CN103257175A

CN103257175A - 同时检测四种氨基糖苷类抗生素传感器的制备方法及应用

Info

Publication number: CN103257175A
Application number: CN2013100797601A
Authority: CN
Inventors: 魏琴; 于海琴; 张勇; 杜斌; 李贺; 吴丹; 马洪敏
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: CN103257175B

Abstract

本发明公开了一种同时检测四种氨基糖苷类抗生素传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料及生物传感分析技术领域。本发明是在一个涂覆一层聚酯薄膜的矩形基片表面上，依次用银浆印刷1个参比电极，导电碳浆印刷4个工作电极、1个对电极，制得四通道丝网印刷电极。其特征在于，用铂纳米粒子—磺酸化石墨烯—羧甲基壳聚糖导电复合纳米材料将链霉素、庆大霉素、卡那霉素及壮观霉素四种氨基糖苷类抗生素的抗体分别固定到四个工作电极表面，滴涂检测液后与多通道电化学工作站检测电路相连，从而实现了四种氨基糖苷类抗生素的同时检测。本发明制备简单、加工方便、成本低、便于携带；检测方法简单、快速、灵敏度高、特异性好。

Description

同时检测四种氨基糖苷类抗生素传感器的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及同时检测四种氨基糖苷类抗生素传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料及生物传感分析技术领域。

背景技术

抗生素是抵抗致病微生物的药物，是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其它生活细胞发育功能的化学物质。

目前对抗生素残留量的检测方法主要有高效液相色谱法（简称HPLC）、液相色谱-串联质谱法（简称LC-MS/MS）、微生物法（简称MA）以及酶联免疫吸附试验法（简称ELISA），这些方法的特点如下：HPLC法虽然有较高的分析效率和灵敏度，但液相色谱仪价格及日常维护费用贵，分析时间长；LC-MS/MS法检测限低，定性定量准确，重现性好，但是仪器设备复杂、操作过程繁琐，对检验人员的操作技能要求很高，且不适于现场检测和快速检测；MA法手续繁多，分析速度慢且结果误差较大；ELISA法灵敏度及稳定性不够好，假阳性较高。

因此，寻求一种简单快速、准确度高且价格低廉的检测方法具有重要意义。

电化学免疫传感器结合了电化学检测的高灵敏度和免疫分析的高特异性，具有检测快速、样品用量小、灵敏度高等突出优点，已广泛用于抗生素检测。

基于丝网印刷电极（简称SPCEs）构建的多通道电化学免疫传感器，具有能够实现批量生产、电极集成、样品用量小、成本低、使用可抛弃、一次性同时检测多种物质的优点。

纳米材料修饰电化学免疫传感器由于其卓越的灵敏度引起人们的广泛关注。

石墨烯（简称GS）具有比表面积大，明显促进电子传递、扩增响应电流以及电化学催化等性质，石墨烯经磺酸化后成为磺酸化石墨烯，水溶性增加，使其在电极上分散均匀，导电性优越。

壳聚糖在电极修饰中起成膜作用，提高电化学传感器的导电能力和稳定性，羧甲基壳聚糖是壳聚糖的高级衍生物之一，由壳聚糖在碱性条件下与氯乙酸反应得到。与壳聚糖相比，其物理、化学性质均得到优化，具有100%水溶性、成膜性及极强的重金属螯合作用。

铂纳米粒子—磺酸化石墨烯—羧甲基壳聚糖构成的导电复合纳米材料具有良好的生物相容性及信号增强作用，是组装电化学免疫传感器的优良材料。

现在很多领域都在利用丝网印刷技术制作不同用处的电极，中国专利申请号200420029596.X、200820021748.X、200820021746.0和200920239018.1中采用的就是这种丝网印刷电极。

但尚未见到由丝网印刷电极制成的一次性同时检测链霉素、庆大霉素、卡那霉素及壮观霉素四种氨基糖苷类抗生素免疫传感器的相关报道。本发明将纳米功能材料、电化学免疫传感技术和丝网印刷技术结合为一体，研制一种用于同时检测链霉素、庆大霉素、卡那霉素及壮观霉素四种氨基糖苷类抗生素的新型传感器。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种检测方便、成本低廉、特异性强、灵敏度高的一次性同时检测链霉素、庆大霉素、卡那霉素及壮观霉素四种氨基糖苷类抗生素的丝网印刷电极免疫传感器。

