CN112305053A - 一种硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器及其电化学免疫分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及电化学免疫分析技术领域内一种硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器及其电化学免疫分析方法,首先合成中空红毛丹状硫化铟纳米结构微球,利用链霉亲和素将其生物功能化并修饰于玻碳电极表面,通过链酶亲和素对生物素的特异亲和作用,将生物素化的抗体固定于功能化界面上,用牛血清蛋白封闭得到标记电化学免疫传感器。硫化铟具有大的比表面积和优良的生物相容性,且链霉亲和素对生物素化的抗体具有高的选择性,因此,捕获抗体能够有效的固定于硫化铟的表面。用该纳米微球所制得的电化学免疫传感器,在硫堇溶液体系中,可快速简便地实现对血清或体液中的肿瘤标志物的高灵敏度标记检测。
Description
技术领域
本发明涉及电化学免疫分析技术领域,具体是一种硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器及其电化学免疫分析方法。
背景技术
1990年,Henry等提出了免疫传感器的概念,它是将高灵敏的传感技术与特异性免疫测定技术结合起来,用于检测抗原-抗体反应的新型生物传感器。肿瘤标志物是指由肿瘤细胞产生,与肿瘤组织性质相关的物质,这些物质存在于肿瘤组织和肿瘤细胞的胞核、胞质和胞膜上或分泌在体液中。肿瘤标志物的存在或含量变化可以提示肿瘤的存在及其阶段。电化学免疫传感器将电化学分析技术和免疫测试技术相结合,因制作简单、损耗小及灵活便携等优点而备受关注是目前研究最多的较为成熟的一类免疫传感器,广泛应用于肿瘤标志物的检测,同时,在肿瘤标志物的早期检测筛查中,因肿瘤标志物的含量较低,对免疫传感器的相应灵敏度要求较高,一般早期较难筛查出病变信息。
半导体纳米材料具有独特的性能因而在电化学传感上受到了关注。特别是金属氧化物纳米粒子(如二氧化钛、氧化锌等)已被成功用于固定酶或蛋白质,从而构建电化学生物传感器。然而,金属硫化物纳米材料却很少被报道用来在电化学生物传感上固定蛋白质。
金属硫化物为半导体材料大家族成员中非常重要的一员,在In-S体系中硫化铟(In2S3)是其中主要的硫化物,硫化铟(In2S3)是一种非常重要的III-VI族硫化物半导体材料,由于它在光导材料、发光材料和光催化等领域,具有潜在的广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种响应电流小,选择性好、检测灵敏度高的硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器,以便用于肿瘤病变的早期检测诊断中。
本发明的目的是这样实现的,一种硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器,其特征在于,
第一步,首先合成中空红毛丹状的硫化铟(In2S3)纳米微球;
第二步,利用链霉亲和素将硫化铟纳米微球生物功能化并修饰于玻碳电极表面,通过链酶亲和素对生物素的特异亲和作用,将生物素化的抗体固定于功能化界面上;再用牛血清蛋白封闭得到标记电化学免疫传感器。
本发明中,合成的中空红毛丹状的硫化铟(In2S3)纳米微球具有大的比表面积和优良的生物相容性,且链霉亲和素对生物素化的抗体具有高的选择性和高的固定量,实现电化学免疫检测中高灵敏度的检测和快速相应,便于肿瘤标志物的早期筛查诊断。
为便于快速简单的合成中空红毛丹状的硫化铟纳米微球,第一步中,中空红毛丹状的硫化铟纳米微球的合成方法为:将偏苯三甲酸、硫脲、硝酸铟、9.5 mL二次蒸馏水、0.0365 gCTAB混合搅拌均匀后,转入聚四氟乙内衬的反应釜中,于110~130℃反应10~12h,于反应釜内自然冷却至室温,分离反应液中的沉淀物,分别用蒸馏水和无水乙醇各洗涤2~3次,最后于60~80℃条件下真空干燥10-16 h,得淡黄色的中空红毛丹状的硫化铟纳米微球。本发明的中空红毛丹状的硫化铟纳米微球合成方法简单,合成条件温和,合成效率高。
进一步地,偏苯三甲酸、硫脲、硝酸铟和CTAB的摩尔比为1:50:1:1。
第二步分以下分步聚完成:
2.1将中空红毛丹状的硫化铟纳米微球超声分散于二次去离子水中,得到硫化铟纳米微球的悬浮液,再将硫化铟纳米微球的悬浮液与壳聚糖溶液等体积得到分散均匀的混合液;再将混合液与链霉亲和素溶液等体积混合均匀得到生物功能化的硫化铟混合液;
