CN106442675A - 一种基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用 - Google Patents

一种基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及电化学免疫传感技术领域，特别是涉及一种基于金银金核壳纳米复合物（Au@Ag@Au NPs）标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用。具体是利用氮掺杂石墨烯（NG）修饰玻碳电极表面作为抗体捕获基底，Au@Ag@Au NPs跟踪标记癌胚抗原第二抗体，通过夹心免疫反应，Au@Ag@Au NPs标记的第二抗体被捕获到传感器的表面，通过检测过氧化氢和对苯二酚在PBS溶液中的电化学信号实现癌胚抗原的检测。

Description

一种基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备 及应用
技术领域
本发明涉及电化学免疫传感技术领域，特别是涉及一种基于金银金核壳纳米复合物（Au@Ag@Au NPs）标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用。具体是利用氮掺杂石墨烯（NG）修饰玻碳电极表面作为抗体捕获基底，Au@Ag@Au NPs跟踪标记癌胚抗原第二抗体，通过夹心免疫反应，Au@Ag@Au NPs标记的第二抗体被捕获到传感器的表面，通过检测过氧化氢和对苯二酚在PBS溶液中的电化学信号实现癌胚抗原的检测。
背景技术
癌胚抗原(CEA)是由胎儿时期的内胚层衍生而来的胃肠道及肝胰合成的一种重要的肿瘤标志物，其分子量为150～300 kD。检测肿瘤的机理为：癌胚抗原(CEA)在正常成人血清中含量甚微，当某些恶性肿瘤细胞基因调控受到损伤后，可能重新启动有关蛋白的合成，致使肿瘤患者血清中 CEA 的浓度升高，即肿瘤患者的血清CEA水平会升高。当CEA浓度高于20 ng/mL时，则意味着可能患有消化道肿瘤。因此测定肿瘤患者血清中 CEA 的浓度，对于监测肿瘤的复发、转移等有一定的参考价值，对癌胚抗原的研究及检测有着重要意义。目前对癌胚抗原的检测手段主要有酶联免疫分析法、高效液相色谱法、微生物法这些方法具有较高的灵敏度和选择性，，但检测过程需要昂贵的专用仪器，需要复杂的前处理且操作繁琐、样品消耗量较大，不适宜快速检测。电化学免疫分析因具有特异性好、选择性高、便于携带、廉价、操作简单等优点，可以实现对样品的快速检测。同时可以通过对电极表面修饰及对二抗进行标记等方法放大信号，提高灵敏度。
本发明中NG作为第一抗体捕获基底，由于优异的导电性和大的表面积，不仅可以负载更多的抗体，而且可以促进蛋白质与电极之间的电子传递。Au@Ag@Au NPs作为第二抗体标记物，同时具有Au NPs的稳定性和Ag NPs优异的催化性能，通过检测PBS溶液中过氧化氢和对苯二酚的电化学信号实现癌胚抗原的检测。在本发明中构建的电化学免疫传感器具有成本低，稳定性好，制备过程简单，灵敏度高等优点。
发明内容
本发明的目的之一是以Au@Ag@Au NPs作为第二抗体标记物，利用Au@Ag@Au NPs对过氧化氢和对苯二酚电化学反应的催化作用，构建了一种简单快速，稳定性好，灵敏度高的电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将该电化学免疫传感器用于CEA的检测。
本发明的技术方案为：
1. 基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干；取6~10 μL氮掺杂石墨烯/癌胚抗原第一抗体的复合物（NG-Ab1）分散液滴涂到电极表面，在4 ℃冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得到Ab1-NG/GCE；
(2)取10 μL 质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1-NG/GCE；
(3)滴加10 μL浓度为0.01 ng/mL~100ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得CEA/BSA/Ab1-NG/GCE；
(5)滴加6~10 μL Au@Ag@Au标记CEA第二抗体(Ab2-Au@Ag@Au)到上述电极表面，在37℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器 (Ab2-Au@Ag@Au/CEA/BSA/Ab1-NG/GCE)。
2.上述的Ab1-NG的制备：
(1) NG的制备
取140.0 mg GO分散到70.0 ml去离子水中超声1 h，1000 r/min下离心5 min，去掉未剥脱的颗粒，用30%的NH3调节pH至10，搅拌10 min，加入2.0 mL水合肼，再搅拌10 min后于高压釜中80℃下加热3 h，过滤洗涤至中性，干燥得到NG；
