CN107328930A - 一种基于双信号响应比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备及应用 - Google Patents

一种基于双信号响应比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于双信号响应比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备及应用，硫化铜‑硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物作为基底材料，甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体作为信号标记物，检测癌胚抗原比率型免疫传感器的制备及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。硫化铜‑硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物固定捕获抗体，并直接产生电化学信号。羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈作为固定标记抗体和电子媒介体甲苯胺蓝标记矩阵，直接产生电化学信号。该免疫传感器是在一个传感平台通过差分脉冲伏安法在不同的电位产生电化学信号建立起来的，这种方法提高了分析性能，临床可靠性和结果的准确性。

Description

一种基于双信号响应比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备 及应用
技术领域
本发明涉及一种基于双信号响应的比率型丝网印刷电极癌胚抗原免疫传感器的制备及应用，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
癌胚抗原是大肠癌组织产生的一种糖蛋白，可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。 癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物，因此对癌胚抗原-CEA的早期诊断很重要。目前在临床检测癌胚抗原-CEA方法有放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。电化学免疫传感器通过把免疫学方法和电化学方法相结合的一种生物传感器，利用抗原与抗体之间的特异性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。因此本发明制备了一种基于硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物作为基底材料，多重功能化的介孔材料二氧化铈（甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体）作为信号标记物构建了双信号响应的比率型免疫传感器，实现了对癌胚抗原的检测。
Yicheng Wei等利用介孔二氧化铈负载甲苯胺蓝构建了电化学免疫传感器，介孔二氧化铈具有丰富的孔洞结构和良好的吸附性，这些特性使介孔二氧化铈对甲苯胺蓝有一个大的吸附容量并且又有效地防止了甲苯胺蓝的泄漏，提高了传感器的灵敏度。该传感器通过两种平行的电化学方法检测，线性范围为0.5 pg/mL ~ 50 ng/mL，检测线为0.16 pg/mL。专利（201510664183.1）基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法及应用，花状二氧化铈-氧化石墨烯复合物比石墨烯具有更大的比表面积，增加了花状金铂的负载量，提高了传感器的灵敏度。该传感器的检测范围为2 pg/mL～20 ng/mL，检测线为1.6 pg/mL。
本发明利用硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物具有较大的比表面，直接产生电化学信号，将其金纳米粒子功能化后，通过氨基和贵金属之间的相互作用，将捕获抗体连接到硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物表面，增加了免疫传感器的稳定性和灵敏度。羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈负载甲苯胺蓝，直接产生电化学信号，羧甲基壳聚糖掺杂的离子液体用于提高甲苯胺蓝的吸附容量，阻止其泄漏和促进电子转移。该免疫传感器是在一个传感平台通过差分脉冲伏安法在不同电位产生的化学信号建立起来的，具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，提高了分析性能和临床可靠性，为目前有效检测癌胚抗原CEA提供了新途径。
发明内容
本发明的目的之一是基于硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物作为基底材料和多重功能化的介孔材料二氧化铈（甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体）作为信号标记物构建了一种无酶、快速且超灵敏的比率型电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物作为基底材料和多重功能化的介孔材料二氧化铈（甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体）作为信号标记物，利用硫化铜-硫化亚铜和甲苯胺蓝在不同电位处产生电化学信号建立的电化学比率型免疫传感器。
本发明的目的之三是该比率型电化学免疫传感器通过一个传感平台在磷酸盐缓冲溶液中通过差分脉冲伏安法实现对癌胚抗原-CEA的检测，该法提高分析性能和临床可靠性，从而提高结果的准确性。
本发明的目的之四是采用丝网印刷电极检测技术，由于其具有简单，低成本和方便微型化容易实现商业化。
本发明的技术方案如下：
(1) 金纳米粒子的制备
将100 mL，质量分数0.01% HAuCl4溶液加热至沸腾，然后加入1.5 mL，质量分数1% 柠檬酸三钠溶液，保持30分钟，溶液变成酒红色，冷却至室温备用。
(2) 氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯的复合物的制备
