测方法中，一般采用伏安曲线图中特征物质的特征峰高来建立与待测物浓度的关系，而伏安曲线图容易受到检测环境的影响发生整体偏移，峰高的数值因此也受到不同的影响，导致检测的准确性降低。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种提高检测灵敏度，方法稳定性高、重复性好、结果快速准确可靠的基于标记物标记的电化学检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种基于标记物标记的电化学检测方法，包括以下步骤：
(1)在反应池中制备标记物标记的免疫复合物；
(2)通过分离的方式将标记物标记的免疫复合物富集到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，加注电解液；
(3)将电极连接到电化学工作站上，通过伏安法测定标记物的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出标记物的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用回归方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
进一步地，其中在步骤(3)中，所述特征峰位于金属离子理论特征峰的±100mV范围内；所述回归方程为Log-Log或Log-Logit回归方程。
进一步地，其中所述标记物标记的免疫复合物通过以下步骤制得：
(1)标记物标记待测物的一株抗体；
(2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体；
(3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
(4)将含有待测物的样本、标记物标记的待测物的一株抗体和具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体加入到反应池中，经过3～90min的温育反应，继续加入表面标记有具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，形成标记物标记的的免疫复合物；
或者为，
(1)标记物标记待测物的一株抗体；
(2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的完全抗原；
(3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
(4)将含有待测物的样本、标记物标记的待测物的一株抗体和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的完全抗原加入到反应池中，经过3～90min的温育反应，继续加入表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，形成标记物标记的的免疫复合物；
或者为，
(1)标记物标记待测物的完全抗原；
(2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的一株抗体；
(3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
(4)将含有待测物的样本、标记物标记的待测物的一株完全抗原和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的一株抗体加入到反应池中，经过3～90min的温育反应，继续加入表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，形成标记物标记的的免疫复合物。
进一步地，其中所述标记物为金属离子材料；所述电化学检测是采用三电极体系或二电极体系进行测定的。
进一步地，其中所述金属离子材料为表面或内部含有金属离子的微球；所述金属离子为Cd 2+、Cu 2+、Zn 2+、Mn 2+、Pb 2+、Ag +、Li +、Hg 2+、Co 2+、Cr 3+、Ni 2+、Au 3+、Ba 2+离子中的一种；所述微球为聚苯乙烯微球、聚四氟乙烯微球、二氧化钛微球、二氧化锰微球、二氧化锆微球、有机硅微球、聚酰胺微球、聚丙烯酸微球、壳聚糖微球、聚苯胺微球、聚氯乙烯微球、钴微球、镍微球、铂微球、金微球、银微球、钯微球、二氧化硅微球或磁性微球。
进一步地，其中所述纳米微球为聚苯乙烯微球、聚四氟乙烯微球、二氧化硅微球、二氧化钛微球、有机硅微球、聚酰胺微球、聚丙烯酸微球、壳聚糖微球、聚苯胺微球、聚氯乙烯微球或磁性微球。
进一步地，其中所述分离方式为离心分离、电场或毛细管作用；或者当纳米微球的材质为磁性微球时，则所述分离方式采用磁分离的方式；所述磁性微球为磁性的Fe 3O 4、γ-Fe 2O 3、Pt、Ni或Co微球，或者为磁性的Fe 3O 4、γ-Fe 2O 3、Pt、Ni或Co与无机物或有机物形成的核/壳结构或掺杂结构的微球。
进一步地，其中所述金属离子材料的粒径为1～500nm，所述纳米微球的粒径为50nm～5μm。
进一步地，其中在步骤(3)中，所述回归方程为四参数回归方程。
进一步地，其中所述标记物标记的免疫复合物通过以下步骤制得：
步骤一，标记物标记待测物的一株抗体或抗原；
步骤二，具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体；
步骤三，具有特异亲和性一对物质中的另一个标记磁性微球；
步骤四，将待测物、标记物标记的抗体或抗原和具有特异亲和性一对物质中的一个标记的抗体加入检测池中，进行温育反应，继续加入具有特异亲和性的一对物质中的另一个标记的磁性微球，形成标记物标记的免疫复合物；
或者为，
步骤一，标记物标记待测物的一株抗体或抗原；
步骤二，磁性微球标记待测物的另一株抗体；
步骤三，将待测物、标记物标记待测物的一株抗体或抗原和磁性微球标记待测物的另一株抗体加入到检测池中，进行温育反应，形成标记物标记的免疫复合物；
或者为，
步骤一，具有特异亲和性的一对物质中的一个标记待测物的一株抗体或抗原；
步骤二，磁性微球标记待测物的另一株抗体；
步骤三，标记物标记具有特异亲和性的一对物质中的另一个；
步骤四，将待测物、具有特异亲和性的一对物质中的一个标记待测物的一株抗体或抗原和磁性微球标记待测物的另一株抗体，加入检测池中，进行温育反应，继续加入标记物标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个，形成标记物标记的免疫复合物。
进一步地，其中所述标记物标记的免疫复合物包括标记物标记的一株抗体或抗原，磁性微球标记的 待测物的另一株抗体，和待测物。
进一步地，其中所述标记物标记的一株抗体或抗原通过具有特异亲和性的一对物质进行连接。
进一步地，其中所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结合此抗体的二抗；
进一步地，其中所述磁性微球标记的待测物的另一株抗体通过具有特异亲和性的一对物质进行连接。
进一步地，其中所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结合此抗体的二抗。
进一步地，其中所述标记物为金属氧化物材料；所述检测是采用四电极体系进行测定的。
进一步地，其中所述金属氧化物为氧化铜。
进一步地，其中所述氧化铜选自1)裸露的氧化铜纳米颗粒；或2)氧化铜表面包覆一层二氧化硅、二氧化钛、碳酸盐、硅酸盐、磷酸盐、碳化硅、石墨、氮化硅中的一种；或3)氧化铜表面包覆一层有机硅、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰亚胺、聚苯胺、聚吡咯、聚丙烯酸、壳聚糖、聚乳酸、环氧树脂、酚醛树脂、聚炔、聚酯、β-环糊精聚合物、维生素、三聚氰胺中的一种；所述抗体或抗原为待测物的抗体或抗原。
进一步地，其中所述四电极体系采用丝网印刷电极，分别为工作电极、内控电极、对电极和参比电极，所述丝网印刷电极插入检测池中，在检测池中对应丝网印刷电极中工作电极的下方设置磁铁。
进一步地，其中所述工作电极为铜电极、碳电极、玻碳电极、金微电极、石墨电极、银电极、铅电极，或者在上述电极里掺杂石墨烯或富勒烯的电极，或者在上述电极表面修饰、涂覆、掺杂或贴有石墨烯或富勒烯的电极；所述内控电极为铜电极、碳电极、玻碳电极、金微电极、石墨电极、银电极、铅电极，或者在上述电极里掺杂石墨烯或富勒烯的电极，或者在上述电极表面修饰、涂覆、掺杂或贴有石墨烯或富勒烯的电极；所述对电极为铂丝电极或碳电极；所述参比电极为甘汞电极、Ag/AgCl电极。
本发明还提供了一种基于金属离子标记的电化学检测方法，包括以下步骤：
(1)金属离子材料标记待测物的一株抗体；
(2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体；
(3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
(4)检测过程
①将含有待测物的样本、金属离子材料标记的待测物的一株抗体和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体加入到反应池中，经过3～90min的温育反应，形成一端标记有金属离子材料另一端标记有具有特异性亲和性的一对物质中的一个的免疫复合物；
②然后向步骤①反应后的混合物中加入表面标记有具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，步骤①中免疫复合物一端的具有特异亲和性的一对物质中的一个与标记在纳米微球表面的具有特异性亲和性一对物质中的另一个进行特异性结合，形成表面结合了步骤①中的免疫复合物的纳米微球；
③采用分离的方式将步骤②中表面结合了步骤①中的免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，加注电解液；
④采用三电极体系或二电极体系进行测定，将电极连接在电化学工作站上，利用电化学检测方法测定纳米微球表面的免疫复合物上金属离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中金属离子理论特征峰的±100mV范围内寻找实际特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Log回归方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
本发明进一步提供了一种基于金属离子标记的电化学检测方法，包括以下步骤：
(1)金属离子材料标记待测物的一株抗体；
(2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的完全抗原；
(3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
(4)检测过程
①将含有待测物的样本、金属离子材料标记的待测物的一株抗体和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的完全抗原加入到反应池中，待测物和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待 测物完全抗原竞争与金属离子材料标记的待测物的一株抗体发生免疫反应，经过3～90min的温育反应，形成一端标记金属离子材料另一端标记有具有特异性亲和性的一对物质中的一个的第一免疫复合物和一端标记有金属离子材料的第二免疫复合物；
②然后向步骤①反应后的混合物中加入表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，步骤①中第一免疫复合物一端的具有特异亲和性的一对物质中的一个与纳米微球表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个进行特异性结合，形成表面结合了第一免疫复合物的纳米微球，第二免疫复合物不参加反应；
③采用分离的方式将步骤②中表面结合了第一免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，加注电解液；
④采用三电极体系或二电极体系进行测定，将电极连接在电化学工作站上，利用电化学检测方法测定纳米微球表面的免疫复合物上的金属离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中金属离子理论特征峰的±100mV范围内寻找实际特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Logit回归方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
