TWI539152B - Biological sensor and the method of detecting the concentration of the analyte in the sample - Google Patents

Biological sensor and the method of detecting the concentration of the analyte in the sample Download PDF

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TWI539152B
TWI539152B TW104115392A TW104115392A TWI539152B TW I539152 B TWI539152 B TW I539152B TW 104115392 A TW104115392 A TW 104115392A TW 104115392 A TW104115392 A TW 104115392A TW I539152 B TWI539152 B TW I539152B
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Hsiao Chien Chen
Yi Ting Chen
Rung Ywan Tsai
Min Cheng Chen
Chien Lun Chen
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Description

生物感測器及檢測樣品中待測物濃度的方法
本發明是有關於一種生物感測器(biosensor)及檢測樣品中待測物濃度的方法，特別是指一種奈米線場效電晶體(nanowire field-effect transistor)生物感測器及用其檢測樣品中待測物濃度的方法。
隨著科技不斷進步，生物感測器已被大量應用於各種疾病診斷上，其中，由半導體奈米材料所製得如奈米線場效電晶體等的奈米級生物感測器因具有高靈敏度、高選擇性、能快速分析等優勢，更廣受矚目。
石墨烯片(graphene sheet)因具有高表面積及優越的導電性，常被用來修飾場效電晶體，但是石墨烯片缺乏能用來固定生物分子(如抗體)的官能基，難以應用於生物感測器上，因此，如何修飾場效電晶體上的石墨烯片，使石墨烯片能與生物分子連接為近年來熱門的研究方向。
過去有多個研究指出[如Materials Chemistry and Physics,vol.136(2012),p304-308；Nanoscale,2013,vol.5,p3620-3626等]，先利用Hummer’s方法(Hummer’s method)改良場效電晶體上的石墨烯片，使石墨烯片上修飾有碳數為1的短鏈羧酸基後，再藉由該短鏈羧酸基與生 物分子連接，以製備生物感測器。然而，利用Hummer’s方法修飾石墨烯後所製得的生物感測器，其連接於感測器上之生物分子的數量及生物活性(bioactivity)都偏低，導致生物感測器的靈敏度下降。
因此，如何解決前述利用Hummer’s方法修飾生物感測器上石墨烯所產生的問題，並找到一種能提高連接於感測器上之抗體(生物分子)的數量及生物活性的生物感測器，成為目前致力研究的目標。
因此，本發明之第一目的，即在提供一種能提高連接於感測器上之抗體的數量及生物活性的生物感測器。
於是本發明生物感測器包含一奈米線場效電晶體、一固定層及至少一偵測單元。
該奈米線場效電晶體包括一半導體通道。
該固定層位於該半導體通道上。
該偵測單元連接在該固定層上，包括一複合物及至少一透過-(C=O)-X-(C=O)-而與該複合物連接的抗體。該複合物包括一表面含有多數個-(C=O)-X-COOH之經改質石墨烯，以及多數個承載於該經改質石墨烯上的磁性奈米粒子，其中該X表示C2~C3伸烯基或C1~C3伸烷基。
因此，本發明之第二目的，即在提供一種檢測樣品中待測物濃度的方法，包含一施加電壓步驟、一結合 步驟及一量測步驟。
該施加電壓步驟是於如前述的生物感測器施加一固定電壓。
該結合步驟是在該固定電壓下使該生物感測器與該待測物接觸。
該量測步驟是分別量測該生物感測器於該待測物與其接觸前後的電流變化，並依據以不同待測物濃度所得之電流校正曲線及該電流變化計算出該樣品中的待測物濃度。
本發明之功效在於：用以讓該複合物與該抗體連接之-(C=O)-X-(C=O)-具有較高的碳數，而具有更高自由度，並進而能減少於連接抗體時所產生的立體障礙(steric hindrance)，同時提高連接於感測器上之抗體(即生物分子)的數量；此外，-(C=O)-X-(C=O)-與抗體連接後，能以任意角度進行延展及彎曲，使連接在該複合物上的抗體產生更大的空間來和蛋白質連接，而能提高連接在該複合物上抗體的生物活性。因此，本發明的生物感測器，其連接於感測器上之抗體的數量及生物活性都能提高，因而能提升生物感測器的靈敏度。
以下將就本發明內容進行詳細說明：
[生物感測器]
本發明的生物感測器包含一奈米線場效電晶體，較佳地，該奈米線場效電晶體為多晶矽奈米線場效電晶體(polycrystalline silicon nanowire field-effect transistor，簡稱poly-SiNW-FET)。在本發明的具體實施例中，該奈米線場效電晶體為n-型(n-type)多晶矽奈米線場效電晶體。
本發明的生物感測器包含一固定層。較佳地，該固定層是先使胺基矽烷類化合物於奈米線場效電晶體的半導體通道表面上形成自組裝單層膜(self-assembled monolayer)後，再使二醛化合物與該自組裝單層膜接觸而製得，而所製得的固定層表面將含有醛基，以利於後續與該偵測單元進行連接。更佳地，該胺基矽烷類化合物為3-胺基丙基三乙氧基矽烷[(3-aminopropyl)triethoxysilane，簡稱APTES]或3-胺基丙基三甲氧基矽烷[(3-aminopropyl)trimethoxysilane，簡稱APTMS]，該二醛化合物為戊二醛(glutaraldehyde，簡稱GA)、乙二醛(glyoxal)、丙二醛(malonaldehyde)、丁二醛(succinaldehyde)或己二醛(adipaldehyde)。在本發明的具體實施例中，該胺基矽烷類化合物為3-胺基丙基三乙氧基矽烷，該二醛化合物為戊二醛。
本發明的生物感測器包含至少一連接在該固定層上的偵測單元。該偵測單元包括一複合物及至少一透過-(C=O)-X-(C=O)-而與該複合物連接的抗體。該複合物包括一表面含有多數個-(C=O)-X-COOH之經改質石墨烯，以及多數個承載於該經改質石墨烯上的磁性奈米粒子，其中該X表示C2~C3伸烯基或C1~C3伸烷基。
較佳地，該複合物的尺寸範圍為30~50nm。
較佳地，該X表示C2~C3伸烯基。更佳地，該X表示伸乙烯基。
較佳地，該抗體為用於偵測膀胱癌的生物標記(biomarker)。更佳地，該抗體為抗-脂蛋白元A II抗體[anti-APOA2(apolipopretein A II)antibody]。