250 mg CuSO4·5H2O溶解于40 mL蒸馏水，然后加入126 mg Na2SO3和0.1 mL浓盐酸；5分钟后，加入38 mg硫代乙酰胺；再加入80 ~ 120 mg的氧化石墨烯；搅拌15 min，在180 ℃条件下反应10 h，冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥12 h，得到硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物；接着，取上述取50 ~ 70 mg硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物放入三口烧瓶中，加入20 mL无水乙醇，超声30 min；加入0.2 ~ 0.4 mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，在70℃条件下回流1.5 h，反应结束后，冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥12 h，得到氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物。
(3) 硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物的制备
取上述产物30 ~ 50 mg氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物放入锥形瓶中，加入40 ~ 60 mL上述金纳米粒子悬浮液，超声和搅拌各3 h，复合结束后，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物。
(4) 羧基金纳米粒子的制备
首先，将20 mL的质量分数 1% HAuCl4、75 mg的巯基琥珀酸和85 mL的去氧甲醇混合，缓慢加入25 mL浓度为0.2 mol/L NaBH4溶液，得到深棕色沉淀，用水和乙醇洗涤，干燥得到羧基金纳米粒子。
(5) 氨基化的纳米介孔二氧化铈的制备
将1.0 g硝酸铈溶解在装有1 mL高纯水的锥形瓶中，在搅拌下加入30 mL乙二醇和1 mL丙酸，搅拌30 min后，转移到高压反应釜中，在180 ℃条件下，反应200 min，反应结束冷却至室温，离心、洗涤并干燥，得到纳米介孔二氧化铈；接着，取上述产物纳米介孔二氧化铈0.06 ~ 0.14 g放入三口烧瓶中，加入20 mL无水乙醇，超声30 min，接着加入0.2 ~ 0.4 mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，置于油浴锅中，在70 ℃条件下，回流1.5 h，待反应结束后，冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到氨基化的纳米介孔二氧化铈。
(6)羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈的制备
取上述产物30 ~ 50 mg氨基化的纳米介孔二氧化铈放入锥形瓶中，加入5 ~ 10 mg上述羧基金纳米粒子，超声和搅拌各3 h，复合结束后，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈的复合物。
(7)甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记的癌胚抗原检测抗体溶液的制备
将1 ~ 2 mg的羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈、1 mL浓度为10 μg/mL癌胚抗原检测抗体混合，在4 ℃震荡12 h，离心洗涤；然后，将10 mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2 mmol N-羟基琥珀酰亚胺和1 mL， 2 mg/mL的甲苯胺蓝加入在沉淀物中，在4 ℃震荡12 h，离心洗涤；最后，1 mL质量分数为1 %羧甲基壳聚糖和浓度为0.5 ~1.2 mg/mL离子液体加入在沉淀物中，在4 ℃震荡2 h，离心后，得到的甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记的癌胚抗原检测抗体孵化物重新分散于1 mL、pH为6.9的磷酸盐缓冲溶液中，于4 ℃冰箱中储存备用。
本发明的有益成果
（1）本发明首次将硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物引入电化学免疫传感器作为基底材料，可直接产生电化学信号。
（2）本发明利用介孔二氧化铈大比表面积和良好的吸附性能，吸附甲苯胺蓝可直接产生信号。介孔二氧化铈与羧基金纳米粒子复合，可以提高其与标记抗体的键合力和导电性。
（3）本发明将羧甲基壳聚糖/离子液体引入，有效地增加了甲苯胺蓝的吸附容量并防止其泄漏，此外具有促进电子转移的作用。
（4）本发明利用硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物在-0.12V产生电化学信号，甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体在-0.51V产生电化学信号，两者相互不干扰。
（5）本发明利用“ΔI甲苯胺蓝+ | ΔI硫化铜-硫化亚铜 |”作为检测癌胚抗原响应信号，相比于ΔI甲苯胺蓝 或ΔI硫化铜-硫化亚铜 单独作为检测癌胚抗原响应信号，具有更高的灵敏度和更低的检测限, 即成为一种比率型传感器。
（6）本发明将制备的比率型电化学免疫传感器用于癌胚抗原的检测，检测限低，线性范围宽，可以通过该方法提高分析性能和临床可靠性，从而提高结果的准确性，实现简单、快速、灵敏和特异性检测。本发明用于癌胚抗原的检测，检测限可达到0.78 pg/mL。
（7）本发明将丝网印刷电极用于癌胚抗原的检测，丝网印刷电极具有低成本和小型化的优势，易于实现商业化。
具体实施方式
实施例1 一种基于双信号响应的比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备方法
(1)用4.5 μL浓度为1.0 mg/mL硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
(2)继续将4.5 µL浓度为10 µg/mL的癌胚抗原捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