本发明进一步提供了一种基于金属离子标记的电化学检测方法，包括以下步骤：
(1)金属离子材料标记待测物的完全抗原；
(2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的一株抗体；
(3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
(4)检测过程
①将含有待测物的样本、金属离子材料标记的待测物的一株完全抗原和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的一株抗体加入到反应池中，待测物和金属离子材料标记的待测物完全抗原竞争与具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的一株抗体发生免疫反应，经过3～90min的温育反应，形成一端标记有金属离子材料另一端标记有具有特异性亲和性的一对物质中的一个的第一免疫复合物和一端标记有具有特异性亲和性的一对物质中的一个的第二免疫复合物；
②然后向步骤①反应后的混合物中加入表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，步骤①中第一免疫复合物和第二免疫复合物一端的具有特异亲和性的一对物质中的一个分别与纳米微球表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个进行特异性结合，形成表面结合了第一免疫复合物和第二免疫复合物的纳米微球；
③采用分离的方式将步骤②中表面结合了第一免疫复合物和第二免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，加注电解液；
④采用三电极体系或二电极体系进行测定，将电极连接在电化学工作站上，利用电化学检测方法测定纳米微球表面的免疫复合物上的金属离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中金属离子理论特征峰的±100mV范围内寻找实际特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Logit回归方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
进一步地，其中所述金属离子材料为表面或内部含有金属离子的微球；所述金属离子为Cd 2+、Cu 2+、Zn 2+、Mn 2+、Pb 2+、Ag +、Li +、Hg 2+、Co 2+、Cr 3+、Ni 2+、Au 3+、Ba 2+离子中的一种；所述微球为聚苯乙烯微球、聚四氟乙烯微球、二氧化钛微球、二氧化锰微球、二氧化锆微球、有机硅微球、聚酰胺微球、聚丙烯酸微球、壳聚糖微球、聚苯胺微球、聚氯乙烯微球、钴微球、镍微球、铂微球、金微球、银微球、钯微球、二氧化硅微球或磁性微球。
进一步地，其中所述纳米微球为聚苯乙烯微球、聚四氟乙烯微球、二氧化硅微球、二氧化钛微球、有机硅微球、聚酰胺微球、聚丙烯酸微球、壳聚糖微球、聚苯胺微球、聚氯乙烯微球或磁性微球。
进一步地，其中所述分离方式为离心分离、电场或毛细管作用；或者当纳米微球的材质为磁性微球时，则所述分离方式采用磁分离的方式；所述磁性微球为磁性的Fe 3O 4、γ-Fe 2O 3、Pt、Ni或Co微球，或者为磁性的Fe 3O 4、γ-Fe 2O 3、Pt、Ni或Co与无机物或有机物形成的核/壳结构或掺杂结构的微球。
进一步地，其中所述金属离子材料的粒径为1～500nm，纳米微球的粒径为50nm～5μm；所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结 合此抗体的二抗。
进一步地，其中在步骤③中，移除反应池中的剩余液体后可采用PB缓冲液洗涤2～3遍，再加注电解液。
进一步地，其中所述的三电极体系包括工作电极、对电极和参比电极；所述二电极体系包括工作电极和对电极；所述工作电极为铜电极、碳电极、玻碳电极、金微电极，或者在上述电极里掺杂石墨烯的电极，或者在上述电极表面涂覆石墨烯的电极；所述对电极为铂丝电极；所述参比电极为甘汞电极、Ag/AgCl电极；所述电化学检测方法为循环伏安法、微分伏安法、差分脉冲伏安法、交流阻抗谱图法、阳极溶出伏安法或者微分脉冲阳极溶出伏安法。
进一步地，其中所述电解液为0.01M～0.6M、pH＝7.4的磷酸缓冲溶液；0.01M～0.6M、pH＝3～7的柠檬酸缓冲溶液；0.01M～0.6M、pH＝2～7的醋酸缓冲溶液；由0.1mM～1M的K 3[Fe(CN) 6]/K 4[Fe(CN) 6]和0.1mM～1M的KCl组成的铁氰化钾电解液。
本发明具有以下有益效果：
1.由于采用上述技术方案，采用金属离子或氧化物如氧化铜作为标记材料，利用金属离子或氧化物的电化学特性以及电化学法对金属物质检测的高度灵敏性，可以大大提高检测灵敏度，该方法稳定性高、重复性好、结果准确可靠，实现了快速、灵敏检测的目的，拓展了基于金属离子或氧化物标记的电化学检测方法在体外诊断领域中的应用。
2.与传统电化学检测中直接将待测物抗体或抗原包被于电极表面相比，本发明中采用纳米微球收集免疫复合物，然后通过分离将带有免疫复合物的纳米微球富集于电极表面，有利于减小实验误差，提高检测灵敏度。
3.目前，通过电化学检测的方法一般采用伏安曲线图中特征物质的特征峰高来建立与待测物浓度的关系；本申请中通过找出伏安曲线图中特征物质的特征峰，然后计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间的关系建立标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量，更能准确、稳定的反应待测物的含量。
4.本发明申请采用丝网印刷电极，并且丝网印刷电极采用四电极体系，分别设有工作电极、内控电极、对电极和参比电极。其中内控电极的作用在于校准基线，避免电化学反应的波动，减小检测误差。
附图说明
图1为本发明实施例1方法一检测过程中步骤(1)和步骤(2)反应过程示意图；
图2为本发明实施例1方法一检测过程中步骤(3)和步骤(4)检测示意图；
图3为本发明实施例2方法二检测过程中步骤(1)和步骤(2)反应过程示意图；
图4为本发明实施例2方法二检测过程中步骤(3)和步骤(4)检测示意图；
图5为本发明实施例3方法三检测过程中步骤(1)和步骤(2)反应过程示意图；
图6为本发明实施例3方法三检测过程中步骤(3)和步骤(4)检测示意图；
图7为本发明实施例2中检测不同浓度FT 3的校准品后测得的Cd 2+的伏安曲线图，a-0pg/mL，b-1.8pg/mL，c-4.5pg/mL，d-7.5pg/mL，e-12pg/mL，f-40pg/mL；
图8为本发明实施例1方法一中AFP的标准曲线图；
图9为本发明实施例2方法二中FT 3的标准曲线图；
图10为本发明实施例3方法三中FT 3的标准曲线图；
图11为实施例4中铜离子的伏安曲线图，其中PCT校准品的浓度为(a)S 0＝0ng/mL、(b)S 1＝0.02ng/mL、(c)S 2＝1ng/mL、(d)S 3＝10ng/mL、(e)S 4＝25ng/mL、(f)S 5＝100ng/mL；
图12为实施例4中采用四参数Logistic曲线拟合数据图；
图13为实施例4中PCT的标准曲线图；
图14为实施例4中PCT测定结果的相关性图；
图15为实施例5中铜离子的伏安曲线图，其中FT 4校准品的浓度为S 0＝0pg/mL、(b)S 1＝1pg/mL、(c)S 2＝3pg/mL、(d)S 3＝10pg/mL、(e)S 4＝30pg/mL、(f)S 5＝100pg/mL；
图16为实施例5中采用四参数Logistic曲线拟合数据图；
图17为实施例5中FT 4的标准曲线图；
图18为实施例5中FT 4测定结果的相关性图；
图19为实施例6中采用四参数Logistic曲线拟合数据图；
图20为实施例6中Fer的标准曲线图；
图21为实施例6中Fer测定结果的相关性图；
图22为实施例7中采用四参数Logistic曲线拟合数据图；
图23为实施例7中FT 3的标准曲线图；
图24为实施例7中FT 3测定结果的相关性图；
图25为实施例8中采用四参数Logistic曲线拟合数据图；
图26为实施例8中HE4的标准曲线图；
图27为实施例8中HE4测定结果的相关性图；
图28为实施例9中采用四参数Logistic曲线拟合数据图；
图29为实施例9中25-OH-D的标准曲线图；
图30为实施例9中25-OH-D测定结果的相关性图；
图31为实施例10(1)中Cu 2+包覆在聚苯乙烯微球表面作为标记物的稳定性比较，(a)表面包覆了Cu 2+的聚苯乙烯微球标记抗体完成后检测，(b)将表面包覆了Cu 2+的聚苯乙烯微球标记的抗体于37℃下放置3天后检测；
图32为实施例10(2)中CuO作为标记物的稳定性比较，a)CuO标记抗体完成后检测，(b)将CuO标记的抗体于37℃下放置3天后检测；
图33为实施例11(1)中CuO作为标记物的伏安曲线图；
图34为实施例11(2)中氧化锌作为标记物的伏安曲线图；
图35为实施例12中使用内控电极进行基数校准前后CuO作为标记物的伏安曲线图；
其中，图1和图2中：
a1-AFP；a2-生物素标记的另一株鼠抗人AFP单克隆抗体；a3-铜离子材料标记的一株鼠抗人AFP单克隆抗体；a4-一端标记有铜离子材料、另一端标记有生物素的AFP免疫复合物；a5-标记有链酶亲和素的磁性微球；a6-表面结合了AFP免疫复合物的磁性微球；a7-反应池；a8-工作电极；a9-电解液；a10-对电极；
图3和图4中：
b1-FT 3；b2-镉离子材料标记的一株鼠抗人FT 3单克隆抗体；b3-生物素标记的一株FT 3完全抗原；b4-一端标记有镉离子的第二FT 3免疫复合物；b5-一端标记有镉离子、另一端标记有生物素的第一FT 3免疫复合物；b6-标记有链酶亲和素的磁性纳米微球；b7-磁性微球表面结合了第一FT 3免疫复合物；b8-反应池；b9-工作电极；b10-电解液；b11-对电极；
图5和图6中：
c1-FT 3；c2-镉离子材料标记的一株FT 3完全抗原；c3-生物素标记的一株鼠抗人FT 3单克隆抗体；c4-一端标记有隔离子材料、另一端标记有生物素的第一FT 3免疫复合物；c5-一端标记有生物素的第二FT 3免疫复合物；c6-标记有链酶亲和素的磁性纳米微球；c7-磁性微球表面结合了第一FT 3免疫复合物和第二FT 3免疫复合物；c8-反应池；c9-工作电极；c10-电解液；c11-对电极。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的防眩板的支撑装置其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
方法一：如图1和图2所示，
实施例1：以检测甲胎蛋白(AFP)为例
1.包埋铜离子的聚苯乙烯微球的制备：
将10g苯乙烯单体、1g十二烷基硫酸钠、100mL纯化水，1g氯化铜粉末搅拌混匀，放置于75℃温 育箱中，通入氮气持续鼓气混匀；随后将1g过硫酸钾溶解于5mL纯化水中，以0.1mL/分钟的速度添加到反应液中，在氮气保护下反应50min；反应结束后，加入100mL冰水混合液，将反应液温度迅速降低到40℃以下；将反应液10000r/min离心3次，每次30分钟，用95％乙醇复溶并洗涤。最后用100mL纯化水复溶；将复溶后的材料置于50℃水浴中高速搅拌，加入硫酸和硝酸的混合酸(v/v＝3:2)反应2h，将反应物10000r/min离心，去除上清液，用纯化水洗涤并复溶至100毫升，重复该步骤3次。最后将复溶后的材料转移至75℃恒温箱中加入2g NaOH和2g Na 2S 2O 4，搅拌反应4h后10000r/min离心去除上清液，用纯化水洗涤并复溶至100毫升，重复该步骤3次,，记作铜离子材料。
2.铜离子材料标记一株鼠抗人AFP单克隆抗体：
先用碳酸钠缓冲液1将一株鼠抗人AFP单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液1室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时后透析；在5mL制备的铜离子材料中加入1mL一株鼠抗人AFP单克隆抗体溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
3.生物素标记另一株鼠抗人AFP单克隆抗体：
先用碳酸钠缓冲液1将另一株鼠抗人AFP单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液1室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL的另一株鼠抗人AFP单克隆抗体溶液中加入上述DMF溶液80μL，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌2小时；加入1mol/L氯化铵溶液9.6μL，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