較佳地，該經改質的石墨烯是先使二酸酐與催化劑反應後，再與石墨進行反應而製得，其中，該催化劑與該二酸酐的莫耳數比值範圍為1~6。當該催化劑與該二酸酐的莫耳數比值大於6時，由於所添加催化劑的量較多，較易增加反應溶液的黏度因而較易阻礙反應時的碰撞，使該經改質石墨烯上的-(C=O)-X-COOH的比例較低；當該催化劑與該二酸酐的莫耳數比值小於1時，由於所添加催化劑量較少，因而二酸酐進行開環反應的量也較少，進而使該經改質石墨烯上的-(C=O)-X-COOH的比例也跟著下降。更佳地，該催化劑與該二酸酐的莫耳數比值為2~4。又更佳地，該催化劑與該二酸酐的莫耳數比值為3。又更佳地，該二酸酐為順丁烯二酸酐(maleic anhydride,MA)或丁二酸酐(succinic anhydride)。
需特別說明的是，藉由先使該經改質石墨烯上的-(C=O)-X-COOH與N-羥基硫代琥珀醯亞胺鈉鹽(N-hydroxysulfo-succinimide sodium salt,sulfo-NHS)及1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC]反應後，再和抗體反應，能使該抗體與-(C=O)-X-COOH連接。
此外，在將抗體與-(C=O)-X-COOH連接的製程中，透過承載於該經改質石墨烯上的該等磁性奈米粒子可以減少純化時間，因此能防止抗體因純化時間過長而發生變性(denaturation)。
較佳地，該等磁性奈米粒子分別是選自於氧化鐵磁性奈米粒子、鎳磁性奈米粒子或前述的組合。在本發明的具體實施例中，該等磁性奈米粒子為氧化鐵磁性奈米粒子。
較佳地，該等磁性奈米粒子的平均粒徑範圍為4~50nm。更佳地，該等磁性奈米粒子的平均粒徑範圍為4~10nm。
[生物感測器的製備方法]
本發明的生物感測器是先使奈米線場效電晶體的半導體通道上形成一固定層後，再使偵測單元連接於該固定層上而製得。
該偵測單元是先使石墨烯經-(C=O)-X-COOH修飾，再使該經改質石墨烯承載多數個磁性奈米粒子後，最後讓抗體與該-(C=O)-X-COOH連接而製得。
本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1一SEM相片，說明實施例1之生物感測器中n-型多晶矽奈米線場效電晶體的微觀結構；圖2是一相片，說明石墨、製備例1(GLA13)與比較製備 例1(GSA)於水中的溶解度比較；圖3是一吸收光譜圖，說明石墨、製備例1~3(GLA11、GLA13、GLA16)與比較製備例1(GSA)的測試結果；圖4一X-射線光電子能譜，說明石墨的測試結果；圖5是一X-射線光電子能譜，說明製備例(GLA13)的測試結果；圖6是一FT-IR光譜圖，說明石墨、製備例1~3(GLA11、GLA13、GLA16)與比較製備例1(GSA)的測試結果；圖7是一柱狀圖，說明石墨、製備例1~3(GLA11、GLA13、GLA16)與比較製備例1(GSA)的羧酸基密度比較；圖8是一熱重分析光譜，說明石墨、製備例2(GLA13)與比較製備例1(GSA)的測試結果；圖9是一XRD光譜圖，說明Ni、石墨與製備例1~3(GLA11、GLA13、GLA16)的測試結果；圖10是一TEM相片，說明製備例1(GLA11)的結構；圖11是一TEM相片，說明製備例2(GLA13)的結構；圖12是一TEM相片，說明製備例3(GLA16)的結構；圖13是一TEM相片，說明製備例4(MGLA)的結構；圖14是一吸收光譜圖，說明氧化鐵(Fe3O4)、製備例2(GLA13)與製備例4(MGLA)的測試結果；圖15是一相片，說明製備例2(GLA13)與製備例4(MGLA)的磁性分析結果；圖16是一XRD光譜圖，說明製備例2(GLA13)與製備例4(MGLA)的測試結果； 圖17是一FT-IR光譜圖，說明氧化鐵(Fe3O4)、製備例2(GLA13)與製備例4(MGLA)的測試結果；圖18是一磁化曲線圖，說明製備例2(GLA13)、製備例4(MGLA)與比較製備例2(MGSA)的測試結果；圖19是一柱狀圖，說明製備例4(MGLA)與比較製備例2(MGSA)的羧酸基密度比較；圖20是一點狀圖，說明利用Bio-Plex分析控制組(疝氣病人)與膀胱癌病人尿液樣品所得的結果；圖21是一光學密度校正曲線圖，說明抗-脂蛋白元A II抗體的測試結果；圖22是一光學密度校正曲線圖，說明脂蛋白元A II蛋白質的測試結果；圖23是一曲線關係圖，說明於製備Ab-MGLA與Ab-MGSA過程中所添加抗體的重量，與連接於Ab-MGLA與Ab-MGSA上的抗-脂蛋白元A II抗體重量的關係；圖24是一ISD-VG曲線圖，說明實施例1~4之生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)於加入脂蛋白元A II蛋白質前後的電流變化；圖25是一柱狀圖，說明未加入脂蛋白元A II蛋白質時，干擾物質對實施例3之生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)的影響；圖26是一折線圖，說明於脂蛋白元A II蛋白質存在下，干擾物質對實施例3之生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)的影響； 圖27是一ISD-VG曲線圖，說明脂蛋白元A II蛋白質濃度對實施例3之生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)於加入不同濃度之脂蛋白元A II蛋白質後的電流變化；圖28是一直線關係圖，說明脂蛋白元A II蛋白質濃度分別對實施例3之生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)與比較例1之生物感測器(Ab-MGSA/poly-SiNW-FET)的影響；及圖29是一柱狀圖，說明分別利用Bio-Plex與實施例3之生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)量測疝氣病人與膀胱癌病人尿液中脂蛋白元A II蛋白質濃度的結果。
本發明將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。
<藥品來源>
<製備例1~3>
製備表面含有-(C=O)-CH=CH-COOH的經改質石墨烯(以下簡稱GLA)
製備例1~3的GLA(GLA11、GLA13、GLA16)是分別根據表1選擇AlCl3/MA莫耳數比值，再依據以下步 驟製得：
步驟(1)：利用超音波震盪使50g石墨暫時分散於10mL無水NMP中，製得石墨溶液。
步驟(2)：於氮氣環境下，將1g順丁烯二酸酐溶解於40mL無水NMP後，於90℃下，再根據表1之比例添加氯化鋁於其中，攪拌3小時後，製得二酸酐混合溶液。
步驟(3)：將步驟(1)所得的石墨溶液加入步驟(2)所得的二酸酐混合溶液中，於160℃下反應48小時後，製得GLA粗產物溶液。
