CN114965994A - 一种基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法及免疫分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法及免疫分析方法，首先合成纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶，然后再用其修饰玻碳电极界面固定抗体分子，制备得到无标记电化学免疫传感器。该铜铁双金属有机框架纳米酶具有大的比表面积，借助于链霉亲和素对生物素化的抗体较高的选择性，使抗体能够有效的固定于铜铁双金属有机框架的表面。该传感器，在邻苯二胺溶液体系中，可催化邻苯二胺氧化，产生强的电化学信号，使抗原‑抗体特异性反应形成的免疫复合物抑制了铜铁双金属有机框架纳米酶催化，而引起电化学信号强度降低。利用降低信号和抗原浓度线性关系，可快速实现对IgG的无标记高灵敏度的检测。

Description

一种基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传 感器的制备方法及免疫分析方法
技术领域
本发明涉及电化学免疫分析技术领域，具体涉及一种基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法及免疫分析方法。
背景技术
电化学免疫传感器结合了抗原-抗体识别技术，具有特异性高、灵敏度高、操作简单、操作成本低、检测时间短、易于小型化等优点，在食品安全、临床诊断和环境分析等领域有着广泛的应用。免疫球蛋白G（IgG）是一种重要的免疫球蛋白，可中和毒素和病毒，激活补体聚集，是临床诊断慢性感染、慢性肝病、淋巴瘤、系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤和各种免疫缺陷疾病，以及白血病的重要生物标志物。血液和其他体液中IgG的浓度与体液免疫的标准直接相关，IgG浓度的异常往往表明疾病的风险或易受感染的程度。作为电化学免疫传感器的一个重要分支，与三明治型免疫传感器相比，无标记免疫传感器由于操作简单、使用方便、快速且无需使用二级抗体，已成为直接检测疾病标志物的一种极具吸引力且有前景的方法。
模拟酶材料具有稳定的类过氧化物酶催化活性因而逐渐代替天然酶在电化学传感上的应用。特别是贵金属纳米粒子（如金、铂等）已被成功用于电极基底修饰材料或是在信号放大策略中用作信号探针，从而构建电化学生物传感器。然而，金属有机框架纳米材料却很少被报道用来在电化学生物传感上催化活性底物。
金属有机骨架（metal-organic frameworks，MOFs）是由金属节点和有机配体构成的一类多孔材料，具有大的表面积、均匀且可调节的孔隙、可调控和多样的形貌以及可改变的表面性质，具有潜在的应用而受到了广泛关注。
双金属MOF材料是近年来提出的一种新型材料，它不仅具有金属有机骨架材料的优点，而且具有单金属MOFs所不具备的优异性能。双金属MOF含有两种金属活性中心，这有助于提高骨架结构的稳定性并增强其催化性能。现在技术中尚未公开过CuFe-MOF在电化学免疫分析领域应用。本发明首次将其引入电化学免疫分析，并用链霉亲和素将其进行功能化，再与生物素化抗体结合，构建一个新颖的人IgG电化学免疫传感器。CuFe-MOF具有良好的生物相容性和大的比表面积，在经过链霉亲和素的功能化后，能够有效固定大量生物素化IgG抗体，从而提高免疫传感器的灵敏度。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法，以构建一种新型的IgG电化学无标记免疫传感器，利用CuFe-MOF具有良好的生物相容性和大的比表面积，在经过链霉亲和素的功能化后，能够有效固定大量生物素化IgG抗体，从而提高免疫传感器的灵敏度。
本发明的目的是这样实现的，一种基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，制备纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的微粒：将2-氨基对苯二甲酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，然后分别逐滴添加NaOH、 CuCl2.2H2O和FeCl3.6H2O，搅拌均匀得到混合液，将混合液转入聚四氟乙烯内衬的反应釜中，然后将反应釜置于恒温鼓风干燥箱中于90～110 ℃、反应为16～20 h；然后待高压反应釜自然冷却至室温，分离反应后的沉淀物并先后用蒸馏水和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤3次，最后于80～90℃条件下真空干燥10～12 h，得深褐色粉末即为纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的微粒，粒径为500-600 nm；
第二步，用第一步制备得到的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的微粒，修饰玻碳电极界面固定抗体分子，制备得到无标记电化学免疫传感器。
进一步地，第一步中，2-氨基对苯二甲酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺的浓度为：0.1～0.2mol/L， 2-氨基对苯二甲酸、CuCl2.2H2O和FeCl3.6H2O物质的量的比为：1：1：1，所述NaOH的浓度为4mol/L，加入量为沸合液体积的4～5%。
进一步地，第二步的具体包括以下步骤：