4.链酶亲和素标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为800nm，购自天津赛尔群科技有限公司)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用大量的纯化水进行洗涤，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；将0.5mg的链酶亲和素溶于1mL的磷酸缓冲溶液中，然后加入磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磷酸缓冲溶液洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中备用。
5.检测过程：
(1)将10μL含有AFP a1的待测样本、10μL的铜离子材料标记的一株鼠抗人AFP单克隆抗体a3和10μL生物素标记的另一株鼠抗人AFP单克隆抗体a2加入到反应池中，经过30min的温育反应，形成一端标记有铜离子材料、另一端标记有生物素的AFP免疫复合物a4；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10μL表面标记有链酶亲和素的磁性微球a5，标记在AFP免疫复合物一端的生物素与标记在磁性微球表面的链酶亲和素进行特异性结合，表面结合了AFP免疫复合物的磁性微球a6；
(3)采用磁分离的方式将步骤②中表面结合了AFP免疫复合物的纳米微球固定到工作电极(石墨烯电极)a8的表面，然后移除反应池a7中的剩余液体，采用PB缓冲液洗涤3遍，并加注50μL醋酸电解液a9；
(4)采用三电极体系进行测定，将工作电极(石墨烯电极)a8、对电极(铂电极)a10和参比电极(甘汞电极)正确的连接在电化学工作站上，利用溶出伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的铜离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中铜金属离子理论特征峰的±100mV范围内寻找实际特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与AFP浓度之间用Log-Log回归方程进行拟合制备AFP标准曲线，通过标准曲线计算AFP的含量。
6.标准曲线的建立：
配置浓度为0、5、15、50、150、600ng/mL的的AFP校准品用于建立AFP标准曲线，检测灵敏度为5ng/mL，检测范围为5～600ng/mL，检测数据如表1所示，标准曲线如图8所示。
表1 检测数据
标准浓度(ng/mL) 积分面积
0 102
5 675
15 1825
50 7136
150 21270
600 81493
方法二：如图3和图4所示，
实施例2：以检测游离三碘甲状腺原氨酸(FT 3)为例
1.包埋镉离子的聚苯乙烯微球的制备：
将10g苯乙烯单体、1g十二烷基硫酸钠、100mL纯化水，1g氯化镉粉末搅拌混匀，放置于75℃温育箱中，通入氮气持续鼓气混匀；随后将1g过硫酸钾溶解于5mL纯化水中，以0.1mL/分钟的速度添加到反应液中，在氮气保护下反应50min；反应结束后，加入100mL冰水混合液，将反应液温度迅速降低到40℃以下；将反应液10000r/min离心3次，每次30分钟，用95％乙醇复溶并洗涤。最后用100mL纯化水复溶；将复溶后的材料置于50℃水浴中高速搅拌，加入硫酸和硝酸的混合酸(v/v＝3:2)反应2h，将反应物10000r/min离心，去除上清液，用纯化水洗涤并复溶至100毫升，重复该步骤3次。最后将复溶后的材料转移至75℃恒温箱中加入2g NaOH和2g Na 2S 2O 4，搅拌反应4h后10000r/min离心去除上清液，用纯化水洗涤并复溶至100毫升，重复该步骤3次，形成内部和表面含有Cd 2+的聚苯乙烯微球，记作镉离子材料。
2.镉离子材料标记一株鼠抗人FT 3单克隆抗体：
先用碳酸钠缓冲液1将一株鼠抗人FT 3单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液1室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时后透析；在5mL制备的镉离子材料中加入1mL一株鼠抗人FT 3单克隆抗体溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
3.生物素标记一株FT 3完全抗原：
先用碳酸钠缓冲液1将一株FT 3完全抗原稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液1室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL一株FT 3完全抗原溶液中加入上述DMF溶液80μL，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌2小时；加入1mol/L氯化铵溶液9.6μL，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
4.链酶亲和素标记的磁性纳米微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为800nm，购自天津赛尔群科技有限公司)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用大量的纯化水进行洗涤，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；将0.5mg的链酶亲和素溶于1mL的磷酸缓冲溶液中，然后加入磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磷酸缓冲溶液洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中备用。
5.检测过程：
(1)将10μL含有FT 3b1的待测样本、20μL的镉离子材料标记的一株鼠抗人FT 3单克隆抗体b2和10μL生物素标记的一株FT 3完全抗原b3加入到反应池b8中，样本中的FT 3和生物素标记的一株FT 3完全抗原竞争与镉离子标记一株鼠抗人FT 3单克隆抗体发生免疫反应，经过30min的温育反应，形成一端标记有镉离子、另一端标记有生物素的第一FT 3免疫复合物b5和一端标记有镉离子的第二FT 3免疫复合物b4；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10μL表面标记有链酶亲和素的磁性纳米微球b6，标记在第一FT 3免疫复合物一端的生物素与标记在磁性纳米微球表面的链酶亲和素进行特异性结合，形成磁性微球表面结合了第一FT 3免疫复合物b7；
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了第一FT 3免疫复合物的磁性微球固定到工作电极(石墨烯电极)b9的表面，然后移除反应池b8中的剩余液体，采用PB缓冲液洗涤3遍，并加注50μL 醋酸电解液b10；
(4)采用三电极体系进行测定，将工作电极(石墨烯电极)b9、对电极(铂电极)b11和参比电极(甘汞电极)正确的连接在电化学工作站上，利用溶出伏安法测定磁性微球表面的第一FT 3免疫复合物上的镉离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中镉离子理论特征峰的±100mV范围内寻找实际特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与FT 3浓度之间用Logit-Log回归方程进行拟合制备FT 3标准曲线，通过标准曲线计算FT 3的含量。
5.标准曲线的建立
配置浓度为0、1.8、4.5、7.5、12、40pg/mL的FT 3校准品用于建立FT 3标准曲线。检测不同浓度的FT 3校准品后测得的Cd 2+的伏安曲线图如图7所示，检测灵敏度为1.8pg/mL，检测范围为1.8～40pg/mL，检测数据如表2所示，标准曲线如图9所示。
表2 检测数据
标准浓度(pg/mL) 积分面积
0 6549
1.8 6231
4.5 4326
7.5 2545
12 1197
40 245
方法三：如图5和图6所示，
实施例3：以检测游离三碘甲状腺原氨酸(FT 3)为例
1.包埋镉离子的聚苯乙烯微球的制备：
将10g苯乙烯单体、1g十二烷基硫酸钠、100mL纯化水，1g氯化铜粉末搅拌混匀，放置于75℃温育箱中，通入氮气持续鼓气混匀；随后将1g过硫酸钾溶解于5mL纯化水中，以0.1mL/分钟的速度添加到反应液中，在氮气保护下反应50min；反应结束后，加入100mL冰水混合液，将反应液温度迅速降低到40℃以下；将反应液10000r/min离心3次，每次30分钟，用95％乙醇复溶并洗涤。最后用100mL纯化水复溶；将复溶后的材料置于50℃水浴中高速搅拌，加入硫酸和硝酸的混合酸(v/v＝3:2)反应2h，将反应物10000r/min离心，去除上清液，用纯化水洗涤并复溶至100毫升，重复该步骤3次。最后将复溶后的材料转移至75℃恒温箱中加入2g NaOH和2g Na 2S 2O 4，搅拌反应4h后10000r/min离心去除上清液，用纯化水洗涤并复溶至100毫升，重复该步骤3次,，记作铜离子材料。
2.镉离子材料标记一株FT 3完全抗原：
先用碳酸钠缓冲液将一株FT 3完全抗原稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时后透析；在5mL制备的镉离子材料中加入1mL一株FT 3完全抗原溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
3.生物素标记一株鼠抗人FT 3单克隆抗体
先用碳酸钠缓冲液将一株鼠抗人FT 3单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL一株鼠抗人FT3单克隆抗体溶液中加入上述DMF溶液80μL，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌2小时；加入1mol/L氯化铵溶液9.6μL，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。
4.链酶亲和素标记的磁性微球纳米微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为800nm，购自天津赛尔群科技有限公司)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用大量的纯化水进行洗涤，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；将0.5mg的链酶亲和素溶于1mL的磷酸缓冲溶液中，然后加入磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磷酸缓冲溶液洗 涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中备用。
5.检测过程：
(1)将10μL含有FT 3c1的待测物样本、20μL的镉离子材料标记的一株FT 3完全抗原c2和10μL生物素标记的一株鼠抗人FT 3单克隆抗体c3加入到反应池c8中，样本中的FT 3和CdSe标记的FT 3完全抗原竞争与生物素标记的一株鼠抗人FT 3单克隆抗体发生反应，经过3～90min的温育反应，形成一端标记有镉离子材料、另一端标记有生物素的第一FT 3免疫复合物c4和一端标记有生物素的第二FT 3免疫复合物c5；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10μL表面标记有链酶亲和素的磁性微球纳米微球c6，标记在第一FT 3免疫复合物和第二FT 3免疫复合物一端的生物素分别与标记在磁性纳米微球表面的链酶亲和素发生特异性结合，形成磁性微球表面结合了第一FT 3免疫复合物和第二FT 3免疫复合物c7。
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了第一FT 3免疫复合物和第二FT 3免疫复合物的磁性微球固定到工作电极(石墨烯电极)c9的表面，然后移除反应池c8中的剩余液体，用PB缓冲溶液洗涤三次，并加注50μL醋酸电解液c10。