步驟(4)：將步驟(3)所得的GLA粗產物溶液利用孔徑大小為0.1μm的聚(二氟亞乙烯)(PVDF)過濾膜過濾，同時使用甲醇及去離子水清洗三次，並將濾液於3000rpm的速度下進行離心得到黃色溶液，再將該黃色溶液利用孔徑大小為0.1μm的PVDF過濾膜過濾後，於濾紙上即可得到表面含有-(C=O)-CH=CH-COOH的經改質石墨烯。
<製備例4>
製備複合物(以下簡稱MGLA)
步驟(1)：先將200mg製備例2所得的GLA13 分散於20mL的去離子水中後，再以聚焦式超音波震盪方式對分散於水中之GLA13，於4℃下持續震盪24小時後，得到GLA13水溶液。
步驟(2)：將4.32mmole FeCl3與6.48mmole FeCl2‧4H2O於27℃下，溶解於380mL的去離子水中後，得到含鐵溶液。
步驟(3)：於氮氣環境下，將步驟(1)所得的GLA13水溶液與步驟(2)所得的含鐵溶液混合後，緩慢將溶液加熱至50℃後，再緩慢加入30mL濃度為0.576N的NaOH(滴加時間超過20分鐘)，最後將溶液加熱至80℃後，使用冰快速冷卻溶液，再緩慢加入濃度為0.1N的HCl溶液至溶液pH值呈中性，即製得含MGLA粗產物溶液。
步驟(4)：利用磁場將MGLA粗產物從步驟(3)所得的含MGLA粗產物溶液中分離出來後，使用去離子清洗MGLA粗產物多次，即製得複合物[包括表面含有-(C=O)-CH=CH-COOH的經改質石墨烯及多數個承載於該經改質石墨烯上的氧化鐵(Fe3O4)磁性奈米粒子](以下簡稱MGLA)。
<製備例5~10>
製備偵測單元(簡稱Ab-MGLA)
製備例5~10的偵測單元(Ab-MGLA)是分別根據表2選擇所添加抗-脂蛋白元A II抗體(Ab)的重量(ng)，再依據以下步驟製得：
步驟(1)：將製備例4所得的MGLA以去離子水配製成濃度為10μg/mL的MGLA水溶液。
步驟(2)：於無光照環境下，將50mg 1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺(EDC)與60mg N-羥基硫代琥珀醯亞胺鈉鹽(sulfo-NHS)溶解於5mL MES緩衝液(pH為6.3)中，得到反應添加液。
步驟(3)：於無光照環境下，先將0.1mL步驟(1)所得的MGLA水溶液與0.2mL步驟(2)所得的反應添加液混合，於25℃下搖動30分鐘後，再藉由磁鐵分離出固體，並利用0.8mL MES緩衝液清洗固體，即製得MGLA反應前驅物。
步驟(4)：先將步驟(3)所得的MGLA反應前驅物重新懸浮分散於0.2mL MES緩衝液，於25℃下再與抗-脂蛋白元A II抗體(添加量如表2)混合3小時，使抗體與複合物連接後，即製得含Ab-MGLA粗產物溶液。
步驟(5)：藉由磁鐵將Ab-MGLA粗產物從步驟 (4)所得的含Ab-MGLA粗產物溶液中分離出來後，使用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)清洗Ab-MGLA粗產物移除剩餘的抗-脂蛋白元A II抗體後，即製得偵測單元(Ab-MGLA)。
<製備例11>
製備n-型多晶矽奈米線場效電晶體(poly-SiNW-FET)
製備例11的n-型poly-SiNW-FET是根據標準6英吋p-型晶圓(p-type wafer)的方法製備，其步驟簡述如下：
步驟(1)：於矽基底(substrate)表面先沉積一層30nm氧化物(SiO2)後再沉積一層50nm氮化物(SiNX)作為絕緣層，以避免場效電晶體表面的反應物質會滲入至矽基底。
步驟(2)：利用化學氣相沉積法(chemical vapor deposition)，於氮化物上沉積50nm的多晶矽(polycrystalline silicon)，形成多晶矽層。
步驟(3)：利用互補式金屬氧化物半導體(CMOS)製程的I-line光學步進曝光機(I-line stepper)圖形化(pattern)多晶矽層，使其形成奈米線。其中，本步驟是藉由重複進行反應式電漿蝕刻(reactive plasma etching)及矽蝕刻微縮光阻(photoresist)，使多晶層先形成寬約0.3μm的奈米線。
步驟(4)：利用I-line微影製程(I-line lithography)形成半導體通道保護光阻，其除了可防止半導 體通道被植入n+源極/汲極(S/D)外，亦可增加奈米線的場效靈敏度(field sensitivity)。
步驟(5)：藉由使用1015cm-2 P31 +離子束(10keV)於奈米線上植入n+源極/汲極(S/D)，以減少奈米線的寄生阻力(parasitic resistance)。
步驟(6)：移除半導體通道保護光阻後，於600℃及氮氣環境下退火(anneal)30分鐘，以活化源極/汲極(S/D)。
步驟(7)：於電晶體上沉積薄SiNx保護層(passivation layer)，以防止矽基底閘極(gate)於測試pH值時會被所使用的溶液破壞，最終即製得n-型多晶矽奈米線場效電晶體(poly-SiNW-FET)。
參閱圖1，即為由前述方法所製得n-型多晶矽奈米線場效電晶體的SEM相片，由SEM相片可知，最終所製得場效電晶體的奈米線(也就是半導體通道)長為2μm且寬為0.15μm。
<實施例1~4>
製備生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)
實施例1~4的生物感測器是分別根據表3選擇偵測單元(Ab-MGLA)的反應濃度(使用製備例8的Ab-MGLA；溶劑為PBS)，再依據以下步驟製得：
步驟(1)：取5μL濃度為2wt%的APTES乙醇溶液與製備例11所得的poly-SiNW-FET接觸1小時後，使APTES於半導體通道表面上形成表面具有胺基末端的自組裝單層膜。
步驟(2)：將經步驟(1)處理後的poly-SiNW-FET先使用乙醇清洗，並於100℃烘箱內進行乾燥1小時，再使poly-SiNW-FET與5μL濃度為5wt%的戊二醛水溶液接觸1小時後，於poly-SiNW-FET的半導體通道表面上即會形成一表面具有醛基末端的固定層。
步驟(3)：將經步驟(2)處理後含有固定層的poly-SiNW-FET與5μL製備例8的Ab-MGLA PBS溶液(根據表3選擇濃度)接觸1小時，使偵測單元與固定層連接後，再於4℃及非光照環境下，與5μL濃度為5mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)PBS溶液接觸1小時，以阻斷(block)非特異性結合(non-specific binding)，最終再用PBS清洗三次，即製得生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)。
<比較製備例1>
製備表面含有-COOH的經改質石墨烯(以下簡 稱GSA)
比較製備例1之GSA是根據Hummer’s方法製備，其步驟如下：