2.2将玻碳电极先用氧化铝粉抛光,用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后,然后依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗玻碳电极,最后在氮气保护下吹干得到清洁的玻碳电极;
2.3取步骤2.1中制得的生物功能化的硫化铟混合液涂覆于步骤2.2中所得的清洁的玻碳电极表面,并置于4℃条件下低温至晾干;
2.4在步骤2.3晾干后的的玻碳电极表面滴涂生物素化的抗体,室温下反应40~60min,用去离子水冲洗干净;
2.5用牛血清蛋白溶液封闭步骤2.4得到的玻碳电极表面,然后用去离子水冲洗干净,得到硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器。
本发明的标记电化学免疫传感器,将中空红毛丹状的硫化铟纳米微球用链霉亲和素将其进行功能化,再与生物素化抗体结合,构建一个新颖的CEA电化学免疫传感器,生物素-链霉亲和素系统由于具有高特异性且一分子链霉亲和素可以结合四分子生物素,在链霉亲和素功能化的中空红毛丹状硫化铟纳米结构微球界面上可以固定大量的生物素化抗体,从而构建更高效的传感平台,所形成的免疫复合物可以显著的抑制界面上的电子传递作用,从而提高传感器的灵敏度;并且该免疫传感器表现出优良的选择性、能够用于癌细胞的早期诊断中。
进一步地,2.1步中,硫化铟纳米微球的悬浮液的分散浓度为1~2.0 mg/mL;壳聚糖溶液的质量浓度为1.0~1.5%,链霉亲和素的浓度为150~200 μg/mL。
步骤2.4中,生物素化的抗体浓度为2 μg/mL;步骤2.5中牛血清蛋白溶液质量浓度为1.0%。
本发明还提供一种采用上述中空红毛丹状的硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器的电化学免疫分析方法,其特征在于,包括如下步骤:
A.取若干个所述基于硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器分别在不同已知浓度的抗原温育液中温育30-60 min;然后用去离子水冲洗干净;
B.分别以A步中温育后的标记电化学免疫传感器为工作电极,饱和甘汞电极作为辅助电极,铂片电极作为对电极,在硫堇测试液中,用差示脉冲伏安法检测电化学信号,分别输出各不同已知浓度的抗原电流信号曲线;
C. 以各已知抗原的浓度值为纵作标,以步骤B中输出的各已经浓度对应的电流信号曲线的峰值为横作标,描点拟合抗原免疫检测标准曲线;
D.按步骤A和步骤B的过程,进行未知抗原浓度的电化学免疫分析,输出电流信号曲线,以本步中的电流信号曲线的电源峰值为纵作标,描点步骤C中的抗原免疫检测标准曲线,确定未知抗原的浓度。
进一步地,步骤A中,温育液包括体积比为2:1:22的待检测抗原溶液,与待检测的抗原对应的HRP标记的抗体溶液以及0.1mol/L的PBS溶液混合而成,待检测的抗原对应的HRP标记的抗体溶液的浓度为2 μg/mL。
再进一步地,步骤B中,所述硫堇测试液的pH为7.0,包括硫堇、H2O2和PBS溶液,其中硫堇的浓度为0.5 mmol/L和过氧化氢的浓度为5.0 mmol/L, PBS溶液的浓度为0.1mol/L。
附图说明
图1为本发明的硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器制作和免疫分析的流程示意图。
图2为实施例1中合成的中空红毛丹状硫化铟纳米微球的SEM图。
图3为实施例1中合成的中空红毛丹状硫化铟纳米微球的TEM图。
图4为实施例2中已经浓度的CEA标准样品标记电化学免疫检测的曲线。
图5为根据图4中各曲线的最大值与对应的CEA标准样品的浓度拟合的浓度与检测电流关系的直线。
具体实施方式
以下实施例以CEA抗源的免疫检测为例详细说明本发明的硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器及其电化学免疫分析方法。
实施例1
本实施例首先制备基于中空红毛丹状硫化铟纳米结构微球的CEA标记电化学免疫传感器,该CEA标记免疫传感器的制备方法包括以下步骤:
首先制备中空红毛丹状硫化铟纳米结构微球
在50 mL烧杯中,分别加入0.0210 g偏苯三甲酸、0.3806 g硫脲、0.5 mL、硝酸铟、9.5mL二次蒸馏水、0.0365 gCTAB,置于磁力搅拌器上快速搅拌,待混合均匀的澄清溶液,将溶液转入聚四氟乙烯材质的反应釜内衬中,再将内衬放入钢制材料的反应釜内并拧紧反应釜上盖,然后将反应釜置于恒温鼓风干燥箱中设置温度为120 ℃,反应时间为12 h。待反应结束后,使高压反应釜自然冷却至室温,约经24 h自然沉降后分离沉淀物并先后用蒸馏水和无水乙醇各洗涤3次,最后于60℃条件下真空干燥12 h,得淡黄色粉末即为中空红毛丹状硫化铟纳米结构微球;该微球的电镜扫描图如图2,可以看出纳米片堆积而成的开口状中空球形结构,单分散性好,形貌和尺寸较为均一,统计可得粒径约为1μm,壁厚约为100 nm,从图中还可以看出空心球表面是由纳米级的片状硫化铟晶体堆砌而成;微球的电镜透射图如图3,可见纳米级球状硫化铟具有中空结构,且球体表面的片状硫化铟晶体也清晰可见。