(4)采用三电极体系进行测定，将工作电极(石墨烯电极)c9、对电极(铂电极)c11和参比电极(甘汞电极)正确的连接在电化学工作站上，利用溶出伏安法测定磁性微球表面的第一FT 3免疫复合物上镉离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中镉离子理论特征峰的±100mV范围内寻找实际特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与FT 3浓度之间用Logit-Log回归方程进行拟合制备FT 3标准曲线，通过标准曲线计算FT 3的含量。
5.标准曲线的建立
配置浓度为0、1.8、4.5、7.5、12、40pg/mL的FT 3校准品校准品用于建立FT 3标准曲线，检测灵敏度为1.8pg/mL，检测范围为1.8～40pg/mL，检测数据如表3所示，标准曲线如图10所示。
表3 检测数据
标准浓度(pg/mL) 积分面积
0 12933
1.8 12642
4.5 10539
7.5 6362
12 2937
40 563
实施例4：以检测降钙素原(PCT)为例(夹心法)
1.纳米氧化铜标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体：
先用PBS缓冲液将一株鼠抗人PCT单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选为5mL)(质量分数为1g/100mL，纯度99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选为30-40nm)材料中加入1mL一株鼠抗人PCT单克隆抗体溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选为10min)去除上清液，随后用含1-10wt％(优选为10％)牛血清白蛋白BSA 10mL复溶后封闭1-5h(优选为3h)。然后在3000-8000r/min(优选为5000r/min)条件下离心5-30min(优选为10min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为300)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
2.生物素标记另一株鼠抗人PCT单克隆抗体：
先用碳酸钠缓冲液2将另一株鼠抗人PCT单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液2室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为4小时)后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配制成1mg/mL；在1mL的另一株鼠抗人PCT单克隆抗体溶液中加入上述DMF溶液10-160μL(优选为80μL)，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为2h)；加入1mol/L氯化铵溶液5-20μL(优选为9.6μL)，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为300)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
3.链酶亲和素标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选为800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水进行洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；将0.5mg的链酶亲和素溶于1mL的磷酸缓冲溶液中，然后加入磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，反应结束后用磷酸缓冲溶液洗涤2～3次，然后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中备用。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
4.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选为25μL)含有PCT的待测样本、10-150μL(优选为100μL)的纳米氧化铜标记的一株鼠抗人PCT单克隆抗体和10-150μL(优选为50μL)生物素标记另一株鼠抗人PCT单克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选为15min)的温育反应，形成一端标记有纳米氧化铜、另一端标记有生物素的PCT免疫复合物；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10-100μL(优选为50μL)表面标记有链酶亲和素的磁性微球，标记在PCT免疫复合物一端的生物素与标记在磁性微球表面的链酶亲和素进行特异性结合，形成表面结合了PCT免疫复合物的磁性微球；
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了PCT免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选为100μL)柠檬酸电解液；
(4)采用四电极体系进行测定，将工作电极(石墨电极)、内控电极(碳电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜发生还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜金属离子理论特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与PCT浓度之间用Log-Log线性回归方程或四参数方程(优选为四参数方程)进行拟合制备PCT标准曲线，通过标准曲线计算PCT的含量。
其中采用上述各步骤中的优选为方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、0.02、1、10、25、100ng/mL的PCT校准品用于建立PCT标准曲线，检测灵敏度为0.02ng/mL，检测范围为0.02～100ng/mL，铜离子的伏安曲线图如图11所示，检测数据如表4所示，采用四参数Logistic曲线拟合数据如图12所示，标准曲线如图13所示。
表4 检测数据
标准浓度(ng/mL) 积分面积
0 1.31
0.02 6.30
1 15.61
10 72.12
25 89.14
100 130.70
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对13例样本进行检测，检测结果如表5所示，对检测结果进行相关性分析如图14所示，回归方程为y＝0.86498x+0.1423，R 2＝0.9737，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表5 本方法与罗氏电化学法检测结果对比
本方法(ng/mL) 罗氏(ng/mL)
0.11 0.15
12.33 9.87
1.23 1.13
0.53 0.62
7.81 8.32
0.02 0.04
1.28 1.31
0.49 0.32
0.16 0.15
0.91 0.82
2.34 2.59
1.37 1.12
0.37 0.45
实施例5：以检测游离甲状腺素(FT 4)为例(竞争法)
1.纳米氧化铜标记FT 4完全抗原：
先用PBS缓冲液将FT 4完全抗原稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选为2mL)(质量分数为1g/100mL，纯度为99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选为30-40nm)材料中加入1mLFT 4完全抗原溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选为10min)去除上清液，随后用含1-10％(优选为10％)BSA10mL复溶后封闭1-5h(优选为3h)。然后在3000-8000r/min(优选为5000r/min)条件下离心5-30min(优选为10min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为300)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
2.生物素标记另一株羊抗人FT 4多克隆抗体：
先用碳酸钠缓冲液2将另一株羊抗人FT 4多克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液2室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为4小时)后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL的羊抗人FT 4多克隆抗体溶液中加入上述DMF溶液10-160μL(优选为40μL)，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为2小时)；加入1mol/L氯化铵溶液5-20μL(优选为15μL)，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为300)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
3.链酶亲和素标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选为800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水进行洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；将0.5mg的链酶亲和素溶于1mL的磷酸缓冲溶液中，然后加入磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，反应结束后用磷酸缓冲溶液洗涤2～3次，然后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中备用。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
4.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选为50μL)含有FT 4的待测样本、10-150μL(优选为50μL)的纳米氧化铜标记的FT 4完全抗原和10-150μL(优选为50μL)生物素标记羊抗人FT 4多克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选为15min)的温育反应，待测样本中的FT 4、纳米氧化铜标记的FT 4完全抗原竞争与生物素标记羊抗人FT 4多克隆抗体反应形成一端标记有氧化铜、另一端标记有生物素的FT 4免疫复合物I和一端标记有生物素的FT 4免疫复合物II；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10-100μL(优选为50μL)表面标记有链酶亲和素的磁性微球，标记在FT 4免疫复合物I和FT 4免疫复合物II一端的生物素与标记在磁性微球表面的链酶亲和素进行特异性结合，形成表面结合了FT 4免疫复合物I和FT 4免疫复合物II的磁性微球；
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了FT 4免疫复合物的I和FT 4免疫复合物II的磁性微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选为100ul)柠檬酸电解 液；
(4)采用四电极体系进行测定，将工作电极(金微电极)、内控电极(银电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜发生还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与PCT浓度之间用Log-Logit线性回归方程或四参数方程(优选为四参数方程)进行拟合制备FT 4标准曲线，通过标准曲线计算FT 4的含量。