步驟(1)：先將1g石墨與0.5g硝酸鈉混合，並加入23mL濃硫酸(濃度為95wt%)持續攪拌1小時，再於低於20℃的溫度下緩慢加入3g過錳酸鉀後，於35℃下攪拌12小時，最終在強烈攪拌下加入500mL水稀釋，即製得GSA粗產物溶液。
步驟(2)：為了確保與過錳酸鉀的反應完成，將步驟(1)所得的GSA粗產物溶液之懸浮物與5mL濃度為30wt%的雙氧水接觸，最終將所有固體混合並分別以鹽酸和水清洗，再經過濾和乾燥後，即製得GSA。
<比較製備例2>
製備複合物(以下簡稱MGSA產物)
比較製備例2之製備方法與製備例4相同，其差別在於，步驟(1)為使用比較製備例1所得的GSA，而非使用GLA13。
<比較製備例3~8>
製備偵測單元(簡稱Ab-MGSA)
比較製備例3~8之製備方法與製備例5~10相同，其差別在於，該步驟(3)為使用0.1mL濃度為21.3μg/mL的MGSA水溶液，而非使用MGLA水溶液。其中，比較製備例3~8的偵測單元之抗-脂蛋白元A II抗體(Ab)添加量分別如表4所示。
<比較例1>
製備生物感測器(Ab-MGSA/poly-SiNW-FET)
比較例1之製備方法與實施例1~4相同，其差別在於，該步驟(3)為使用5μL濃度21.3μg/mL為比較製備例7的Ab-MGSA PBS溶液，而非使用Ab-MGLA產物。
<石墨、GLA、GSA於水中之溶解度測試>
石墨、製備例2之GLA(GLA13)與比較製備例1之GSA於水中的溶解度如圖2相片所示。
從圖2可以發現，相較於石墨，GSA與GLA皆能分散於水中，表示GLA與GSA皆存在有親水基(酸基)。
<石墨、GLA、GSA的水溶液吸收光譜>
將石墨、製備例1~3之GLA(GLA11~GLA16)與比較製備例1之GSA分別溶於去離子水中，並以吸收光譜儀(型號：Perkin-Elmer Lambda 800/900)測定吸收光譜，所得結果如圖3所示。
由圖3可以發現，GLA13~GLA16於226nm皆具有一吸收峰，其與芳香族C=C吸收帶(absorption band) 之π-π*遷移(π-π* transition)與C=O吸收帶之n-π*遷移有關，說明製備例1~3之GLA為經-(C=O)-CH=CH-COOH改質的石墨烯。此外，於圖3中，GLA11~GLA16在大於300nm後具有比GSA更高的吸收強度，其是由於比較製備例1中所依據的Hummer’s方法，需添加強氧化劑來破壞石墨烯的平面及邊緣結構，以形成酸基及其它含氧基，而製備例1~3所依據方法為Friedel-Crafts醯基化(acylation)反應，其是於具有高電子密度的結構(邊緣位置)上進行芳香族親電子取代(electrophilic aromatic substitution)，因此，由製備例1~3方法所得的GLA較能維持共振結構，進而於300nm後會有較高的吸收強度。
特別值得一提的，從圖3還可以發現，GLA13相較於GLA11與GLA16，於200~900nm間皆具有較高的吸收強度，即GLA13的石墨烯上的-(C=O)-CH=CH-COOH的含量比例較GLA11與GLA16高。
<石墨、GLA的X-射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)分析>
將石墨、製備例2之GLA(GLA13)分別以X-射線光電子能譜儀(型號：VG Scientific ESCALAB 250系統)測定Cls光譜，所得結果如圖4(石墨)與圖5(GLA13)所示。
由圖4可知，石墨之Cls光譜是由兩根峰疊合而成，此兩根峰分別為於284.6eV的芳香環(C=C/C-C)與於286.1eV的原始羥基及環氧/醚基(C-O-C)缺陷結構，又， 根據圖4所計算出之石墨缺陷結構比例(缺陷結構面積佔總面積的比例)為14.0%；而由圖5可知，GLA可拆解為4根峰，其中287.7eV為酮的C=O(佔總面積的8.7%)，288.9eV為O-C=O(佔總面積的8.7%)，前述兩根峰的鍵結能(binding energy)符合1-酮-丁烯酸(1-one-butenoic acid)的理論值，說明GLA為經-(C=O)-CH=CH-COOH改質的石墨烯。此外，若同時比較圖4與圖5，也可以發現石墨與GLA的缺陷結構比例並無太大差異，表示石墨變成GLA後，其共振結構幾乎被完整保存下來。
<石墨、GLA、GSA的傅立葉紅外線(Fourier-transform infrared,FT-IR)光譜分析>
分別將石墨、製備例1~3之GLA(GLA11~GLA16)與比較製備例1之GSA利用FT-IR光譜儀(型號：Bruker-Tensor 27)測定FT-IR光譜[光譜解析度(spectra resolution)為8cm-1]，所得結果如圖6所示。
石墨典型具有於1530cm-1(νC=C)的C=C伸縮(stretch)振動光譜帶。而從圖6的GLA13光譜可以觀察到，相較於石墨，藉由Friedel-Crafts醯基化反應所製得的GLA13多了1703cm-1(νC=O)、1613cm-1(石墨烯的νC=C與酮的νC=O重疊)、1445cm-1與1264cm-1[於平面O-H彎曲(bend)振動與雙體C-O伸縮振動間的耦合(coupling)]、1375cm-1(-CH2彎曲振動)之峰，且GLA13光譜並未發現順丁烯二酸酐於1869或1777cm-1的特色峰(不對稱及對稱νC=O)，證實GLA13的石墨烯邊緣位置具有由順丁烯二酸酐進行開 環反應後所形成的1-酮-丁烯酸結構[即-(C=O)-CH=CH-COOH]，且又由於1-酮-丁烯酸於水中具有陰離子的負電荷排斥作用，而能使GLA更容易地分散於水中。
<石墨、GLA、GSA的羧酸密度分析>
根據於633nm的吸收光譜，並使用甲苯胺藍(TBO)作為探針(Surf.Coat.Technol.,vol.205,S534-S536)，分別定量石墨、製備例1~3之GLA(GLA11~GLA16)、比較製備例1之GSA的羧酸基密度[羧酸基含量(mol)/石墨、GLA或GSA重量(mg)]，所得結果如圖7(n=3)所示。
由圖7可知，GLA11~GLA16的羧酸基密度皆明顯高於GSA(0.38×10-6mol/mg)，說明GLA11~GLA16相較於GSA，具有更多於後續能用在連接抗體的連接基團[即-(C=O)-CH=CH-COOH]。而特別值得一提的，GLA13又具有更高的羧酸基密度(1.33×10-6mol/mg)。
<石墨、GLA、GSA的熱重分析(thermal gravimetric analysis,TGA)>
分別將石墨、製備例2之GLA(GLA13)與比較製備例1之GSA進行熱重分析(100~690℃)，所得結果如圖8所示。
從圖8可以發現，石墨由於具有高伸縮性，所以只有些許重量損失，GLA與GSA則由於在化學改質過程中會破壞結構且形成較不穩定的側鏈，因此重量損失較為明顯；而從圖8還可以發現，GSA於約100℃時開始有重量 損失，相較於GSA，GLA於240℃才開始有重量損失，說明GLA具有較穩定的側鏈結構，此外，GLA總損失重量高於GSA，也說明相較於GSA，GLA具有分子量較高的側鏈，且GLA的經改質石墨烯含有-(C=O)-CH=CH-COOH的比例也較GSA含有-COOH的比例高。