本发明的技术方案，包括以下步骤。

1. 一种同时检测四种氨基糖苷类抗生素传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在一个涂覆一层聚酯薄膜的矩形基片表面上，依次以银浆印刷1个参比电极，以导电碳浆印刷4个工作电极、1个对电极、6个电极引出线及引出线端部，并在所有电极及引出线端部以外的基片上，以绝缘浆印刷一层绝缘层，并在电极区域形成一个圆形电解池凹槽，制得四通道丝网印刷电极；

（2）在（1）所述的四通道丝网印刷电极的4个工作电极上，滴涂5 ~ 10μL铂纳米粒子—磺酸化石墨烯—羧甲基壳聚糖构成的导电复合纳米材料溶液；所述导电复合纳米材料溶液，制备步骤如下：将铂纳米粒子和磺酸化石墨烯混合超声分散20 ~ 40 min，然后加入质量分数1.0%的羧甲基壳聚糖溶液超声混合20 ~ 40 min，制得导电复合纳米材料溶液；其中，铂纳米粒子、磺酸化石墨烯和羧甲基壳聚糖的质量比为（1 ~ 6）:（6 ~ 14）:（1 ~ 10）；

（3）在步骤（2）制得的4个工作电极上分别滴加5 ~ 10μL的链霉素抗体、庆大霉素抗体、卡那霉素抗体及壮观霉素抗体，再以6 ~ 10μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白封闭电极上的非特异性活性位点，置于4 ℃下保存备用，所述抗体浓度均5 ~ 10 μg/mL。

2. 一种同时检测四种氨基糖苷类抗生素的方法，该方法包括以下步骤：

（1）将链霉素、庆大霉素、卡那霉素及壮观霉素四种氨基糖苷类抗生素的标准溶液分别滴涂到上述方法制备的四通道丝网印刷电极传感器对应的工作电极表面上，孵化2 ~ 3 h，然后用pH为7.2 ~7.8的磷酸盐缓冲溶液清洗干净，得到修饰好的工作电极；

（2）将参比电极、步骤（1）所述修饰好的工作电极和对电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入5 ~ 10 mmol/L的铁氰化钾溶液，通过循环伏安法检测电流响应；

（3）根据所得电流响应与链霉素、庆大霉素、卡那霉素及壮观霉素四种氨基糖苷类抗生素的标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

（4）用待测样品代替四种氨基糖苷类抗生素的标准溶液，按照所述四种氨基糖苷类抗生素工作曲线的绘制方法进行检测，其检测结果对照所绘制的四种抗生素工作曲线，计算出样品中四种抗生素的含量。

所述的同时检测四种氨基糖苷类抗生素传感器，所用原料均可以在化学试剂公司或生物制药公司购买。

与现有技术相比，本发明的优势如下：

（1）采用的印刷电极制备简单、成本低、便于携带、易于微型化和集成化；

（2）采用印刷电极制成传感器，检测方法简单，灵敏度高、重现性好，应用范围广；

（3）采用印刷电极制成传感器，与多通道电化学工作站的检测电路相连，能够实现四种组分的同时测定，更加方便快捷，且同步性好，能减小测量误差；

（4）采用印刷电极制成传感器，采用免疫分析技术实现了不同种类抗生素的特异性识别。

附图说明

图1是本发明的印刷电极结构示意图。图1中，①基片，②参比电极，③工作电极，④对电极，⑤电极引出线，⑥引出线端部，⑦绝缘层，⑧圆形凹槽。

具体实施方式

下面结合附图和实例进一步说明本发明。

实施例1

本发明所述的同时检测四种氨基糖苷类抗生素传感器的制备方法

结合图1，步骤如下：在一个涂覆一层聚酯薄膜的矩形基片①表面上，依次以银浆印刷1个参比电极②，以导电碳浆印刷4个工作电极③、1个对电极④、6个电极引出线⑤及引出线端部⑥，并在所有电极及引出线端部以外的基片上，以绝缘浆印刷一层绝缘层⑦，并在电极区域形成一个圆形电解池凹槽⑧，制得四通道丝网印刷电极。

实施例2

本发明所述的同时检测四种氨基糖苷类抗生素传感器的制备方法，结合图1，步骤如下。

（1）在实施例1制备的四通道丝网印刷电极的4个工作电极上，滴涂5μL铂纳米粒子—磺酸化石墨烯—羧甲基壳聚糖导电复合纳米材料；所述导电复合纳米材料溶液，制备步骤如下：将铂纳米粒子和磺酸化石墨烯混合超声分散30min，然后加入质量分数1.0%的羧甲基壳聚糖溶液超声混合30 min，制成质量比为1 : 6 : 1的铂纳米粒子—磺酸化石墨烯—羧甲基壳聚糖导电复合纳米材料溶液。

