CN108132287B - 一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法及应用。具体是以负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料为基底放大平台构建的电化学免疫传感器。所构建的免疫传感器实现了对前列腺特异性抗原的定量检测，并且选择性、稳定性、重现性良好，为前列腺癌的早期诊断提供了一种可靠的检测手段。

Description

一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备 方法及应用
技术领域
本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法及应用，具体涉及一种基于负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料的电化学免疫传感器的构建方法，以及由该方法构建的电化学免疫传感器在检测前列腺特异性抗原中的应用。
背景技术
前列腺癌是由于前列腺腺泡细胞异常无序生长所导致的。其死亡率居各种癌症的第二位，是全球最严重的健康问题之一，近年来其在我国的发病率呈上升趋势。然而通过前列腺癌筛查，可以降低前列腺癌相关并发症的发生率和前列腺癌相关死亡率，有效地提高生存率。因此，能够在早期准确的检测前列腺癌具有重要意义。前列腺特异性抗原是一种重要的前列腺肿瘤标志物，它在血清中的浓度能够反映是否患有前列腺癌，准确检测血清中前列腺特异性抗原的浓度为早期诊断提供了重要依据。因此，发展高灵敏的前列腺特异性抗原的定量检测方法对前列腺癌的早期诊断尤为重要。
电化学免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合的一种分析方法，具有检测迅速、检出限低、灵敏度高、操作简单和制备成本低的优点。近年来，电化学免疫传感器备受关注，被广泛应用于肿瘤标志物的检测中。本发明利用自组装技术，以负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料为基底放大平台，制备了一种检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器。空心核壳状银铂@铂纳米粒子具有空心的形貌和核壳状的结构，使其不仅具有双金属的协同效应，还具有高的原子利用率。空心核壳状银铂@铂纳米粒子对H2O2的还原表现出了优异的催化性，能够实现对响应电流的放大。聚吡咯纳米片具有卓越的导电能力，能够加速电极表面电子转移，提高免疫传感器的灵敏度。基于以上优点，所构建的免疫传感器实现了对前列腺特异性抗原的定量检测，具有检测范围广、检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，为前列腺癌的早期诊断提供了一种可靠的检测手段。
发明内容
本发明提供了一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极的为玻碳电极，其表面利用依次修饰负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料、前列腺特异性抗体、牛血清蛋白、前列腺特异性抗原。所述对电极为铂丝电极，所述参比电极为饱和甘汞电极。
本发明的目的之一是提供一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器用于前列腺特异性抗原的定量检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤：
（1）制备空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液；
（2）制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料；
（3）制备基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极；
（4）制作检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线。
其中步骤（1）制备空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液包括：
①制备空心银铂合金纳米粒子分散液
取4 ~ 6 mg的硝酸银和14 ~ 18 mg的柠檬酸钠，溶解到20 mL的超纯水中，室温下磁力搅拌30 min后，滴加0.4 ~ 0.6 mL新配的10 mmol/L的硼氢化钠，磁力搅拌8 h后，加入8 ~ 10 mg的抗坏血酸，待完全溶解后加入0.6 ~ 0.8 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，室温下搅拌3 h后，得空心银铂合金纳米粒子分散液；
②制备空心核壳状银铂@铂分纳米粒子散液
取10 mL空心银铂合金纳米粒子分散液，加入5 ~ 7 mg的抗坏血酸，室温下磁力搅拌30 min后，加入0.4 ~ 0.6 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，搅拌3 h后，制得空心核壳状银铂@铂分纳米粒子分散液。
其中步骤（2）制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料包括：
①制备聚吡咯纳米片
取40 µL吡咯加入到10 mL、0.8 ~ 1.2 mol/L的盐酸里，超声50 min后得吡咯和盐酸的混合液，在冰水浴磁力搅拌条件下加入0.8 ~ 1.0 mL、0.5 mol/L的三氯化铁溶液，维持冰水浴磁力搅拌6 ~ 8 h后，用超纯水洗涤至pH呈中性，离心分离，室温干燥12 h后，得到聚吡咯纳米片；
②制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液
取4 mg的聚吡咯纳米片，分散在6 ~ 8 mL的空心核壳状银铂@铂分纳米粒子分散液中，在室温下振荡孵化12 h，超纯水洗涤三次，离心分离，室温下干燥10 h后，得负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料。
其中步骤（3）制备基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极包括：
①将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②取6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
③继续将6.0 µL、8.0 ~ 12.0 µg/mL的前列腺特异性抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、0.5 ~ 1.2 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、0.0001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极。
其中步骤（4）制作检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线包括：
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为5.3 ~ 8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10 mL、50 mmol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录不同浓度下前列腺特异性抗原所对应的电流值，绘制检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。