<石墨、GLA的X-射線繞射(X-ray diffraction,XRD)分析>
分別將石墨與製備例1~3之GLA(GLA11~GLA16)與鎳混合(鎳含量為15wt%)後，以X-射線繞射儀[型號：RigakuD/Max-2B，搭配鎳-過濾Cu Kα射線(nickel-filtered Cu Kα radiation)]分析，其中，掃描速率為1°/min，掃瞄範圍為5°~90°，所得結果如圖9所示。
由圖9可知，GLA(GLA11~GLA16)具有44.8°、52.2°及76.7°的繞射峰；另外，石墨具有兩個因晶體重堆積所形成的繞射峰26.9°及55.0°，然而從GLA的光譜可以觀察到，26.9°的繞射峰產生位移且強度變小，55.0°的繞射峰則消失不見，說明GLA的晶體重堆積已被破壞，亦即石墨確實會片狀剝離成石墨烯。
<GLA、MGLA的穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)分析>
將製備例1~3之GLA(GLA11~GLA16)與製備例4的MGLA利用穿透式電子顯微鏡(型號：Hitachi H-7500系統)拍照，所得相片如圖10(GLA11)、圖11(GLA13)、圖12(GLA16)及圖13(MGLA)所示。
觀察圖10~12的相片可以發現，GLA為外觀皆具有皺紋的透明薄片，符合石墨烯片的結構特色，說明透過Friedel-Crafts醯基化反應，石墨確實可以被功能化且會片狀剝離成石墨烯片。
觀察圖13的相片可以發現，MGLA中的複合物尺寸約為40nm且表面承載有多數個平均粒徑為5nm的Fe3O4磁性奈米粒子，此外，並無觀察到任何未承載於石墨烯上的自由奈米粒子在MGLA裡面或分散於MGLA周圍，說明奈米粒子是吸附於GLA上，且未承載於GLA上的自由奈米粒子則在純化過程中已被除去。
<Fe 3 O 4 、GLA、MGLA的水溶液吸收光譜分析>
分別將Fe3O4磁性奈米粒子、製備例2之GLA(GLA13)與製備例4之MGLA分別溶於去離子水中，並以吸收光譜儀(型號：Perkin-Elmer Lambda 800/900)測定吸收光譜，所得結果如圖14所示。
由圖14可知，相較於GLA的光譜，MGLA於約400nm處多了一與Fe3O4磁性奈米粒子有關的肩峰(shoulder)，說明GLA已成功承載磁性奈米粒子並形成MGLA。
<GLA、MGLA的磁性分析>
分別將製備例2之GLA(GLA13)、製備例4之MGLA溶於水中，並利用一磁鐵測定GLA與MGLA的磁性，經拍照後所得相片如圖15所示。
根據圖15的相片，可以發現MGLA皆被磁鐵吸附於瓶壁一側，而GLA仍分散於水中，表示MGLA具有磁性，因此說明GLA已成功承載磁性奈米粒子並形成MGLA。
<GLA、MGLA的X-射線繞射(XRD)分析>
分別將製備例2之GLA(GLA13)及製備例4之MGLA，以X-射線繞射儀(型號：RigakuD/Max-2B)分析，所得結果如圖16所示。
由圖16可知，相較於GLA，MGLA多了30.4°、35.8°、43.5°、53.7°、57.3°及63.1°六根因Fe3O4結晶所形成的繞射峰，說明GLA已成功承載磁性奈米粒子形成MGLA。
<Fe 3 O 4 、GLA、MGLA的傅立葉紅外線(FT-IR)光譜分析>
分別將Fe3O4、製備例2之GLA(GLA13)與製備例4之MGLA利用FT-IR光譜儀(型號：Bruker-Tensor 27)測定FT-IR光譜[光譜解析度(spectra resolution)為8cm-1]，所得結果如圖17所示。
從圖17可以發現，MGLA於584cm-1處有Fe-O的特徵峰，但相較於Fe3O4奈米粒子，紅位移了2cm-1，其是由於GLA和Fe3O4間的相互作用所造成。
<GLA、MGLA、MGSA的磁化(magnetization)分析>
分別將製備例2之GLA(GLA13)、製備例4之 MGLA與比較製備例2之MGSA，以超導量子干涉磁量儀(superconducting quantum interference device,SQUID；廠商型號：Quantum Design MPMS7)進行磁化分析，所得結果如圖18所示。
從圖18可以發現，從GLA至MGLA的磁化量從0增加至51.0emu/g，此外，MGSA的磁化量為61.0emu/g高於MGLA的51.0emu/g，其可能是因為於石墨變成GSA過程中所發生的結構破壞，會產生容易吸附磁性奈米粒子的氧基，因此MGSA的磁化量會高於MGLA。
<MGLA、MGSA的羧酸基密度分析>
根據於633nm的吸收光譜，並使用甲苯胺藍(TBO)作為探針(Surf.Coat.Technol.,vol.205,S534-S536)，分別定量製備例4之MGLA與比較製備例2之MGSA的羧酸基密度[羧酸基含量(mol)/MGLA或MGSA重量(mg)]，所得結果如圖19所示。
GLA與GSA經承載磁性奈米粒子後所形成的MGLA與MGSA，其羧酸基密度分別為0.17×10-6mol/mg(MGLA)與0.08×10-6mol/mg(MGSA)，皆低於先前所測得GLA(1.33×10-6mol/mg)與GSA(0.38×10-6mol/mg)的羧酸基密度，此是由於磁化過程中需加入強鹼溶液，導致部分連接基團(酸鏈)會被破壞。
<尿液中脂蛋白元A II(apolipopretein A II,APOA2)蛋白質的定量對於膀胱癌的重要性>
(a)臨床尿液樣品的收集：
臨床尿液樣品是根據J.Proteome Res.,vol.9,p5803-5815及J.Proteomics,vol.75,p3529-3545中的方法收集，其步驟簡述如下：
步驟(1)：分別收集疝氣病人(控制組)與膀胱癌病人早晨第一次的尿液(來源：長庚紀念醫院泌尿科)至包含蛋白酶抑制混合片(protease inhibitor cocktail tablet；來源：Roche,Mannheim,Germany)與1mM疊氮化鈉(sodium azide)的容器中，其中，所添加蛋白酶抑制混合片的量為1片/50mL尿液。
步驟(2)：將步驟(1)容器內的尿液，在收集後的5小時內，於4℃下離心30分鐘(5000×g)，移除細胞及殘餘物後，上層澄清液即為尿液樣品。需說明的是，尿液樣品於測試前皆是置於-80℃下保存。
(b)利用Bio-Plex分析測定尿液樣品中的脂蛋白元A II蛋白質含量：
在本實驗中，尿液樣品的APOA2蛋白質數量是藉由Bio-Plex系統(Bio-Rad實驗室)中的MILLIPLEX MAP人類脂蛋白面板組(human apolipoprotein panel kit；Millipore,MA,USA)來決定；其中，前述測定方法是修改自Millipore所提供血液的合適樣品收集(blood sample-suitable protocol)方法，而實驗中的免疫珠(immunobead)是利用Bio-Plex 200系統(Bio-Rad實驗室)分析，標準曲線及分析物濃度則是藉由版本4.2的Bio-Plex Manager軟體(Bio-Rad實驗室)而得到。