(2) Ab1-NG的制备
将1 mg的NG超声分散在1 mL 2%的壳聚糖溶液中，加入1 mL 1 μg/mL的Ab1(CEA)，反应12 h后离心洗涤，重新分散在1 mL壳聚糖溶液中，得NG-Ab1。
3. 上述的Ab2-HRP-Au@Ag@Au的制备：
（1）Au@Ag@Au NPs的制备
向97 mL超纯水中依次加入1 mL（1wt%）HAuCI4，1 mL ( 0.03 M) Na3C6H5O7，然后逐滴滴加1 mL NaBH4 得酒红色溶液，表明成功制备了单分散的Au NPs。取10 mL 50 mM的溴化十六烷基三甲胺（CTAB）溶液，依次加入0.5 mL 0.1 M的抗坏血酸溶液，0.25 mL10 mM的AgNO3溶液及0.25 mL的Au NPs，强烈搅拌下滴加60 μL 1 M的NaOH溶液，溶液变成亮黄色表明金种子包上了一层银壳。0.5 mL 0.1 M的抗坏血酸和164 μL（1wt%）的HAuCl4溶液在强烈搅拌下加入到上述溶液中，溶液变成深蓝色表明包上了金，得Au@Ag@Au NPs；
（2）Ab2-HRP-Au@Ag@Au的制备
将4 μL 0.1 M的Na2CO3溶液加入到1 mL Au@Ag@Au NPs中，然后加入Ab2-HRP，使其最终浓度为5 μg/mL，1 h之后加入50 μL 10%（W/V）的BSA反应1 h，将混合物在7130 r/min下离心10 min，用含有2%（W/V）的BSA的PBS洗涤两次，重新分散到100 μL的PBS中，得Ab2-HRP-Au@Ag@Au。
CEA的检测：
(1) 在含有3.5 mM对苯二酚，1.0 mM 过氧化氢的10 mL 0.1 M pH 7.4的PBS缓冲溶液的电解池中，Ab2-Au@Ag@Au/CEA/BSA/Ab1-NG/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，使用电化学工作站进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度CEA标准溶液的电极进行检测，扫描的电位为-0.4～0.8 V，记录差分脉冲伏安曲线图，根据所得的电流值和CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替CEA标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
(1)本发明以NG作为第一抗体捕获基底，不仅可以负载更多的抗体，而且可以促进蛋白质和电极之间的电子传递，进而增加电极的灵敏度；
(2) 以Au@Ag@Au NPs作为第二抗体标记物，具有大的表面积和活性位点可以增加第二抗体的负载量，并利用Au@Ag@Au NPs对过氧化氢和对苯二酚电化学反应的催化作用，使传感器具有更高的灵敏度；
(3)本发明制备的电化学免疫传感器用于CEA的检测，具有简单、快速、高灵敏检测的优势。线性范围为0.01 ng/mL~100ng/mL，检出限为5 pg/mL。
附图说明：
图1所示为不同浓度的癌胚抗原修饰电极电化学信号影响的DPV还原峰图。
图2所示为本发明峰电流值与lgc 线性关系图。
其中，图1中由1到7的还原峰图分别代表CEA的浓度为0.01，0.05，0.1， 0.5，1，10，100 ng/mL。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干；取6 μL氮掺杂石墨烯/癌胚抗原第一抗体的复合物（NG-Ab1）分散液滴涂到电极表面，在4 ℃冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得到Ab1-NG/GCE；
(2)取10 μL 质量分数为1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1-NG/GCE；
(3)滴加10 μL浓度为0.01~100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得CEA/BSA/Ab1-NG/GCE；
(5)滴加6 μL Au@Ag@Au NPs标记CEA第二抗体(Ab2-Au@Ag@Au)到上述电极表面，在37℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器 (Ab2-Au@Ag@Au/CEA/BSA/Ab1-NG/GCE)。
实施例2基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干；取8 μL氮掺杂石墨烯/癌胚抗原第一抗体的复合物（NG-Ab1）分散液滴涂到电极表面，在4 ℃冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得到Ab1-NG/GCE；