(3)用4.5 μL质量分数为0.1 %的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点， 4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
(4)将4.5 μL浓度为0.001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液滴加到修饰电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
(5)将4.5 μL浓度为1.8 mg/mL的甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记的癌胚抗原检测抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1 h，清洗后，晾干，冰箱中储存备用。
实施例2 硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物的制备
(1)金纳米粒子的制备
将100 mL，质量分数0.01% HAuCl4溶液加热至沸腾，然后加入1.5 mL，质量分数1% 柠檬酸三钠溶液，保持30分钟，溶液变成酒红色，冷却至室温备用；
(2) 氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯的复合物的制备
250 mg CuSO4·5H2O溶解于40 mL蒸馏水，然后加入126 mg Na2SO3和0.1 mL浓盐酸；5分钟后，加入38 mg硫代乙酰胺；5分钟后，加入75 mg硫代乙酰胺；接着，再加入80 mg的氧化石墨烯；搅拌15 min后，转移到高压反应釜中，在180 ℃条件下，反应10 h，反应结束冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物；接着，取上述产物50 mg硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物放入三口烧瓶中，加入20 mL无水乙醇，超声30 min；接着加入0.2 mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，置于油浴锅中，在70 ℃条件下，回流1.5 h，待反应结束后，冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12h，得到氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物；
(3)硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物的制备
取上述产物30 mg氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物放入锥形瓶中，加入40 mL上述金纳米粒子悬浮液，超声和搅拌各3 h，复合结束后，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物。
实施例3 硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物的制备
(1)金纳米粒子的制备
将100 mL，质量分数0.01% HAuCl4溶液加热至沸腾，然后加入1.5 mL，质量分数1% 柠檬酸三钠溶液，保持30分钟，溶液变成酒红色，冷却至室温备用；
(2)氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯的复合物的制备
250 mg CuSO4·5H2O溶解于40 mL蒸馏水，然后加入126 mg Na2SO3和0.1 mL浓盐酸；5分钟后，加入38 mg硫代乙酰胺；5分钟后，加入75 mg硫代乙酰胺；接着，再加入120 mg的氧化石墨烯；搅拌15 min后，转移到高压反应釜中，在180 ℃条件下，反应10 h，反应结束冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物；接着，取上述产物70 mg硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物放入三口烧瓶中，加入20 mL无水乙醇，超声30 min；接着加入0.4 mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，置于油浴锅中，在70 ℃条件下，回流1.5 h，待反应结束后，冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12h，得到氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物；
(3)硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物的制备
取上述产物50 mg氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物放入锥形瓶中，加入60 mL上述金纳米粒子悬浮液，超声和搅拌各3 h，复合结束后，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物。
实施例4 甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记的癌胚抗原检测抗体溶液的制备
(1) 羧基金纳米粒子的制备
首先，将20 mL的质量分数 1% HAuCl4、75 mg的巯基琥珀酸和85 mL的去氧甲醇混合，缓慢加入25 mL浓度为0.2 mol/L NaBH4溶液，得到深棕色沉淀，用水和乙醇洗涤，干燥得到羧基金纳米粒子；
(2)氨基化的纳米介孔二氧化铈的制备
将1.0 g硝酸铈溶解在装有1 mL高纯水的锥形瓶中，在搅拌下加入30 mL乙二醇和1 mL丙酸，搅拌30 min后，转移到高压反应釜中，在180 ℃条件下，反应200 min，反应结束冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到纳米介孔二氧化铈；接着，取上述产物纳米介孔二氧化铈0.06 g放入三口烧瓶中，加入20 mL无水乙醇，超声30 min，接着加入0.4 mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，置于油浴锅中，在70 ℃条件下，回流1.5 h，待反应结束后，冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到氨基化的纳米介孔二氧化铈；