本實驗共有20個尿液樣品[10個疝氣病人(控制組)；10個膀胱癌病人]皆是利用人類脂蛋白面板組[商業所使用的96-孔盤免疫測定法(96-well plate immunoassy)]進行分析，所得最終結果如圖20所示。
(c)結果與討論：
由圖20結果可知，膀胱癌病人尿液中的脂蛋白元A II蛋白質的量為131.45ng/mL，約為疝氣病人(2.41ng/mL)的54.5倍[控制組n=48及膀胱癌病人n=63；p<0.001；曲線下面積(area under the curve,AUC)=0.864]，說明藉由尿液中脂蛋白元A II蛋白質的量可以用來診斷膀胱癌。
<利用酵素免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)定量抗-脂蛋白元A II抗體(anti-APOA2 antibody)>
分別先將150μL濃度為300、150、75、37.5、18.8、9.4、4.7及2.3ng/mL的抗-脂蛋白元A II抗體PBS溶液置於酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader；型號：Thermo Labsystems,Franklin,MA)的Microlite 2多孔盤上1.5小時，再利用PBS沖洗，並分別加入150μL濃度為5mg/mL的牛血清白蛋白之PBS溶液作為阻斷劑，經1.5小時後，分別加入150μL濃度為1.95μg/mL的脂蛋白元A II蛋白質PBS溶液混合1.5小時，再次加入總量為150μL濃度為5mg/mL的牛血清白蛋白PBS溶液作為阻斷劑。最終，先分別於每孔加入100μL的生物素抗體 (biotin-antibody)並於37℃下培養1小時後，移除溶液，分別再於每盤加入90μL的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)並培養30分鐘，再分別加入50μL終止溶液(stop solution)至每孔中，同時緩慢輕敲盤以確保均勻混合後，在5分鐘內分別量測每孔樣品於450nm時的螢光(PL)強度，最後所得抗-脂蛋白元A II抗體的光學密度校正曲線(optical density calibration)如圖21(n=3)所示。需說明的是，前述方法皆是於非光照及37℃的環境下進行。
<利用酵素免疫分析(ELISA)定量脂蛋白元A II蛋白質(APOA2 protein)>
將150μL濃度為10μg/mL的抗-脂蛋白元A II抗體PBS溶液置於酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader；型號：Thermo Labsystems,Franklin,MA)的Microlite 2多孔盤上1.5小時，再利用PBS沖洗，並分別加入150μL濃度為5mg/mL的牛血清白蛋白PBS溶液作為阻斷劑，經1.5小時後，分別加入150μL濃度為55.7、24.8、12.9、6.5、3.2、1.6、0.8及0.4ng/mL的脂蛋白元A II蛋白質之PBS溶液混合1.5小時，再次加入總量為150μL濃度為5mg/mL的牛血清白蛋白PBS溶液作為阻斷劑。最終，先分別於每孔加入100μL的生物素抗體(biotin-antibody)並於37℃下培養1小時後，移除溶液，分別再於每孔加入90μL的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)基質並培養30分鐘，再分別加入50μL終止溶液(stop solution)至每盤中，同時緩慢輕敲盤以確保均勻混合後，在5分鐘內分別量測每孔樣品於 450nm時的螢光(PL)強度，最後所得脂蛋白元A II蛋白質的光學密度校正曲線如圖22(n=3)所示。需說明的是，前述方法皆是於非光照及37℃的環境下進行。
<於Ab-MGLA及Ab-MGSA上的抗-脂蛋白元A II抗體的含量分析>
連接於製備例5~10之Ab-MGLA與比較製備例3~8之Ab-MGSA上的抗-脂蛋白元A II抗體重量(ng)，是藉由酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader)量測於450nm的螢光強度(即觀察於製備過程中未連接於MGLA與MGSA上的抗體數量)，然後再依據圖21的抗-脂蛋白元A II抗體的光學密度校正曲線所計算出。最後，將於製備Ab-MGLA與Ab-MGSA過程中所添加不同的抗體重量(ng，表2與4)，及由前述所計算出連接於Ab-MGLA與Ab-MGSA上的抗-脂蛋白元A II抗體重量(ng)作圖，所得如圖23(n=3)所示。
從圖23可知，1μg的MGLA所能連接抗-脂蛋白元A II抗體的重量，最理想約為42ng(製備例8)，而2.13μg的MGSA所能連接抗-脂蛋白元A II抗體的重量，最理想約為29ng(比較製備例7)；另外，根據前述實驗所得MGLA羧酸基密度(0.17×10-6mol/mg)與MGSA羧酸基密度(0.08×10-6mol/mg)先分別計算出1μg MGLA(或2.13μg MGSA)所提供的羧酸基莫耳數後，再依據前述所能連接於1μg MGLA(或2.13μg MGSA)上的抗-脂蛋白元A II抗體重量換算成莫耳數後(抗-脂蛋白元A II抗體分子量為17.4kDa)，根據下式(I)即可計算出抗體連接度 [%(mole/mole)]，其結果如表5所示。
由表5可知，MGLA的抗體連接度為1.4%[即1.7×10-10mole的羧酸基可以連接2.4×10-12mole抗體(17.4kDa)]，MGSA抗體連接度為0.98%(即1.7×10-10mole的羧酸基可以連接1.67×10-12mole抗體)，所以MGLA所能連接抗-脂蛋白元A II抗體的莫耳數約為MGSA的1.43倍。前述現象是由於MGLA相較於MGSA具有碳數較多(碳數為4)的-(C=O)-CH=CH-(C=O)-連接基團，因此MGLA的連接基團擁有更高的自由度，在將抗體連接於連接基團時，較能克服抗體(大型生物分子)的立體障礙，進而造成MGLA所能連接抗體的莫耳數高於MGSA(連接基團碳數為1)所能連接抗體的數量，說明本發明-(C=O)-X-(C=O)-連接基團由於擁有較高碳數，因而能提高連接在連接基團上之抗體的數量(即提高抗體連接度)。
<利用酵素免疫分析(ELISA)方法分析於Ab-MGLA及Ab-MGSA之抗-脂蛋白元A II抗體的抗體生 物活性>
(a)分析方法：
步驟(1)：分別將製備例8所得Ab-MGLA與比較製備例7所得Ab-MGSA，以PBS製成濃度為0.5mg/mL的Ab-MGLA與Ab-MGSA PBS溶液。