(2)取10 μL 质量分数为2%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1-NG/GCE；
(3)滴加10 μL浓度为0.01~100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得CEA/BSA/Ab1-NG/GCE；
(5)滴加8 μL Au@Ag@Au NPs标记CEA第二抗体(Ab2-Au@Ag@Au)到上述电极表面，在37℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种金银金核壳纳米复合物标记的癌胚抗原电化学免疫传感器 (Ab2-Au@Ag@Au/CEA/BSA/Ab1-NG/GCE)。
实施例3一种基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干；取10 μL氮掺杂石墨烯/癌胚抗原第一抗体的复合物（NG-Ab1）分散液滴涂到电极表面，在4 ℃冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得到Ab1-NG/GCE；
(2)取10 μL 质量分数为3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1-NG/GCE；
(3)滴加10 μL浓度为0.01~100 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得CEA/BSA/Ab1-NG/GCE；
(5)滴加10 μL Au@Ag@Au NPs标记CEA第二抗体(Ab2-Au@Ag@Au)到上述电极表面，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种金银金核壳纳米复合物标记的癌胚抗原电化学免疫传感器 (Ab2-Au@Ag@Au/CEA/BSA/Ab1-NG/GCE)。
实施例4 上述的Ab1-NG的制备：
(1) NG的制备
取140.0 mg GO分散到70.0 ml去离子水中超声1 h，1000 r/min下离心5 min，去掉未剥脱的颗粒，用30%的NH3调节pH至10，搅拌10 min，加入2.0 mL水合肼，再搅拌10 min后于高压釜中80℃下加热3 h，过滤洗涤至中性，干燥得到NG；
(2) Ab1-NG的制备
将1 mg的NG超声分散在1 mL 2%的壳聚糖溶液中，加入1 mL 1 μg/mL的Ab1(CEA)，反应12 h后离心洗涤，重新分散在1 mL壳聚糖溶液中，得NG-Ab1。
实施例5 上述的Ab2-HRP-Au@Ag@Au的制备：
（1）Au@Ag@Au NPs的制备
向97 mL超纯水中依次加入1 mL（1wt%）HAuCI4，1 mL ( 0.03 M) Na3C6H5O7，然后逐滴滴加1 mL NaBH4 得酒红色溶液，表明成功制备了单分散的Au NPs。取10 mL 50 mM的溴化十六烷基三甲胺（CTAB）溶液，依次加入0.5 mL 0.1 M的抗坏血酸溶液，0.25 mL10 mM的AgNO3溶液及0.25 mL的Au NPs，强烈搅拌下滴加60 μL 1 M的NaOH溶液，溶液变成亮黄色表明金种子包上了一层银壳。0.5 mL 0.1 M的抗坏血酸和164 μL（1wt%）的HAuCl4溶液在强烈搅拌下加入到上述溶液中，溶液变成深蓝色表明包上了金，得Au@Ag@Au NPs；
（2）Ab2-HRP-Au@Ag@Au的制备
将4 μL 0.1 M的Na2CO3溶液加入到1 mL Au@Ag@Au NPs中，然后加入Ab2-HRP，使其最终浓度为5 μg/mL，1 h之后加入50 μL 10%（W/V）的BSA反应1 h，将混合物在7130 r/min下离心10 min，用含有2%（W/V）的BSA的PBS洗涤两次，重新分散到100 μL的PBS中，得Ab2-HRP-Au@Ag@Au。
实施例6CEA的检测：
(1) 在含有3.5 mM对苯二酚，1.0 mM 过氧化氢的10 mL 0.1 M pH 7.4的PBS缓冲溶液的电解池中，Ab2-Au@Ag@Au/CEA/BSA/Ab1-NG/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，使用电化学工作站进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度CEA标准溶液的电极进行检测，扫描的电位为-0.4～0.8 V，记录差分脉冲伏安曲线图，所得结果见图1，根据所得的电流值I p和CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)得到的峰电流值I p与CEA浓度的对数(lgc )的线性关系见图2，由图2可知，CEA在0.01ng/mL~100ng/mL浓度范围内，I p 与CEA浓度的对数呈良好的线性相关，线性方程为I p= -35.97315-8.4384lgc，c 是浓度，单位是g/mL，R2=0.9916，，检出限为5 pg/mL；