(1)将纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶超声分散于二次去离子水中，形成分散均匀的悬浮液，再将悬浮液与壳聚糖溶液等体积混合并超声分散均匀；再将上述混合溶液与链霉亲和素溶液等体积混合均匀，得到链霉素生物功能化的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶混合液；
(2)将玻碳电极先用氧化铝粉抛光，用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，然后依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗玻碳电极，最后在氮气下吹干；
(3)取步骤(1)中制得的链霉素生物功能化的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的混合溶液滴涂于步骤(2)中所得洁净的玻碳电极表面，并于低温冷藏的环境下晾干；
(4)将步骤(3)所修饰后的玻碳电极表面滴涂生物素化的抗体，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
(5)将牛血清蛋白溶液滴涂于步骤(4)中所得到的玻碳电极表面，在室温下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，得到该无标记电化学免疫传感器。
进一步地，步骤(1)中，纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的悬浮液的分散浓度为1～2.0 mg/mL，壳聚糖溶液的浓度为0.5～1.0wt％，链霉亲和素的浓度为200～300μg/mL；纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的悬浮液、壳聚糖溶液和链霉亲和素的混合体积比为1：1：1；步骤 (2)中，所述的氧化铝粉粒径为0.5 μm。
进一步地，步骤(3)中，所述冷藏低温为0～4℃；步骤(4)中，所述生物素化的抗体浓度为100～200 μg/mL。
进一步地，步骤(5)中，所述牛血清蛋白溶液浓度为1.0～2.0wt％。
本发明制备的基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器具有如下优点：
传感器使用的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶（CuFe-MOF）纳米酶材料，具有大的比表面积和丰富的氨基基团，能有效的吸附链霉亲和素，增加生物素化抗体的固定量，另一方面，生物素-链霉亲和素系统由于具有高特异性且一分子链霉亲和素可以结合四分子生物素，在链霉亲和素功能化的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶界面上可以固定大量的生物素化抗体，从而构建更高效的传感平台，进一步提高传感器的灵敏度； 另外，凭借优异的催化特性，MOFs被公认为新型的纳米酶，并已被用作信号探针应用于标记型电化学免疫传感器。然而，标记型电化学免疫传感器分析过程复杂繁琐。本发明的方法合成的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶具有大的比表面积，良好的生物相容性，表现出优异的类过氧化物酶的催化活性，可用于直接催化反应底物，用于构建无标记电化学免疫传感器，既避免了繁琐的标记过程，又减少了天然酶的使用。
本发明的另一个目提提供一种上述基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫分析方法，其特征在于，包括如下分析步骤：
a.将权利要求前述制得的锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器，在IgG抗原温育液中温育，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
b.以步骤a中抗原温育后的无标记电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，在邻苯二胺测试液中，用差示脉冲伏安法检测电化学信号，分别输出各不同已知浓度的抗原电流信号曲线；
c. 以各已知抗原的浓度值为纵作标，以步骤b中输出的各已经浓度对应的电流信号曲线的峰值为横作标，描点拟合抗原免疫检测标准曲线；
d．按步骤a和步骤b的过程，进行未知抗原浓度的电化学免疫分析，输出电流信号曲线，以本步中的电流信号曲线的电源峰值为纵作标，描点步骤c中的抗原免疫检测标准曲线，确定未知抗原的浓度。
步骤a中，温育时间为30～40min。
步骤b中，邻苯二胺测试液由20.0 mM邻苯二胺和6.0 mM 过氧化氢混合液组成，溶液的pH为7.0，溶液体积为10～20mL。
本发明的无标记电化学免疫分析方法，采用具有类过氧化物酶活性的CuFe MOF纳米酶催化邻苯二胺（o-PD）的氧化，以产生显著增加的还原电流。当温育IgG抗原后，形成的特异性免疫复合物会抑制CuFe-MOF酶催化，使得电化学信号强度降低。根据电化学信号的变化和抗原浓度间的线性关系，实现对IgG的定量检测，并且检测敏灵度高，检测范围大。
附图说明
图1为实施例1制备的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶材料的SEM图。
图2为实施例1制备的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶材料的TEM图。