其中采用上述各步骤中的优选为方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配制浓度为0、1、3、10、30、100pg/mL的FT 4校准品用于建立FT 4标准曲线，检测灵敏度为0.5pg/mL，检测范围为1～100pg/mL，铜离子的伏安曲线图如图15所示，检测数据如表6所示，采用四参数Logistic曲线拟合数据如图16所示，标准曲线如图17所示。
表6 检测数据
标准浓度(pg/mL) 积分面积
0 147.68
1 108.00
3 86.89
10 65.81
30 20.87
100 9.58
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对17例样本进行检测，检测结果如表7所示，对检测结果进行相关性分析如图18所示，回归方程为y＝1.1262x+1.9277，R 2＝0.9797，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表7 本方法与罗氏电化学法检测结果比对
本方法(pg/mL) 罗氏(pmol/L)
4.02 5.14
13.06 14.89
10.95 18.98
46.40 53.29
6.33 6.97
5.55 8.92
11.72 14.02
14.86 17.83
11.72 16.27
29.48 33.87
22.48 27.03
7.94 11.12
12.56 15.21
34.09 43.29
21.48 28.93
28.79 31.82
4.60 7.32
实施例6：以检测铁蛋白(Fer)为例(夹心法)
1.纳米氧化铜标记一株鼠抗人Fer单克隆抗体：
先用PBS缓冲液将一株鼠抗人Fer单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选为5mL)(质量分数为1g/100mL，纯度为99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选为30-40nm)材料中加入1mL一株鼠抗人Fer单克隆抗体溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选为10min)去除上清液，随后用含1-10％(优选为10％)BSA 10mL复溶后封闭1-5h(优选为3h)。然后在3000-8000r/min(优选为6000r/min)条件下离心5-30min(优选为15min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为2000)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
2.另一株鼠抗人Fer单克隆抗体标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选为800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；用碳酸钠缓冲液2将另一株鼠抗人Fer单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液2室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为2小时)后透析；吸取0.5-5mL(优选为1mL)抗体并加入10mL磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磁铁将磁性微球吸于一侧，PBS洗涤3次，洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中即可。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
3.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选为25μL)含有Fer的待测样本、10-150μL(优选为100μL)的纳米氧化铜标记的一株鼠抗人Fer单克隆抗体和10-150μL(优选为50μL)磁性微球标记另一株鼠抗人Fer单克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选为10min)的温育反应，形成一端标记有纳米氧化铜、另一端有磁性微球的Fer免疫复合物；
(2)采用磁分离的方式将步骤(1)中表面结合了Fer免疫复合物的纳米微球固定到表面涂覆有石墨稀或富勒烯的工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选为100uL)柠檬酸电解液；
(3)采用四电极体系进行测定，将工作电极(碳电极)、内控电极(石墨电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜发生还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与Fer浓度之间用Log-Log线性回归方程或四参数方程(优选为四参数方程)进行拟合制备Fer标准曲线，通过标准曲线计算Fer的含量。
其中采用上述各步骤中的优选为方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、0.5、5、30、200、1000ng/mL的的Fer校准品用于建立Fer标准曲线，检测灵敏度为0.1ng/mL，检测范围为0.5～1000ng/mL，检测数据如表8所示，采用四参数Logistic曲线拟合数据如图19所示，标准曲线如图20所示。
表8 检测数据
标准浓度(ng/mL) 积分面积
0 2.41
0.5 4.86
5 12.42
30 28.44
200 59.46
1000 89.43
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对20例样本进行检测，检测结果如表9所示，对检测结果进行相关性分析如图21所示，回归方程为y＝0.9341x+2.1006，R 2＝0.9839，表明本方法与罗氏的电化学发 光法具有良好的相关性。
表9 本方法与罗氏电化学法检测结果对比
本方法(ng/mL) 罗氏(ng/mL)
33.87 26.74
287.43 314.34
622.03 578.03
140.24 134.23
166.75 153.87
20.34 23.45
45.92 45.94
4.43 7.32
245.93 234.33
129.03 114.23
134.24 145.23
229.32 218.93
669.02 643.08
578.45 543.85
308.75 203.13
34.98 39.32
34.88 29.43
173.92 183.54
203.45 192.34
224.08 215.32
实施例7：以检测游离三碘甲腺原氨酸(FT 3)为例(竞争法)
1.纳米氧化铜标记FT 3完全抗原：
先用PBS缓冲液将FT 3完全抗原稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选为2mL)(质量分数为1g/100mL，纯度为99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选为30-40nm)材料中加入1mLFT 3完全抗原溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选为10min)去除上清液，随后用含1-10％(优选为10％)BSA10mL复溶后封闭1-5h(优选为3h)。然后在3000-8000r/min(优选为6000r/min)条件下离心5-30min(优选为15min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为200)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
2.另一株羊抗人FT 3多抗标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选为800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液2(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后纯化水洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；用碳酸钠缓冲液2将一株羊抗人FT 3多抗稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液2室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为2小时)后透析；吸取0.5-5mL(优选为1mL)抗体并加入10mL磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磁铁将磁性微球吸于一侧，PBS洗涤3次，洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中即可。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
3.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选为50μL)含有FT 3的待测样本、10-150μL(优选为100μL)的纳米氧化铜标记的一株FT 3完全抗原和10-150μL(优选为50μL)磁性微球标记另一株羊抗人FT 3多抗加入到反应池中，经过3-90min(优选为15min)的温育反应，待测样本中的FT 3、氧化铜标记的一株FT 3完全抗原竞争与磁性微球表面标记的另一株羊抗人FT 3多抗发生免疫反应，形成磁性微球表面结合待测样本中FT 3 的免疫复合物I和结合氧化铜标记的一株FT 3完全抗原的免疫复合物II；
(2)采用磁分离的方式将步骤(1)中表面结合了免疫复合物I和免疫复合物II的磁性微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选为100μL)柠檬酸电解液；
(3)采用四电极体系进行测定，将工作电极(玻碳电极)、内控电极(碳电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜进行还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与FT 3浓度之间用Log-Logit线性回归方程或四参数方程(优选为四参数方程)进行拟合制备FT 3标准曲线，通过标准曲线计算FT 3的含量。
其中采用上述各步骤中的优选为方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、0.1、0.5、3、10、50pg/mL的的FT 3校准品用于建立FT 3标准曲线，检测灵敏度为0.05pg/mL，检测范围为0.1～50pg/mL，检测数据如表10所示，采用四参数Logistic曲线拟合数据如图22所示，标准曲线如图23所示。
表10 检测数据
标准浓度(pg/mL) 积分面积
0 132.31
0.1 100.32
0.5 72.32
3 53.45
10 29.81
50 11.32
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对20例样本进行检测，检测结果如表11所示，对检测结果进行相关性分析如图24所示，回归方程为y＝1.2359x+0.3003，R 2＝0.959，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表11 本方法与罗氏电化学法检测结果对比
新方法(pg/mL) 罗氏(pmol/L)
22.65 28.02
3.66 4.8
3.50 5.07
13.44 18.57
4.29 4.15
1.26 2.81
4.53 7.53
10.13 11.92
10.20 9.46
1.11 1.46
0.47 0.54
6.86 9.24
5.58 4.22
2.61 5.56
0.53 0.97
4.96 4.63
4.90 9.05
9.33 11.81
15.18 19.12
18.49 24.67
实施例8：以人附睾蛋白4(HE4)为例(夹心法)
1.纳米氧化铜标记链霉亲和素：