(4)将待测样品溶液代替CEA标准溶液进行检测。

Claims (4)

1.一种基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用，其特征在于包括以下步骤：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干；取6~10 μL氮掺杂石墨烯/癌胚抗原第一抗体的复合物（NG-Ab1）分散液滴涂到电极表面，在4 ℃冰箱中孵育12 h，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得到Ab1-NG/GCE；
(2)取10 μL 质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1-NG/GCE；
(3)滴加10 μL浓度为0.01~10 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得CEA/BSA/Ab1-NG/GCE；
(5)滴加6~10 μL Au@Ag@Au标记CEA第二抗体(Ab2-Au@Ag@Au)到上述电极表面，在37℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器 (Ab2-Au@Ag@Au/CEA/BSA/Ab1-NG/GCE)。
2.根据权利要求1所述的一种基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用，所述的Ab1-NG，其特征在于，制作步骤如下：
(1) NG的制备
取140.0 mg GO分散到70.0 ml去离子水中超声1 h，1000 r/min下离心5 min，去掉未剥脱的颗粒，用30%的NH3调节pH至10，搅拌10 min，加入2.0 mL水合肼，再搅拌10 min后于高压釜中80℃下加热3 h，过滤洗涤至中性，干燥得到NG；
(2) Ab1-NG的制备
将1 mg的NG超声分散在1 mL 2%的壳聚糖溶液中，加入1 mL 1 μg/mL的Ab1(CEA)，反应12 h后离心洗涤，重新分散在1 mL壳聚糖溶液中，得NG-Ab1。
3.根据权利要求1所述的一种基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用，所述的Ab2-HRP-Au@Ag@Au，其特征在于，制作步骤如下：
（1）Au@Ag@Au NPs的制备
向97 mL超纯水中依次加入1 mL（1wt%）HAuCI4，1 mL ( 0.03 M) Na3C6H5O7，然后逐滴滴加1 mL NaBH4 得酒红色溶液，表明成功制备了单分散的Au NPs；取10 mL 50 mM的溴化十六烷基三甲胺（CTAB）溶液，依次加入0.5 mL 0.1 M的抗坏血酸溶液，0.25 mL10 mM的AgNO3溶液及0.25 mL的Au NPs，强烈搅拌下滴加60 μL 1 M的NaOH溶液，溶液变成亮黄色表明金种子包上了一层银壳；0.5 mL 0.1 M的抗坏血酸和164 μL（1wt%）的HAuCl4溶液在强烈搅拌下加入到上述溶液中，溶液变成深蓝色表明包上了金，得Au@Ag@Au NPs；
（2）Ab2-HRP-Au@Ag@Au的制备
将4 μL 0.1 M的Na2CO3溶液加入到1 mL Au@Ag@Au NPs中，然后加入Ab2-HRP，使其最终浓度为5 μg/mL，1 h之后加入50 μL 10%（W/V）的BSA反应1 h，将混合物在7130 r/min下离心10 min，用含有2%（W/V）的BSA的PBS洗涤两次，重新分散到100 μL的PBS中，得Ab2-HRP-Au@Ag@Au。
4.根据权利要求1所述的制备方法制备的一种基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用，用于CEA的检测，检测步骤如下：
(1) 在含有3.5 mM对苯二酚、1.0 mM 过氧化氢的10 mL 0.1 M pH 7.4的PBS缓冲溶液的电解池中，Ab2-Au@Ag@Au/CEA/BSA/Ab1-NG/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，使用电化学工作站进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度CEA标准溶液的电极进行检测，扫描的电位为-0.4～0.8 V，记录差分脉冲伏安曲线图，根据所得的电流值和CEA浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替CEA标准溶液进行检测。
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