图3为本发明电化学免疫传感器的制作和免疫分析示意图。
图4为实施例2中得到的IgG标准样品检测的线性曲线。
具体实施方式
为了更好的阐明本发明的技术过程和目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细介绍。
实施例1
本发明提供了一种基于纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的IgG无标记电化学免疫传感器的制备方法，该IgG无标记免疫传感器的制备方法包括以下步骤：
(1)制备纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶材料
在50 mL烧杯中，将0.7246 g 2-氨基对苯二甲酸溶解在20 mL N,N-二甲基甲酰胺中0.2mol/L，然后分别逐滴添加0.8 mL NaOH（4M），0.682 g CuCl2.2H2O和FeCl3.6H2O，搅拌30分钟，待混合均匀，将溶液转入聚四氟乙烯材质的反应釜内衬中，将内衬放入钢制材料的反应釜内并拧紧反应釜上盖，然后将反应釜置于恒温鼓风干燥箱中设置温度为100 ℃、反应为18 h。待反应结束后，使高压反应釜自然冷却至室温，分离沉淀物并先后用蒸馏水和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤3次，最后于80℃条件下真空干燥12 h，得深褐色粉末为纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶材料。如图1所示图1为本实施例制备的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶材料的SEM图，由图1扫描照片可知铜铁双金属有机框架呈纺锤形结构且表面光滑，形貌和尺寸较为均一，粒径约为600 nm；图2为是采用本实施例制备的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶材料的TEM图，由图2可见，纳米级铜铁双金属有机框架的纺锤形结构清晰可见，形状规整。
(2)将上述第（1）步制得的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶材料与去离子水混合配制浓度为2.0 mg/mL的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶材料悬浮液，与浓度为0.5wt％壳聚糖溶液等体积混合后超声分散；
(3)取20 μL上述第（2）步的混合液和20 μL 200 μg/mL链霉亲和素溶液等体积混合；
(4)取5 μL上述第（3）步的链霉亲和素功能化的混合溶液均匀滴涂于洁净的玻碳电极表面，然后放置在4℃下干燥；
(5)取10 μL 200μg/mL生物素化的IgG抗体均匀滴涂于上述修饰材料的表面，室温下温育12 h，用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
(6)取5 μL 0.5 wt％牛血清蛋白均匀滴涂于上述第（5）步修饰的电极表面层，在室温下封闭60 min，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，制得本实施例的IgG无标记电化学免疫传感器。
实施例2
按如图3所示的流程，对实施例1中的制得的其于纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的IgG无标记电化学免疫传感器进行免疫分析方法包括：
(a)取上述制得的IgG无标记免疫传感器若干个，分别与不同已知浓度IgG抗原的温育液中温育，温育时间为40 min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
(b)以制得的IgG无标记免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，在含有20.0 mM邻苯二胺和6.0 mM 过氧化氢测试液中，用差示脉冲伏安法检测其电化学信号，各不同已知浓度的抗原温育的电极分别输出电流信号曲线如图4A所示；
(c)以各已知抗原的浓度值为纵作标，以步骤b中输出的各已经浓度对应的电流信号曲线的谷值为横作标，描点拟合抗原免疫检测标准曲线，如图4B所示。
以图4B的IgG抗原免疫检测标准曲线。为考察该无标记电化学传感器的实际应用的可靠性，从疾控中心提供的临床血样中的IgG含量按本实施例上述(a)步和(b)步的过程进行加标回收实验，所得结果如表1所示，与标准加入值基本一致，回收率在94.40%-106.3%。
表1
样品 加标准浓度(ng/mL) 本实施例的检测浓度(ng/mL) 回收率（%）
1 0.050 0.049 98.00
2 5.00 4.72 94.40
3 15.00 15.94 106.3
4 20.00 20.73 103.7
5 25.00 26.11 104.4

Claims (9)

1.一种基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤
第一步，制备纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的微粒：将2-氨基对苯二甲酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，然后分别逐滴添加NaOH、 CuCl2.2H2O和FeCl3.6H2O，搅拌均匀得到混合液，将混合液转入聚四氟乙烯内衬的反应釜中，然后将反应釜置于恒温鼓风干燥箱中于90～110 ℃、反应为16～20 h；然后待高压反应釜自然冷却至室温，分离反应后的沉淀物并先后用蒸馏水和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤3次，最后于80～90℃条件下真空干燥10～12 h，得深褐色粉末即为纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的微粒，粒径为500-600 nm；
第二步，用第一步制备得到的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的微粒，修饰玻碳电极界面固定抗体分子，制备得到无标记电化学免疫传感器。
2. 根据权利要求1所述的基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，第一步中，2-氨基对苯二甲酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺的浓度为：0.1～0.2mol/L， 2-氨基对苯二甲酸、CuCl2.2H2O和FeCl3.6H2O物质的量的比为：1：1：1，所述NaOH的浓度为4mol/L，加入量为混合液体积的4～5%。
3.根据权利要求1所述的基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，第二步的具体包括以下步骤：
(1)将纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶超声分散于二次去离子水中，形成分散均匀的悬浮液，再将悬浮液与壳聚糖溶液等体积混合并超声分散均匀；再将上述混合溶液与链霉亲和素溶液等体积混合均匀，得到链霉素生物功能化的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶混合液；
(2)将玻碳电极先用氧化铝粉抛光，用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，然后依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗玻碳电极，最后在氮气下吹干；
(3)取步骤(1)中制得的链霉素生物功能化的纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的混合溶液滴涂于步骤(2)中所得洁净的玻碳电极表面，并于低温冷藏的环境下晾干；
(4)将步骤(3)所修饰后的玻碳电极表面滴涂生物素化的抗体，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
(5)将牛血清蛋白溶液滴涂于步骤(4)中所得到的玻碳电极表面，在室温下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，得到该无标记电化学免疫传感器。
4. 根据权利要求3所述的基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的悬浮液的分散浓度为1～2.0 mg/mL，壳聚糖溶液的浓度为0.5～1.0wt％，链霉亲和素的浓度为200～300μg/mL；纺锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的悬浮液、壳聚糖溶液和链霉亲和素的混合体积比为1：1：1；步骤 (2)中，所述的氧化铝粉粒径为0.5 μm。
5. 根据权利要求3所述的基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述冷藏低温为0～4℃；步骤(4)中，所述生物素化的抗体浓度为100～200 μg/mL。
6.根据权利要求3所述的基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述牛血清蛋白溶液浓度为1.0～2.0wt％。
7.一种基于铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫分析方法，其特征在于，包括如下分析步骤：
a.将权利要求1～6任一项制备的所述锤形铜铁双金属有机框架纳米酶的无标记电化学免疫传感器，在IgG抗原温育液中温育，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
b.以步骤a中抗原温育后的无标记电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，在邻苯二胺测试液中，用差示脉冲伏安法检测电化学信号，分别输出各不同已知浓度的抗原电流信号曲线；
c. 以各已知抗原的浓度值为纵作标，以步骤b中输出的各已经浓度对应的电流信号曲线的峰值为横作标，描点拟合抗原免疫检测标准曲线；
d．按步骤a和步骤b的过程，进行未知抗原浓度的电化学免疫分析，输出电流信号曲线，以本步中的电流信号曲线的电源峰值为纵作标，描点步骤c中的抗原免疫检测标准曲线，确定未知抗原的浓度。
8.根据权利要求7所述的无标记电化学免疫分析方法，其特征在于，步骤a中，温育时间为30～40min。
9.根据权利要求7所述的无标记电化学免疫分析方法，其特征在于，步骤b中，邻苯二胺测试液由20.0 mM邻苯二胺和6.0 mM 过氧化氢混合液组成，溶液的pH为7.0，溶液体积为10～20mL。
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