先用PBS缓冲液将链霉亲和素稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选为3mL)(质量分数为1g/100mL，纯度为99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选为30-40nm)材料中加入1mL链霉亲和素溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选为15min)去除上清液，随后用含1-10％(优选为10％)BSA10mL复溶后封闭1-5h(优选为3h)。然后在3000-8000r/min(优选为5000r/min)条件下离心5-30min(优选为20min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为100)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
2.生物素标记一株鼠抗人HE4单克隆抗体：
先用碳酸钠缓冲液2将一株鼠抗人HE4单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液2室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为4小时)后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL的一株鼠抗人HE4单克隆抗体溶液中加入上述DMF溶液10-160μL(优选为80μL)，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为2小时)；加入1mol/L氯化铵溶液5-20μL(优选为9.6μL)，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为300)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
3.另一株鼠抗人HE4单克隆抗体标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选为800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；用碳酸钠缓2冲液将另一株鼠抗人HE4单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液2室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为2小时)后透析；吸取0.5-5mL(优选为1mL)抗体并加入10mL磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磁铁将磁性微球吸于一侧，PBS洗涤3次，洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中即可。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
4.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选为25μL)含有HE4的待测样本、10-150μL(优选为100μL)的生物素标记的一株鼠抗人HE4单克隆抗体和10-150μL(优选为50μL)磁性微球标记另一株鼠抗人HE4单克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选为15min)的温育反应，形成一端标记有磁性微球材料、另一端标记有生物素的HE4免疫复合物；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10-100μL(优选为50μL)表面标记有链酶亲和素的纳米氧化铜，标记在HE4免疫复合物一端的生物素与纳米氧化铜表面的链酶亲和素进行特异性结合，形成表面结合了一端标记有纳米氧化铜的HE4免疫复合物的磁性微球；
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了HE4免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选为100μL)柠檬酸电解液；
(4)采用四电极体系进行测定，将工作电极(石墨电极)、内控电极(玻碳电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜进行还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与HE4浓度之间用Log-Log线性回归方程或四参数方程(优选为四参数方程)进行拟合制备HE4标准曲线，通过标准曲线计算HE4的含量。
其中采用上述各步骤中的优选为方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、1、10、40、200、1000pmol/L的的HE4校准品用于建立HE4标准曲线，检测灵敏度为0.2pmol/L，检测范围为1～1000pmol/L，检测数据如表12所示，采用四参数Logistic曲线拟合数据如图25所示，标准曲线如图26所示。
表12 检测数据
标准浓度(pmol/L) 积分面积
0 3.32
1 6.50
10 14.92
40 44.84
200 113.35
1000 159.90
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对20例样本进行检测，检测结果如表13所示，对检测结果进行相关性分析如图27所示，回归方程为y＝0.9483x+3.1147，R 2＝0.9811，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表13 本方法与罗氏电化学方法的检测结果对比
本方法(pmol/L) 罗氏(pmol/L)
154.36 157.64
42.50 41.55
75.95 69.48
467.59 440.03
28.57 32.73
121.29 146.08
116.62 136.62
83.93 73.26
99.53 101.14
382.86 374.4
99.40 94.73
53.53 49.43
50.69 35.91
46.98 46.09
67.76 66.21
145.23 126.08
41.59 45.24
134.91 153.69
163.10 118.92
56.78 60.52
实施例9：以25-羟基维生素D(25-OH-D)为例(竞争法)
1.纳米氧化铜标记链霉亲和素：
先用PBS缓冲液将链霉亲和素稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选为3mL)(质量分数为1g/100mL，纯度为99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选为30-40nm)材料中加入1mL链霉亲和素溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选为15min)去除上清液，随后用含1-10％(优选为10％)BSA10mL复溶后封闭1-5h(优选为3h)。然后在3000-8000r/min(优选为5000r/min)条件下离心5-30min(优 选为20min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为100)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
2.生物素标记25-OH-D完全抗原：
先用碳酸钠缓冲液2将25-OH-D完全抗原稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液2室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为4小时)后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL的25-OH-D完全抗原溶液中加入上述DMF溶液10-160μL(优选为80μL)，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为2小时)；加入1mol/L氯化铵溶液5-20μL(优选为9.6μL)，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选为300)。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
3.一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选为800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水进行洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；用碳酸钠缓冲液2将鼠抗人25-OH-D单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液2室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选为2小时)后透析；吸取0.5-5mL(优选为1mL)抗体并加入10mL磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磁铁将磁性微球吸于一侧，PBS洗涤3次，洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中即可。其中采用优选为方案的标记效果更好、更稳定。
4.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选为25μL)含有25-OH-D的待测样本先用结合蛋白释放剂添加25μL处理10min，随后加10-150μL(优选为100μL)的生物素标记的25-OH-D完全抗原和10-150μL(优选为50μL)磁性微球标记一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选为15min)的温育反应，待测物样本中的25-OH-D、生物素标记的25-OH-D完全抗原竞争与一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体发生免疫反应，形成磁性微球表面结合待测样本中25-OH-D的免疫复合物I和结合生物素标记的一株25-OH-D完全抗原的免疫复合物II；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10-100μL(优选为50μL)表面标记有链酶亲和素的纳米氧化铜，标记在25-OH-D免疫复合物II一端的生物素与纳米氧化铜表面的链酶亲和素进行特异性结合，表面结合了25-OH-D免疫复合物的磁性微球；
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选为100μL)柠檬酸电解液；
(4)采用四电极体系进行测定，将工作电极(铅电极)、内控电极(金微电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与25-OH-D浓度之间用Log-Logit线性回归方程或四参数方程(优选为四参数方程)进行拟合制备25-OH-D标准曲线，通过标准曲线计算25-OH-D的含量。
其中采用上述各步骤中的优选为方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、0.5、2.5、10、50、200ng/mL的的25-OH-D校准品用于建立25-OH-D标准曲线，检测灵敏度为0.2ng/mL，检测范围为0.5～200ng/mL，检测数据如表14所示，采用四参数Logistic曲线拟合数据如图28所示，标准曲线如图29所示。
表14 检测数据
标准浓度(ng/mL) 积分面积
0 128.83
0.5 100.2
2.5 72.32
10 53.62
50 36.87
200 19.43
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对20例样本进行检测，检测结果如表15所示，对检测结果进行相关性分析如图30所示，回归方程为y＝0.9884x+0.3127，R 2＝0.9595，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表15 本方法与罗氏电化学法检测结果对比
本方法(ng/mL) 罗氏(ng/mL)
75.61 71.16
18.67 19.58
46.99 47.19
17.06 19.8
45.37 51.14
16.55 13.1
5.12 7.7
16.31 18.16