本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明以负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料为基底放大平台，空心核壳状银铂@铂纳米粒子具有空心的形貌，能够提高原子利用率，降低成本，此外，它还具有双金属的核壳结构，能够发挥双金属的协同催化效应；聚吡咯纳米片具有较高的导电性能够加速电子的转移，提高传感器的灵敏度，聚吡咯纳米片具有较强的吸附能力，可通过静电引力吸附空心核壳状银铂@铂纳米粒子，因此，负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料具有优异的催化性能、高的导电性，能够放大响应信号，提高传感器的灵敏度；
（2）本发明所构建的电流型免疫传感器实现了精确定量检测前列腺特异性抗原的目的，其线性检测范围是0.0001 ng/mL ~ 100 ng/mL，最低检测下限为34 fg/mL；
（3）本发明的方法构建的电化学免疫传感器，操作简单、检测迅速，可用于实际样品的快速检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1制备空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液
①制备空心银铂合金纳米粒子分散液
取4 mg的硝酸银和14 mg的柠檬酸钠，溶解到20 mL的超纯水中，室温下磁力搅拌30 min后，滴加0.4 mL新配的10 mmol/L的硼氢化钠，磁力搅拌8 h后，加入8 mg的抗坏血酸，待完全溶解后加入0.6 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，室温下搅拌3 h后，得空心银铂合金纳米粒子分散液；
②制备空心核壳状银铂@铂分纳米粒子散液
取10 mL空心银铂合金纳米粒子分散液，加入5 mg的抗坏血酸，室温下磁力搅拌30min后，加入0.4 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，搅拌3 h后，制得空心核壳状银铂@铂分纳米粒子分散液。
实施例2制备空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液
①制备空心银铂合金纳米粒子分散液
取5 mg的硝酸银和16 mg的柠檬酸钠，溶解到20 mL的超纯水中，室温下磁力搅拌30 min后，滴加0.5 mL新配的10 mmol/L的硼氢化钠，磁力搅拌8 h后，加入9 mg的抗坏血酸，待完全溶解后加入0.7 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，室温下搅拌3 h后，得空心银铂合金纳米粒子分散液；
②制备空心核壳状银铂@铂分纳米粒子散液
取10 mL空心银铂合金纳米粒子分散液，加入6 mg的抗坏血酸，室温下磁力搅拌30min后，加入0.5 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，搅拌3 h后，制得空心核壳状银铂@铂分纳米粒子分散液。
实施例3制备空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液
①制备空心银铂合金纳米粒子分散液
取6 mg的硝酸银和18 mg的柠檬酸钠，溶解到20 mL的超纯水中，室温下磁力搅拌30 min后，滴加0.6 mL新配的10 mmol/L的硼氢化钠，磁力搅拌8 h后，加入10 mg的抗坏血酸，待完全溶解后加入0.8 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，室温下搅拌3 h后，得空心银铂合金纳米粒子分散液；
②制备空心核壳状银铂@铂分纳米粒子散液
取10 mL空心银铂合金纳米粒子分散液，加入7 mg的抗坏血酸，室温下磁力搅拌30min后，加入0.6 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，搅拌3 h后，制得空心核壳状银铂@铂分纳米粒子分散液。
实施例4制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料包括：
①制备聚吡咯纳米片
取40 µL吡咯加入到10 mL、0.8 mol/L的盐酸里，超声50 min后得吡咯和盐酸的混合液，在冰水浴磁力搅拌条件下加入0.8 mL、0.5 mol/L的三氯化铁溶液，维持冰水浴磁力搅拌6 h后，用超纯水洗涤至pH呈中性，离心分离，室温干燥12 h后，得到聚吡咯纳米片；
②制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液
取4 mg的聚吡咯纳米片，分散在6 mL的空心核壳状银铂@铂分纳米粒子分散液中，在室温下振荡孵化12 h，超纯水洗涤三次，离心分离，室温下干燥10 h后，得负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料。
实施例5制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料包括：
①制备聚吡咯纳米片
取40 µL吡咯加入到10 mL、1.0 mol/L的盐酸里，超声50 min后得吡咯和盐酸的混合液，在冰水浴磁力搅拌条件下加入0.9 mL、0.5 mol/L的三氯化铁溶液，维持冰水浴磁力搅拌7 h后，用超纯水洗涤至pH呈中性，离心分离，室温干燥12 h后，得到聚吡咯纳米片；
②制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液
取4 mg的聚吡咯纳米片，分散在7 mL的空心核壳状银铂@铂分纳米粒子分散液中，在室温下振荡孵化12 h，超纯水洗涤三次，离心分离，室温下干燥10 h后，得负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料。
实施例6制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料包括：
①制备聚吡咯纳米片
取40 µL吡咯加入到10 mL、1.2 mol/L的盐酸里，超声50 min后得吡咯和盐酸的混合液，在冰水浴磁力搅拌条件下加入1.0 mL、0.5 mol/L的三氯化铁溶液，维持冰水浴磁力搅拌8 h后，用超纯水洗涤至pH呈中性，离心分离，室温干燥12 h后，得到聚吡咯纳米片；
②制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液
取4 mg的聚吡咯纳米片，分散在8 mL的空心核壳状银铂@铂分纳米粒子分散液中，在室温下振荡孵化12 h，超纯水洗涤三次，离心分离，室温下干燥10 h后，得负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料。
实施例7制备基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极
①将直径为3.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②取6.0 µL、1.0 mg/mL的负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
③继续将6.0 µL、8.0 µg/mL的前列腺特异性抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、0.5 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、0.0001 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例8制备基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极
①将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②取6.0 µL、2.0 mg/mL的负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