接着按如图1所示的过程制备CEA标记免疫传感器:
(1)将上述制得的中空红毛丹状的硫化铟纳米微球按2.0 mg/mL的浓度超声分散于二次去离子水中,得到硫化铟纳米微球的悬浮液,再将硫化铟纳米微球的悬浮液与壳聚糖溶液等体积得到分散均匀的混合液;再将混合液与链霉亲和素溶液等体积混合均匀得到生物功能化的硫化铟混合液;
(2)将浓度为2.0 mg/mL的中空红毛丹状硫化铟纳米结构微球悬浮液与质量浓度为1.0wt%壳聚糖水溶液等体积混合后超声分散为均匀的分散液;再取上述分散液和用PBS溶液稀释的浓度为 200 μg/mL链霉亲和素的溶液等体积混合为均匀的混合液;
(3) 将玻碳电极先用粒径为0.3 μm~0.5 μm的氧化铝粉抛光,再用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后,然后依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗玻碳电极两次,最后在氮气保护下吹干得到清洁的玻碳电极;
(4)取玻碳电极若干,管按每个电极用量:取5 μL(2)步中链霉亲和素功能化的混合溶液均匀滴涂于清洁处理后的玻碳电极表面,然后放置在4℃下干燥;
(5)按每个电极取10 μL浓度为 2μg/mL生物素化的CEA抗体溶液均匀滴涂于(4)步干燥后的电极的表面,室温下温育40 min,用PBS缓冲溶液冲洗干净;
(6)取10 μL质量浓度为 1.0wt%牛血清蛋白水溶液均匀滴涂(5)步冲洗后电极的表面,在室温下封闭40 min,用PBS缓冲溶液冲洗,制得本实施例的CEA标记电化学免疫传感器。
实施例2
采用实施例1中的中空红毛丹状硫化铟纳米结构微球的CEA标记电化学免疫传感器进行免疫分析方法包括:
(1)将上述制得的CEA标记免疫传感器在分别置于含不同已知浓度的CEA抗原标准样品的的温育液中温育,其中的温育液由2:1:22的CEA抗原溶液,HRP标记的CEA抗体溶液以及PBS组成,其中HRP标记的CEA抗体溶液的浓度为2 μg/mL,温育时间为40 min,然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗;其中,温育液中CEA抗原溶液的浓度分别为0.01 ng/mL 0.1 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL,10 ng/mL, 13 ng/mL, 21 ng/mL, 23ng/mL;
(2)以分别以实施例制得的CEA标记免疫传感器为工作电极,饱和甘汞电极作为辅助电极,铂片电极作为对电极,在含有0.5 mM硫堇和5.0 mM 过氧化氢(其余为0.1mol/L的PBS溶液)的硫堇测试液中,用差示脉冲伏安法检测其电化学信号得到如图4所示的标准样品的电化学信号曲线a~h;各曲线的峰值分别为7.199,7.385,8.108,8.327,9.937,10.340,11.590,116.67。
(3)以各已知抗原的浓度值为纵作标,以步骤B中输出的各已经浓度对应的电流信号曲线的峰值为横作标,描点拟合抗原免疫检测标准曲线如图5所示。
为进一步评价采用上述标记电化学免疫传检测方法的应用的可靠性,本实施例进一步按上述第(1)步和第(2)步的过程分别取样1-5号的人血清实际样品中CEA浓度进行检测(1-5号样品由江苏省肿瘤医院提供),由商品化的电化学发光免疫分析仪测量,其中的温育液中的抗源溶液为同体积的血清样品。
表1
最终,根据输出的电化学信号曲线的电流峰值,根据图5的标准曲线,确定各血清样品中CEA浓度值分别如表1所列,同时,按现有技术中商品化的电化学发光免疫分析仪验证测量1-5号血清样品的CEA浓度值如表1所列。通过表1的数据比较,两者检测结果具有良好的一致性,并且通过本实施例的检测方法确定的检测浓度略高于现有技术中的检测方法的结果,进一步说明本实施例检测的精度与实际偏差更小,检测灵敏度高可靠。
本发明的硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器及其电化学免疫分析方法,在实际应用中并不局限于上述CEA抗源的检测,也可以用于人体血清或体液中其它肿瘤标志物的检测筛查,实际检测中只需更换相应的抗原和生物素化抗体。
Claims (9)
1.一种硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器,其特征在于,