(3)羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈的制备
取上述产物30 mg氨基化的纳米介孔二氧化铈放入锥形瓶中，加入5 mg上述羧基金纳米粒子，超声和搅拌各3 h，复合结束后，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈的复合物；
(4)甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体标记的癌胚抗原检测抗体溶液的制备
将1 mg的羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈、1 mL浓度为10 μg/mL癌胚抗原检测抗体混合，在4 ℃震荡12 h，离心洗涤；然后，将10 mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2 mmol N-羟基琥珀酰亚胺和1 mL， 2 mg/mL的甲苯胺蓝加入在沉淀物中，在4 ℃震荡12 h，离心洗涤；最后，1 mL质量分数为1 %羧甲基壳聚糖和浓度为0.5 mg/mL离子液体加入在沉淀物中，在4 ℃震荡2 h，离心后，得到的甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记的癌胚抗原检测抗体孵化物重新分散于1 mL、pH为6.9的磷酸盐缓冲溶液中，于4 ℃冰箱中储存备用。
实施例5 甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记的癌胚抗原检测抗体溶液的制备
(1) 羧基金纳米粒子的制备
首先，将20 mL的质量分数 1% HAuCl4、75 mg的巯基琥珀酸和85 mL的去氧甲醇混合，缓慢加入25 mL浓度为0.2 mol/L NaBH4溶液，得到深棕色沉淀，用水和乙醇洗涤，干燥得到羧基金纳米粒子；
(2)氨基化的纳米介孔二氧化铈的制备
将1.0 g硝酸铈溶解在装有1 mL高纯水的锥形瓶中，在搅拌下加入30 mL乙二醇和1 mL丙酸，搅拌30 min后，转移到高压反应釜中，在180 ℃条件下，反应200 min，反应结束冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到粉末为纳米介孔二氧化铈；接着，取上述产物纳米介孔二氧化铈0.14 g放入三口烧瓶中，加入20 mL无水乙醇，超声30min，接着加入0.4 mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，置于油浴锅中，在70 ℃条件下，回流1.5h，待反应结束后，冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到氨基化的纳米介孔二氧化铈；
(3)羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈的制备
取上述产物50 mg氨基化的纳米介孔二氧化铈放入锥形瓶中，加入10 mg上述羧基金纳米粒子，超声30 min，震荡12 h，复合结束后，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，得到羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈的复合物；
(4)甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记的癌胚抗原检测抗体溶液的制备
将1 mg的羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈、1 mL浓度为10 μg/mL癌胚抗原检测抗体混合，在4 ℃震荡12 h，离心洗涤；然后，将10 mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2 mmol N-羟基琥珀酰亚胺和1 mL， 2 mg/mL的甲苯胺蓝加入在沉淀物中，在4 ℃震荡12 h，离心洗涤；最后，1 mL质量分数为1 %羧甲基壳聚糖和浓度为1.2 mg/mL离子液体加入在沉淀物中，在4 ℃震荡2 h，离心后，得到的甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记的癌胚抗原检测抗体孵化物重新分散于1 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，于4 ℃冰箱中储存备用。
实施例6 癌胚抗原检测步骤
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，印刷银/氯化银电极为参比电极，印刷石墨电极为辅助电极，直径3 mm的印刷石墨电极为工作电极，在50 μL的pH值为6.9的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)选择差分脉冲伏安法对癌胚抗原在磷酸盐缓冲溶液中进行检测，记录电流随电压的变化，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制进行样品中癌胚抗原的检测，检测的结果可以在工作曲线中查得；
(4)该电化学免疫传感器对于前列腺抗原检测线性范围为0.001 ~ 100 ng/mL，检测限0.78 pg/mL。

Claims (4)

1.一种基于双信号响应比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用4.5 μL浓度为0.3 ~ 1.6 mg/mL硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物溶液滴加到丝网印刷工作电极表面，室温下晾干；
(2)继续将4.5 µL浓度为8 ~ 12 µg/mL的癌胚抗原-CEA捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
(3)用4.5 μL质量分数为0.05 ~ 0.15 %的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
(4)将4.5 μL浓度为0.001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液滴加到修饰电极表面，4 ℃下晾干，超纯水冲洗；