步驟(2)：分別取100μL前述步驟(1)所得的Ab-MGLA與Ab-MGSA PBS溶液(濃度0.5mg/mL)置於酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader)的Microlite 2多孔盤上1.5小時，再分別加入150μL濃度為5mg/mL的牛血清白蛋白PBS溶液作為阻斷劑，經1.5小時後，分別加入150μL濃度為1.95μg/mL的脂蛋白元A II蛋白質PBS溶液混合1.5小時，再次加入總量為150μL濃度為5mg/mL的牛血清白蛋白PBS溶液作為阻斷劑。最終，先分別於每孔加入100μL的生物素抗體並於37℃下培養1小時後，移除溶液，分別再於每孔加入90μL的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)基質並培養30分鐘，再分別加入50μL終止溶液至每孔中，同時緩慢輕敲盤以確保均勻混合後，在5分鐘內分別量測每孔樣品於450nm時的螢光(PL)強度，最後先由前述所得的螢光強度與脂蛋白元A II蛋白質的光學密度校正曲線(圖22)分別經計算得到連接於Ab-MGLA與Ab-MGSA上的蛋白質莫耳數，及根據前述實驗結果(圖23)所得到製備例8與比較製備例7連接於MGLA與MGSA上的抗體莫耳數，再依據下式(II)分別計算出連接於Ab-MGLA與Ab-MGSA上的抗體生物活性[%(mole/mole)]，結果分別如下表6所示。需 說明的是，前述方法皆是於非光照及37℃且施予一外加磁場的環境下進行。
(b)結果與討論：
由表6數據可以發現，Ab-MGLA的抗體生物活性高於Ab-MGSA的抗體生物活性，其是因為Ab-MGSA的連接基團碳數較少(僅為1)，因此連接基團上的抗體會被限制於表面，當抗體在與大分子蛋白質(37kDa)接觸時，彼此間會產生較大的立體障礙，此外蛋白質間彼此也會有電荷排斥力(APOA2蛋白質為負電)，所以增加Ab-MGSA上之抗體目標化蛋白質的難度而影響抗體生物活性。然而，和Ab-MGSA相反，Ab-MGLA由於具有較高碳數的連接基團(碳數為4)，其能於任意角度延展或彎曲而使於Ab-MGLA上的抗體具有較大空間去目標化蛋白質，所以能提高抗體生物活性。因此，由前述說明可知，本發明的-(C=O)-X-(C=O)-連接基團由於擁有較高碳數，因而能提高連接在連接基團上之抗體的抗體生物活性。
<不同Ab-MGLA反應濃度對生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)的影響分析>
先使用50-mV偏壓(bias voltage,VB)及以0.5V/s的掃描速度量測於不同電壓VG(0~3V)時，實施例1~4之生物感測器在0.5mM PBS中的響應電流(response current)，用以作為基線電流(baseline current,I0)，所得結果如圖24的a~d所示(a為實施例1；b為實施例2；c為實施例3；d為實施例4)。另外，將5μL濃度為1ng/mL的脂蛋白元A II蛋白質PBS溶液，於非光照環境及27℃下分別注入實施例1~4之生物感測器的微流通道(microfluid channel)內(即半導體通道上)反應10分鐘，再利用0.5mM PBS清洗微流通道3次除去未反應的蛋白質，最終再注入0.5mM PBS至微流通道後，使用50-mV偏壓(VB)及以0.5V/s的掃描速度量測於不同電壓VG(0~3V)時的電流(反應後電流)，所得結果如圖24的a'~d'所示(a'為實施例1；b'為實施例2；c'為實施例3；d'為實施例4)。而分別依據圖24於電壓為3V(VG)時的基線電流與反應後電流及下式(III)所計算出的相對電流變化(%)，如表7所示。
由表7可知，實施例3與實施例4的相對電流變化差異不大，說明兩者於生物感測器上的抗體數量相近。此外，根據圖24可以發現，實施例1~4反應後電流皆低於未與蛋白質反應時的基線電流，說明脂蛋白元A II蛋白質為負電性，於連接上生物感測器上的抗體後，會將基底的載子(carrier)吸引至半導體通道，因此減少源極與汲極間的導電度，進而使電流下降。
<干擾物質(interfering species)對生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)的影響分析>
需先說明的是，後面所提及的免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、葡萄糖、抗壞血酸(ascorbic acid,AA)及尿酸(uric acid,UA)皆為人類血漿中常見物質，而所使用的原始濃度則是此些物質典型會出現於人類血漿中的濃度。
(a)未加入脂蛋白元A II蛋白質時，干擾物質對生物感測器的影響：
先根據前述量測電流的方法(不同Ab-MGLA反應濃度對生物感測器的影響分析)量測實施例3之生物感測器的基線電流(I0)，再分別將正常濃度為1000ng/dL的免疫球蛋白G PBS溶液、正常濃度為192.5mg/dL的免疫球蛋白M PBS溶液、正常濃度為5mM的葡萄糖PBS溶液、正常濃度為4.3μg/mL的抗壞血酸PBS溶液及正常濃度為0.295 mM的尿酸PBS溶液注入生物感測器的微流通道內，量測反應後電流後，先用PBS清洗並重新注入0.5mM PBS，再量測經清洗步驟之反應後電流；此外，同前述方法，先將該等溶液濃度放大兩倍後注入微流通道內，分別量測清洗步驟前後的反應後電流，最終經下式(IV)計算△I/I0(%)後，所得結果如圖25(n=3)所示。
由圖25可知，不論干擾物質濃度為正常濃度或為兩倍濃度，皆會改變生物感測器的電流，但如果經PBS清洗過並重新注入PBS後，電流變化即會縮小，說明在量測前，若有先進行清洗步驟，可移除大部分會影響量測結果的干擾物質。
(b)於脂蛋白元A II蛋白質存在下，干擾物質對生物感測器的影響：
同前述(a)的方法，分別於各干擾物質再混合1ng脂蛋白元A II蛋白質進行電流量測(正常濃度與兩倍濃度)，並另外量測濃度為1ng/mL之脂蛋白元A II蛋白質PBS溶液的電流，再藉由所得數據計算△I/I0(μA)，結果如圖26所示，其中，I0是指基線電流(μA)，△I則為反應後電流(μA)扣除基線電流(μA)的差值。
由圖26可知，無干擾物質存在的純蛋白質與有干擾物質存在的結果相較，兩者結果產生差異，說明蛋白質和干擾物質間會有交互作用，而影響蛋白質連接至生物 感測器上的抗體。
<脂蛋白元A II蛋白質濃度對生物感測器的影響分析>
(a)脂蛋白元A II蛋白質濃度對Ab-MGLA/poly-SiNW-FET的影響：
同前述量測電流的方法(不同Ab-MGLA反應濃度對生物感測器的影響分析)，先量測實施例3的生物感測器於0.5mM PBS中的基線電流(蛋白質濃度為0)，另外，分別將5μL濃度為19.5pg/mL~1.95μg/mL的脂蛋白元A II蛋白質PBS溶液，於非光照環境及27℃下注入實施例3之生物感測器的微流通道內(即半導體通道上)反應10分鐘，再利用0.5mM PBS清洗微流通道3次除去未反應的蛋白質，最終再注入0.5mM PBS至微流通道後，使用50-mV偏壓(VB)及以0.5V/s的掃描速度量測於不同電壓VG(0~3V)時的電流(反應後電流)，所得結果如圖27所示。