第一步,首先合成中空红毛丹状的硫化铟(In2S3)纳米微球;
第二步,利用链霉亲和素将硫化铟纳米微球生物功能化并修饰于玻碳电极表面,通过链酶亲和素对生物素的特异亲和作用,将生物素化的抗体固定于功能化界面上;再用牛血清蛋白封闭得到标记电化学免疫传感器。
2.根据权利要求1所于硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器,其特征在于,第一步中,中空红毛丹状的硫化铟纳米微球的合成方法为:偏苯三甲酸、硫脲、硝酸铟、9.5 mL二次蒸馏水、0.0365 gCTAB混合搅拌均匀后,转入聚四氟乙内衬的反应釜中,于110~130℃反应10~12 h,于反应釜内自然冷却至室温,分离反应液中的沉淀物,分别用蒸馏水和无水乙醇各洗涤2~3次,最后于60~80℃条件下真空干燥10-16 h,得淡黄色的中空红毛丹状的硫化铟纳米微球。
3.根据权利要求2所于硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器,其特征在于,偏苯三甲酸、硫脲、硝酸铟和CTAB的摩尔比为1:50:1:1。
4.根据权利要求1所于硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器,其特征在于,第二步分以下分步聚完成:
2.1将中空红毛丹状的硫化铟纳米微球超声分散于二次去离子水中,得到硫化铟纳米微球的悬浮液,再将硫化铟纳米微球的悬浮液与壳聚糖溶液等体积混合得到分散均匀的混合液;再将混合液与链霉亲和素溶液等体积混合得到生物功能化的硫化铟混合液;
2.2将玻碳电极先用氧化铝粉抛光,用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后,然后依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗玻碳电极,最后在氮气保护下吹干得到清洁的玻碳电极;
2.3取步骤2.1中制得的生物功能化的硫化铟混合液涂覆于步骤2.2中所得的清洁的玻碳电极表面,并置于4℃条件下低温至晾干;
2.4在步骤2.3晾干后的的玻碳电极表面滴涂生物素化的抗体,室温下反应40~60min,用去离子水冲洗干净;
2.5用牛血清蛋白溶液封闭步骤2.4得到的玻碳电极表面,然后用去离子水冲洗干净,得到硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器。
5.根据权利要求4所述基于硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器,其特征在于,
2.1步中,硫化铟纳米微球的悬浮液的分散浓度为1~2.0 mg/mL;壳聚糖溶液的质量浓度为1.0~1.5%,链霉亲和素的浓度为150~200 μg/mL。
6. 根据权利要求4所述硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器,其特征在于,步骤2.4中,生物素化的抗体浓度为2 μg/mL;步骤2.5中牛血清蛋白溶液质量浓度为1.0%。
7.一种采用权利要求1~6任一项的标记电化学免疫传感器的电化学免疫分析方法,其特征在于,包括如下步骤:
A.取若干个所述基于硫化铟纳米微球修饰的标记电化学免疫传感器分别在不同已知浓度的抗原温育液中温育30~60 min;然后用去离子水冲洗干净;
B.分别以A步中温育后的标记电化学免疫传感器为工作电极,饱和甘汞电极作为辅助电极,铂片电极作为对电极,在硫堇测试液中,用差示脉冲伏安法检测电化学信号,分别输出各不同已知浓度的抗原电流信号曲线;
C. 以各已知抗原的浓度值为纵作标,以步骤B中输出的各已经浓度对应的电流信号曲线的峰值为横作标,描点拟合抗原免疫检测标准曲线;
D.按步骤A和步骤B的过程,进行未知抗原浓度的电化学免疫分析,输出电流信号曲线,以本步中的电流信号曲线的电源峰值为纵作标,描点步骤C中的抗原免疫检测标准曲线,确定未知抗原的浓度。
8. 根据权利要求7所述的电化学免疫分析方法,其特征在于,步骤A中,温育液包括体积比为2:1:22的待检测抗原溶液,与待检测的抗原对应的HRP标记的抗体溶液以及0.1mol/L 的PBS溶液混合而成,待检测的抗原对应的HRP标记的抗体溶液的浓度为1~2 μg/mL。
9. 根据权利要求7所述的电化学免疫分析方法,其特征在于,步骤B中,所述硫堇测试液的pH为7.0,包括硫堇、H2O2和PBS溶液,其中硫堇的浓度为0.5 mmol/L和过氧化氢的浓度为5.0 mmol/L, PBS溶液的浓度为0.1mol/L。
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