(5)将4.5 μL浓度为0.8 ~ 2.4 mg/mL的甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1 h，清洗后，晾干，冰箱中储存备用。
2.如权利要求1所述的一种基于双信号响应的比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备方法，所述硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物的制备，其特征在于，包括以下步骤：
(1)金纳米粒子的制备
将100 mL，质量分数0.01% HAuCl4溶液加热至沸腾，然后加入1.5 mL，质量分数1% 柠檬酸三钠溶液，保持30分钟，溶液变成酒红色，冷却至室温备用；
(2)氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯的复合物的制备
250 mg CuSO4·5H2O溶解于40 mL蒸馏水，然后加入126 mg Na2SO3和0.1 mL浓盐酸；5分钟后，加入38 mg硫代乙酰胺；再加入80 ~ 120 mg的氧化石墨烯；搅拌15 min，在180 ℃条件下反应10 h，冷却至室温，离心、洗涤并在50℃真空干燥12 h，得到硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物；接着取上述50 ~ 70 mg硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物放入三口烧瓶中，加入20 mL无水乙醇，超声30 min；加入0.2 ~ 0.4 mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，在70 ℃条件下回流1.5 h，反应结束后，冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥12 h，得到氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物；
(3)硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物的制备
取30 ~ 50 mg氨基化的硫化铜-硫化亚铜/石墨烯复合物放入锥形瓶中，加入40 ~ 60mL金纳米粒子悬浮液，超声和搅拌各3 h，复合结束后，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥12 h，得到硫化铜-硫化亚铜/石墨烯负载金纳米粒子的复合物。
3.如权利要求1所述的一种基于双信号响应的比率型丝网印刷电极免疫传感器的制备方法，所述甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记抗体溶液的制备，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 羧基金纳米粒子的制备
首先，将20 mL的质量分数 1% HAuCl4、75 mg的巯基琥珀酸和85 mL的去氧甲醇混合，缓慢滴加25 mL浓度为0.2 mol/L NaBH4溶液，得到深棕色沉淀，用水和乙醇洗涤，干燥得到羧基金纳米粒子；
(2)氨基化的纳米介孔二氧化铈的制备
将1.0 g硝酸铈溶解于装有1 mL高纯水的锥形瓶中，在搅拌下加入30 mL乙二醇和1 mL丙酸，搅拌30 min后，转移到高压反应釜中，在180 ℃条件下，反应200 min，冷却至室温，离心、洗涤并干燥，得到粉纳米介孔二氧化铈；取0.06 ~ 0.14 g纳米介孔二氧化铈放入三口烧瓶中，加入20 mL无水乙醇，超声30 min，加入0.2 ~ 0.4 mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，置于油浴锅中，在70 ℃下回流1.5 h，反应结束后，冷却至室温，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥12 h，得到氨基化的纳米介孔二氧化铈；
(3)羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈的制备
取30 ~ 50 mg氨基化的纳米介孔二氧化铈放入锥形瓶中，加入5 ~ 10 mg羧基金纳米粒子，超声和搅拌各3 h，复合结束后，离心、洗涤并在50 ℃真空干燥12 h，得到羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈的复合物；
(4)甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记抗体溶液的制备
将1 ~ 2 mg的羧基金纳米粒子功能化的纳米介孔二氧化铈、1 mL浓度为10 μg/mL癌胚抗原检测抗体混合，在4 ℃震荡12 h，离心洗涤；然后，将10 mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2 mmol N-羟基琥珀酰亚胺和1 mL，2 mg/mL的甲苯胺蓝加入在沉淀物中，在4 ℃震荡12 h，离心洗涤；最后，1 mL质量分数为1 %羧甲基壳聚糖和浓度为0.5 ~1.2 mg/mL离子液体加入在沉淀物中，在4 ℃震荡2 h，离心后，得到的甲苯胺蓝/羧基金纳米粒子功能化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/离子液体标记抗体重新分散于1 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，于4 ℃冰箱中储存备用。
4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于双信号响应的比率型丝网印刷电极免疫传感器，检测步骤如下：
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，印刷银/氯化银电极为参比电极，印刷石墨电极为辅助电极，直径3 mm的印刷石墨电极为工作电极，在50 μL的pH值为6.9的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)选择差分脉冲伏安法对癌胚抗原在磷酸盐缓冲溶液中进行检测，记录电流随电压的变化，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制进行样品中癌胚抗原-CEA的检测，检测的结果可以在工作曲线中查得。
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