由圖27結果可以發現，隨著蛋白質濃度上升，於電壓為3V時的反應後電流也隨著下降，再次說明蛋白元A II蛋白質為負電性，且已皆於生物感測器上。
(b)脂蛋白元A II蛋白質濃度分別對Ab-MGLA/poly-SiNW-FET與Ab-MGSA/poly-SiNW-FET的影響比較：
同前述(a)的方法步驟，分別量測比較例1的生物感測器(Ab-MGSA/poly-SiNW-FET)在注入濃度為19.5pg/mL~1.95μg/mL的脂蛋白元A II蛋白質PBS溶液後的電 流(反應後電流)，並將前述(a)所得實施例3的生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)於電壓為3V(VG)時的反應後電流(圖27)，及前述比較例1的生物感測器(Ab-MGSA/poly-SiNW-FET)於電壓為3V(VG)時的反應後電流，依據前述式(III)的公式分別計算得到△I/I0(%)後，再與脂蛋白元A II蛋白質的濃度作圖，所得電流校正曲線如圖28(n=5)所示。此外，計算實施例3與比較例1於圖28中的電流校正曲線斜率，再根據下式(V)計算出偵測極限(limit of detection,LOD)，所得結果如表8所示。
[式V]LOD=3σS-1 σ為生物感測器於純緩衝溶液(PBS)時的標準偏差；S為生物感測器於低濃度蛋白質時的電流校正曲線斜率(靈敏度)。
從圖28可以發現，比較例1於蛋白質濃度為19.5pg/mL~1.95μg/mL時的電流校正曲線斜率低於實施例3，說明實施例3的生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)，相較於比較例1(Ab-MGSA/poly-SiNW-FET)，具有更高的靈敏度，且由表8可知，實施例3的偵測極限值明顯低於比較例1，其是由 於本發明生物感測器具有碳數較高的連接基團[-(C=O)-CH=CH-(C=O)-]，所以在與蛋白質鍵結過程中，抗體會具有更多生物活性位置(bioactive sites)及較低的立體障礙，因而使本發明相較於比較例1(生物感測器的連接基團碳數為1)會具有更高的靈敏度與更低的偵測極限(即能提高抗體生物活性)。
特別值得一提的是，前述實驗皆是以0.5V/s的掃描速度量測0~3V時的電流，因此計算所得反應時間(response time)為6s，說明本發明生物感測器具有短反應時間的特性。
<生物感測器的穩定性測試分析>
實施例1~4的生物感測器於4℃的乾燥環境下皆能存放一周，且實施例3與比較例1的生物感測器在存放一周後，分別與濃度為1ng/mL的脂蛋白元A II蛋白質PBS溶液反應，所測得電流減少比例分別為20.2%(實施例3)與19.5%(比較例1)，說明本發明的生物感測器能穩定存放。
<分別利用Bio-Plex與生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)量測疝氣病人與膀胱癌病人尿液中脂蛋白元A II蛋白質濃度的結果分析>
取20個尿液樣品[10個疝氣病人(控制組)；10個膀胱癌病人]分別利用Bio-Plex與實施例3的生物感測器量測尿液樣品中的脂蛋白元A II蛋白質濃度(ng/mL)，所得結果如圖29(n=3)所示。需說明的是，本實驗中的尿液樣 品收集方法與前述所提及的方法(臨床尿液樣品的收集)相同，此外，實施例3的生物感測器量測方法為利用5μL尿液樣品及使用50-mV偏壓(VB)進行量測，並利用於3V(VG)時所得的反應後電流及圖28的電流校正曲線來定量蛋白質濃度。
由圖29可知，於疝氣病人尿液中的脂蛋白元A II蛋白質濃度為0.425~9.47ng/mL，明顯低於晚期(late-或advanced-stage)膀胱癌病人尿液中的蛋白質濃度(29~344ng/mL)，說明可以藉由本發明的生物感測器(Ab-MGLA/poly-SiNW-FET)來量測脂蛋白元A II蛋白質濃度，可成功分辨疝氣及膀胱癌病人。此外，由本發明生物感測器所得到結果，與步驟複雜且需耗費大量時間的Bio-Plex所得結果相符，說明本發明的生物感測器相較於Bio-Plex，具有省時且少複雜度的優點，又，本發明的生物感測器為非侵害性，因此相較於膀胱鏡檢查，亦可減少病人疼痛與不舒服感覺。
綜上所述，由於本發明生物感測器的連接基團[-(C=O)-CH=CH-(C=O)-]含有較高碳數，因而能提高連接於感測器上之抗體的數量及生物活性，故確實能達成本發明之目的。
惟以上所述者，僅為本發明之實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，凡是依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

Claims (10)

  1. 一種生物感測器，包含：一奈米線場效電晶體，包括一半導體通道；一固定層，位於該半導體通道上；及至少一連接在該固定層上的偵測單元，包括：一複合物，包括一表面含有多數個-(C=O)-X-COOH之經改質石墨烯，以及多數個承載於該經改質石墨烯上的磁性奈米粒子，及至少一抗體，透過-(C=O)-X-(C=O)-而與該複合物連接，其中該X表示C2~C3伸烯基或C1~C3伸烷基。
  2. 如請求項1所述的生物感測器，其中，該X表示C2~C3伸烯基。
  3. 如請求項2所述的生物感測器，其中，該X表示伸乙烯基。
  4. 如請求項1所述的生物感測器，其中，該奈米線場效電晶體為多晶矽奈米線場效電晶體。
  5. 如請求項1所述的生物感測器，其中，該抗體為抗-脂蛋白元A II抗體。
  6. 如請求項所述1的生物感測器，其中，該等磁性奈米粒子分別是選自於氧化鐵磁性奈米粒子、鎳磁性奈米粒子或前述的組合。
  7. 如請求項所述1的生物感測器，其中，該複合物的尺寸範圍為30~50nm。
  8. 如請求項1所述的生物感測器，其中，該固定層是先使胺基矽烷類化合物於該半導體通道表面上形成自組裝單層膜後，再使二醛化合物與該自組裝單層膜接觸而製得。
  9. 如請求項1所述的生物感測器，其中，該經改質石墨烯是先使二酸酐與催化劑反應後，再與石墨進行反應而製得，其中，該催化劑與該二酸酐的莫耳數比值範圍為1~6。
  10. 一種檢測樣品中待測物濃度的方法，包含：一施加電壓步驟，於如請求項1至9中任一項所述的生物感測器施加一固定電壓；一結合步驟，在該固定電壓下使該生物感測器與該待測物接觸；及一量測步驟，分別量測該生物感測器於該待測物與其接觸前後的電流變化，並依據以不同待測物濃度所得之電流校正曲線及該電流變化計算出該樣品中的待測物濃度。
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