36.94 32.38
58.41 57.95
70.23 83.35
24.23 26.81
17.11 12.9
6.95 5.09
75.73 61.88
26.22 27.58
16.33 18.51
59.49 57.32
28.34 24.45
91.48 94.6
实施例10：CuO作为标记材料与Cu 2+负载于聚苯乙烯微球上作为标记材料的稳定性比较
(1)Cu 2+负载于聚苯乙烯(PS)微球上作为材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定5ng/mL的PCT校准品，测定的Cu 2+发生还原反应的伏安曲线图如图31所示中的a线，在靠近0V的地方产生了较高的还原峰信号；然后将Cu 2+负载于PS微球上标记的一株鼠抗人PCT单克隆抗体于37℃下放置3天，然后用于测定5ng/mL的PCT校准品，测定的Cu 2+发生还原反应的伏安曲线图如图25所示中的b线，几乎没有发现Cu 2+发生还原反应的峰，表明Cu 2+负载于聚苯乙烯(PS)微球上作为标记材料的稳定性较差，这可能是由于PS微球表面的Cu 2+随着放置时间的延长，发生脱落导致的。
(2)采用CuO作为标记材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定5ng/mL的PCT校准品，测定的CuO发生还原反应的伏安曲线图如图32所示中的a线；然后将CuO标记的一株鼠抗人PCT单克隆抗体于37℃下放置3天，然后用于测定5ng/mL的PCT校准品，测定的CuO发生还原反应的伏安曲线图如图26所示中的b线，从图中可以看出检测结果差不多，表明CuO作为标记物具有较好的稳定性；除此之外，Cu 2+在溶液中是以离子状态存在，作为标记材料时需要先负载与载体(例如PS微球、铂微球、SiO 2微球)上，然后对待测物抗体或抗原进行标记，过程复杂；而CuO在溶液中是以纳米小颗粒存在于溶液中，可以直接用于待测物抗体或抗原的标记，简化操作过程。
实施例11：氧化铜中Cu 2+还原峰与氧化锌中Zn 2+还原峰受H +还原峰的影响对比
(1)采用CuO作为标记材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定25ng/mL的PCT校准品，测定的CuO发生还原反应的伏安曲线图如图33所示，图中a处为CuO中Cu 2+的还原峰，几乎不受b处可能存在的H +还原峰的影响；
(2)采用ZnO作为标记材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定25ng/mL的PCT校准品，测定的ZnO发生还原反应的伏安曲线图如图34所示，图中a处为ZnO中Zn 2+的还原峰，受b处可能存在的H +还原峰的影响较大，进而对检测结果产生较大的影响。
实施例12：内控电极的作用
采用CuO作为标记材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定5ng/mL的PCT校准品，采用内控电极先进行基数校准后再测定作为标记材料的CuO还原反应的伏安曲线图如图29所示中的a线，扣除本底的干扰，峰形规整，能够有较小的误差，提高检测的准确性；为采用内控电极进行基数校准而是直接测定作为标记材料的CuO还原反应的伏安曲线图如图35所示中的b线，CuO中铜离子的还原峰受本底的影响，峰形不太规整，可能会使检测结果存在较大误差。
附：所需溶液配制
(1)PB缓冲溶液
Figure PCTCN2018123835-appb-000001
(2)碳酸钠缓冲溶液1
碳酸钠                0.99g
碳酸氢钠              2.96g
纯化水定容至1000mL；
(3)磷酸缓冲溶液
磷酸二氢钠              0.99g
磷酸氢二钠              5.16g
纯化水定容至1000mL；
(4)PBS缓冲溶液
Figure PCTCN2018123835-appb-000002
(5)碳酸钠缓冲溶液2
碳酸钠      4.33g
碳酸氢钠    2.96g
纯化水定容至1000mL；
(6)柠檬酸电解液
Figure PCTCN2018123835-appb-000003
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (30)

  1. 一种基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
    (1)在反应池中制备标记物标记的免疫复合物；
    (2)通过分离的方式将标记物标记的免疫复合物富集到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，加注电解液；
    (3)将电极连接到电化学工作站上，通过伏安法测定标记物的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出标记物的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用回归方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
  2. 如权利要求1所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述特征峰位于金属离子理论特征峰的±100mV范围内；所述回归方程为Log-Log或Log-Logit回归方程。
  3. 如权利要求2所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述标记物标记的免疫复合物通过以下步骤制得：
    (1)标记物标记待测物的一株抗体；
    (2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体；
    (3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
    (4)将含有待测物的样本、标记物标记的待测物的一株抗体和具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体加入到反应池中，经过3～90min的温育反应，继续加入表面标记有具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，形成标记物标记的的免疫复合物；
    或者为，
    (1)标记物标记待测物的一株抗体；
    (2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的完全抗原；
    (3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
    (4)将含有待测物的样本、标记物标记的待测物的一株抗体和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的完全抗原加入到反应池中，经过3～90min的温育反应，继续加入表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，形成标记物标记的的免疫复合物；
    或者为，
    (1)标记物标记待测物的完全抗原；
    (2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的一株抗体；
    (3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
    (4)将含有待测物的样本、标记物标记的待测物的一株完全抗原和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的一株抗体加入到反应池中，经过3～90min的温育反应，继续加入表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，形成标记物标记的的免疫复合物。
  4. 如权利要求3所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述标记物为金属离子材料；所述电化学检测是采用三电极体系或二电极体系进行测定的。
  5. 如权利要求4所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述金属离子材料为表面或内部含有金属离子的微球；所述金属离子为Cd 2+、Cu 2+、Zn 2+、Mn 2+、Pb 2+、Ag +、Li +、Hg 2+、Co 2+、Cr 3+、Ni 2+、Au 3+、Ba 2+离子中的一种；所述微球为聚苯乙烯微球、聚四氟乙烯微球、二氧化钛微球、二氧化锰微球、二氧化锆微球、有机硅微球、聚酰胺微球、聚丙烯酸微球、壳聚糖微球、聚苯胺微球、聚氯乙烯微球、钴微球、镍微球、铂微球、金微球、银微球、钯微球、二氧化硅微球或磁性微球。
  6. 如权利要求5所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述纳米微球为聚苯乙烯微球、聚四氟乙烯微球、二氧化硅微球、二氧化钛微球、有机硅微球、聚酰胺微球、聚丙烯酸微球、壳聚糖微球、聚苯胺微球、聚氯乙烯微球或磁性微球。
  7. 如权利要求6所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述分离方式为离心分离、 电场或毛细管作用；或者当纳米微球的材质为磁性微球时，则所述分离方式采用磁分离的方式；所述磁性微球为磁性的Fe 3O 4、γ-Fe 2O 3、Pt、Ni或Co微球，或者为磁性的Fe 3O 4、γ-Fe 2O 3、Pt、Ni或Co与无机物或有机物形成的核/壳结构或掺杂结构的微球。
  8. 如权利要求7所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述金属离子材料的粒径为1～500nm，所述纳米微球的粒径为50nm～5μm。
  9. 如权利要求1所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述回归方程为四参数回归方程。
  10. 如权利要求9所述的基于标记物标记的电化学检测方法，所述标记物标记的免疫复合物通过以下步骤制得：
    步骤一，标记物标记待测物的一株抗体或抗原；
    步骤二，具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体；
    步骤三，具有特异亲和性一对物质中的另一个标记磁性微球；
    步骤四，将待测物、标记物标记的抗体或抗原和具有特异亲和性一对物质中的一个标记的抗体加入检测池中，进行温育反应，继续加入具有特异亲和性的一对物质中的另一个标记的磁性微球，形成标记物标记的免疫复合物；
    或者为，
    步骤一，标记物标记待测物的一株抗体或抗原；
    步骤二，磁性微球标记待测物的另一株抗体；
    步骤三，将待测物、标记物标记待测物的一株抗体或抗原和磁性微球标记待测物的另一株抗体加入到检测池中，进行温育反应，形成标记物标记的免疫复合物；
    或者为，
    步骤一，具有特异亲和性的一对物质中的一个标记待测物的一株抗体或抗原；
    步骤二，磁性微球标记待测物的另一株抗体；
    步骤三，标记物标记具有特异亲和性的一对物质中的另一个；
    步骤四，将待测物、具有特异亲和性的一对物质中的一个标记待测物的一株抗体或抗原和磁性微球标记待测物的另一株抗体，加入检测池中，进行温育反应，继续加入标记物标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个，形成标记物标记的免疫复合物。
  11. 如权利要求10所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述标记物标记的免疫复合物包括标记物标记的一株抗体或抗原，磁性微球标记的待测物的另一株抗体，和待测物。
  12. 如权利要求11所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述标记物标记的一株抗体或抗原通过具有特异亲和性的一对物质进行连接。
  13. 如权利要求12所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于，所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结合此抗体的二抗。
  14. 如权利要求13述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于，所述磁性微球标记的待测物的另一株抗体通过具有特异亲和性的一对物质进行连接。