③继续将6.0 µL、10.0 µg/mL的前列腺特异性抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、0.9 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、1.0 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例9制备基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极
①将直径为5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②取6.0 µL、3.0 mg/mL的负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
③继续将6.0 µL、12.0 µg/mL的前列腺特异性抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、1.2 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、100 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例10制作检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为5.3的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10 mL、50 mmol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录不同浓度下前列腺特异性抗原所对应的电流值，绘制检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。
实施例11制作检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10 mL、50 mmol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录不同浓度下前列腺特异性抗原所对应的电流值，绘制检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。
实施例12制作检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10 mL、50 mmol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录不同浓度下前列腺特异性抗原所对应的电流值，绘制检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。

Claims (4)

1.一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法，所述方法包括：
（1）制备空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液；
（2）制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料；
（3）制备一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极；
所述步骤（1）制备空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液包括：
①制备空心银铂合金纳米粒子分散液
取4 ~ 6 mg的硝酸银和14 ~ 18 mg的柠檬酸钠，溶解到20 mL的超纯水中，室温下磁力搅拌30 min后，滴加0.4 ~ 0.6 mL新配的10 mmol/L的硼氢化钠，磁力搅拌8 h后，加入8 ~10 mg的抗坏血酸，待完全溶解后加入0.6 ~ 0.8 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，室温下搅拌3 h后，得空心银铂合金纳米粒子分散液；
②制备空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液
取10 mL空心银铂合金纳米粒子分散液，加入5 ~ 7 mg的抗坏血酸，室温下磁力搅拌30min后，加入0.4 ~ 0.6 mL、1 wt%的氯铂酸溶液，搅拌3 h后，制得空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液。
2.如权利要求1所述一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料包括：
①制备聚吡咯纳米片
取40 μL吡咯加入到10 mL、0.8 ~ 1.2 mol/L的盐酸里，超声50 min后得吡咯和盐酸的混合液，在冰水浴磁力搅拌条件下加入0.8 ~ 1.0 mL、0.5 mol/L的三氯化铁溶液，维持冰水浴磁力搅拌6 ~ 8 h后，用超纯水洗涤至pH呈中性，离心分离，室温干燥12 h后，得到聚吡咯纳米片；
②制备负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液
取4 mg的聚吡咯纳米片，分散在6 ~ 8 mL的空心核壳状银铂@铂纳米粒子分散液中，在室温下振荡孵化12 h，超纯水洗涤三次，离心分离，室温下干燥10 h后，得负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料。
3.如权利要求1所述一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）制备基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极包括：
①将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②取6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的负载空心核壳状银铂@铂的聚吡咯纳米片复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
③继续将6.0 µL、8.0 ~ 12.0 µg/mL的前列腺特异性抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
④继续将3.0 µL、0.5 ~ 1.2 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、0.0001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极。
4.如权利要求1所述一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）制备基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的工作电极，用于前列腺特异性抗原的检测，检测步骤如下：
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为5.3 ~ 8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10 mL、50 mmol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录不同浓度下前列腺特异性抗原所对应的电流值，绘制检测前列腺特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。
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