  15. 如权利要求14所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于，所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结合此抗体的二抗。
  16. 如权利要求15所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述标记物为金属氧化物材料；所述检测是采用四电极体系进行测定的。
  17. 如权利要求16所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述金属氧化物为氧化铜。
  18. 如权利要求17所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述氧化铜选自1)裸露的氧化铜纳米颗粒；或2)氧化铜表面包覆一层二氧化硅、二氧化钛、碳酸盐、硅酸盐、磷酸盐、碳化硅、石墨、氮化硅中的一种；或3)氧化铜表面包覆一层有机硅、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚酰胺、聚乙烯、 聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰亚胺、聚苯胺、聚吡咯、聚丙烯酸、壳聚糖、聚乳酸、环氧树脂、酚醛树脂、聚炔、聚酯、β-环糊精聚合物、维生素、三聚氰胺中的一种；所述抗体或抗原为待测物的抗体或抗原。
  19. 如权利要求16所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述四电极体系采用丝网印刷电极，分别为工作电极、内控电极、对电极和参比电极，所述丝网印刷电极插入检测池中，在检测池中对应丝网印刷电极中工作电极的下方设置磁铁。
  20. 如权利要求19所述的基于标记物标记的电化学检测方法，其特征在于：所述工作电极为铜电极、碳电极、玻碳电极、金微电极、石墨电极、银电极、铅电极，或者在上述电极里掺杂石墨烯或富勒烯的电极，或者在上述电极表面修饰、涂覆、掺杂或贴有石墨烯或富勒烯的电极；所述内控电极为铜电极、碳电极、玻碳电极、金微电极、石墨电极、银电极、铅电极，或者在上述电极里掺杂石墨烯或富勒烯的电极，或者在上述电极表面修饰、涂覆、掺杂或贴有石墨烯或富勒烯的电极；所述对电极为铂丝电极或碳电极；所述参比电极为甘汞电极、Ag/AgCl电极。
  21. 一种基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
    (1)金属离子材料标记待测物的一株抗体；
    (2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体；
    (3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
    (4)检测过程
    ①将含有待测物的样本、金属离子材料标记的待测物的一株抗体和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体加入到反应池中，经过3～90min的温育反应，形成一端标记有金属离子材料另一端标记有具有特异性亲和性的一对物质中的一个的免疫复合物；
    ②然后向步骤①反应后的混合物中加入表面标记有具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，步骤①中免疫复合物一端的具有特异亲和性的一对物质中的一个与标记在纳米微球表面的具有特异性亲和性一对物质中的另一个进行特异性结合，形成表面结合了步骤①中的免疫复合物的纳米微球；
    ③采用分离的方式将步骤②中表面结合了步骤①中的免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，加注电解液；
    ④采用三电极体系或二电极体系进行测定，将电极连接在电化学工作站上，利用电化学检测方法测定纳米微球表面的免疫复合物上金属离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中金属离子理论特征峰的±100mV范围内寻找实际特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Log回归方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
  22. 一种基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
    (1)金属离子材料标记待测物的一株抗体；
    (2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的完全抗原；
    (3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
    (4)检测过程
    ①将含有待测物的样本、金属离子材料标记的待测物的一株抗体和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的完全抗原加入到反应池中，待测物和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物完全抗原竞争与金属离子材料标记的待测物的一株抗体发生免疫反应，经过3～90min的温育反应，形成一端标记金属离子材料另一端标记有具有特异性亲和性的一对物质中的一个的第一免疫复合物和一端标记有金属离子材料的第二免疫复合物；
    ②然后向步骤①反应后的混合物中加入表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，步骤①中第一免疫复合物一端的具有特异亲和性的一对物质中的一个与纳米微球表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个进行特异性结合，形成表面结合了第一免疫复合物的纳米微球，第二免疫复合物不参加反应；
    ③采用分离的方式将步骤②中表面结合了第一免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，加注电解液；
    ④采用三电极体系或二电极体系进行测定，将电极连接在电化学工作站上，利用电化学检测方法测定纳米微球表面的免疫复合物上的金属离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中金属离子理论特征峰的±100mV范围内寻找实际特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Logit回归方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
  23. 一种基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
    (1)金属离子材料标记待测物的完全抗原；
    (2)具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的一株抗体；
    (3)具有特异亲和性一对物质中的另一个标记纳米微球；
    (4)检测过程
    ①将含有待测物的样本、金属离子材料标记的待测物的一株完全抗原和具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的一株抗体加入到反应池中，待测物和金属离子材料标记的待测物完全抗原竞争与具有特异亲和性的一对物质中的一个标记的待测物的一株抗体发生免疫反应，经过3～90min的温育反应，形成一端标记有金属离子材料另一端标记有具有特异性亲和性的一对物质中的一个的第一免疫复合物和一端标记有具有特异性亲和性的一对物质中的一个的第二免疫复合物；
    ②然后向步骤①反应后的混合物中加入表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个的纳米微球，步骤①中第一免疫复合物和第二免疫复合物一端的具有特异亲和性的一对物质中的一个分别与纳米微球表面标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个进行特异性结合，形成表面结合了第一免疫复合物和第二免疫复合物的纳米微球；
    ③采用分离的方式将步骤②中表面结合了第一免疫复合物和第二免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，加注电解液；
    ④采用三电极体系或二电极体系进行测定，将电极连接在电化学工作站上，利用电化学检测方法测定纳米微球表面的免疫复合物上的金属离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中金属离子理论特征峰的±100mV范围内寻找实际特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Logit回归方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
  24. 根据权利要求21至23任一所述的基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：所述金属离子材料为表面或内部含有金属离子的微球；所述金属离子为Cd 2+、Cu 2+、Zn 2+、Mn 2+、Pb 2+、Ag +、Li +、Hg 2+、Co 2+、Cr 3+、Ni 2+、Au 3+、Ba 2+离子中的一种；所述微球为聚苯乙烯微球、聚四氟乙烯微球、二氧化钛微球、二氧化锰微球、二氧化锆微球、有机硅微球、聚酰胺微球、聚丙烯酸微球、壳聚糖微球、聚苯胺微球、聚氯乙烯微球、钴微球、镍微球、铂微球、金微球、银微球、钯微球、二氧化硅微球或磁性微球。
  25. 根据权利要求24所述的基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：所述纳米微球为聚苯乙烯微球、聚四氟乙烯微球、二氧化硅微球、二氧化钛微球、有机硅微球、聚酰胺微球、聚丙烯酸微球、壳聚糖微球、聚苯胺微球、聚氯乙烯微球或磁性微球。
  26. 根据权利要求21至23任一所述的基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：所述分离方式为离心分离、电场或毛细管作用；或者当纳米微球的材质为磁性微球时，则所述分离方式采用磁分离的方式；所述磁性微球为磁性的Fe 3O 4、γ-Fe 2O 3、Pt、Ni或Co微球，或者为磁性的Fe 3O 4、γ-Fe 2O 3、Pt、Ni或Co与无机物或有机物形成的核/壳结构或掺杂结构的微球。
  27. 根据权利要求21至23任一所述的基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：所述金属离子材料的粒径为1～500nm，纳米微球的粒径为50nm～5μm；所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结合此抗体的二抗。
  28. 根据权利要求21至23任一所述的基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：在步骤③中，移除反应池中的剩余液体后可采用PB缓冲液洗涤2～3遍，再加注电解液。
  29. 根据权利要求21至23任一所述的基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：所述的三电极体系包括工作电极、对电极和参比电极；所述二电极体系包括工作电极和对电极；所述工作电极为铜电极、碳电极、玻碳电极、金微电极，或者在上述电极里掺杂石墨烯的电极，或者在上述电极表面涂 覆石墨烯的电极；所述对电极为铂丝电极；所述参比电极为甘汞电极、Ag/AgCl电极；所述电化学检测方法为循环伏安法、微分伏安法、差分脉冲伏安法、交流阻抗谱图法、阳极溶出伏安法或者微分脉冲阳极溶出伏安法。
  30. 根据权利要求21至23任一所述的基于金属离子标记的电化学检测方法，其特征在于：所述电解液为0.01M～0.6M、pH＝7.4的磷酸缓冲溶液；0.01M～0.6M、pH＝3～7的柠檬酸缓冲溶液；0.01M～0.6M、pH＝2～7的醋酸缓冲溶液；由0.1mM～1M的K 3[Fe(CN) 6]/K 4[Fe(CN) 6]和0.1mM～1M的KCl组成的铁氰化钾电解液。
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