（2）在步骤（1）制得的4个工作电极上分别滴加5μL浓度为10 μg/mL的链霉素抗体、庆大霉素抗体、卡那霉素抗体及壮观霉素抗体，再以6μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白封闭电极上的非特异性活性位点，置于4 ℃下保存备用。

实施例3

改变滴涂铂纳米粒子—磺酸化石墨烯—羧甲基壳聚糖导电复合纳米材料溶液的量为10μL，质量比为2 : 10 : 10，铂纳米粒子和磺酸化石墨烯超声混合20 min，加上羧甲基壳聚糖溶液超声混合20 min，其他与实施例2相同。

实施例4

改变滴涂铂纳米粒子—磺酸化石墨烯—羧甲基壳聚糖导电复合纳米材料溶液的量为6μL，质量比为6 : 14 : 5，铂纳米粒子和磺酸化石墨烯超声混合40min，加上羧甲基壳聚糖溶液超声混合40min，其他与实施例2相同。

实施例5

改变滴涂铂纳米粒子—磺酸化石墨烯—羧甲基壳聚糖电复合纳米材料溶液的量为6μL，质量比为5 : 9 : 8，铂纳米粒子和磺酸化石墨烯超声混合25 min，加上羧甲基聚糖溶液超声混合25 min，其他与实施例2相同。

实施例6

改变滴涂铂纳米粒子—磺酸化石墨烯—羧甲基壳聚糖导电复合纳米材料溶液的量为10μL，质量比为4 : 10 : 6，铂纳米粒子和磺酸化石墨烯超声混合35min，加上羧甲基壳聚糖溶液超声混合35min，其他与实施例2相同。

实施例7

在实施例2 ~ 6制得的4个工作电极上分别滴加四种氨基糖苷类抗生素抗体的量为10μL，浓度为8μg/mL，再以10μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白封闭电极上的非特异性活性位点，置于4 ℃下保存备用，其他与实施例2 ~ 6相同。

实施例8

在实施例2~6制得的4个工作电极上分别滴加四种氨基糖苷类抗生素抗体的量为8μL，浓度为5μg/mL，再以8μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白封闭电极上的非特异性活性位点，置于4 ℃下保存备用，其他与实施例2~ 6相同。

实施例9

样品中四种氨基糖苷类抗生素的含量的检测

本传感器使用时，将引出线端部与多通道电化学工作站检测电路相连接，采用循环伏安分析法进行检测。

（1）配制四种氨基糖苷类抗生素的系列标准溶液，并分别滴涂到实施例2 ~ 8所制备的同时检测四种氨基糖苷类抗生素传感器所对应抗体的4个工作电极表面，于室温下孵化2 h，用pH7.2磷酸盐缓冲溶液清洗干净。

（2）将滴涂标准溶液后晾干的传感器与电化学工作站相连接，向本传感器的圆形凹槽内滴加5 mmol/L铁氰化钾溶液，采用循环伏安分析法，检测电流响应。

(3）根据所得电流响应与四种氨基糖苷类抗生素的标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线，线性范围均为0.010~100ng/mL，对四种氨基糖苷类抗生素的检测限达到2.1 pg/mL以下。

（4）取新鲜牛奶样品，离心后取上清液，分别滴涂到实施例2~8所制备的传感器的工作电极表面，于室温下孵化2h，用pH7.2磷酸盐缓冲溶液清洗干净。

（5）按照步骤（2）所述的检测方法进行检测，根据各工作电极的响应信号与上述得到的工作曲线，即可得出牛奶样品中四种氨基糖苷类抗生素的含量。测定结果表明，牛奶中四种氨基糖苷类抗生素均未检出，属于合格产品；对牛奶样品做标准加入回收实验，7次平行测定结果的相对标准偏差均小于5.0%，加标回收率在94.0% ~ 105%之间，该方法准确可靠。

实施例10

检测水样1中四种氨基糖苷类抗生素的含量，仅改变：室温下孵化3 h，用pH7.4磷酸盐缓冲溶液清洗干净，10 mmol/L铁氰化钾溶液，其他步骤同实施例9。测定结果表明，水样中四种氨基糖苷类抗生素均未检出，属于合格产品；对水样做标准加入回收实验，5次平行测定结果的相对标准偏差均小于4.0%，加标回收率在95.5% ~ 103%之间，该方法准确可靠。

实施例11

检测水样2中四种氨基糖苷类抗生素的含量，仅改变：室温下孵化2.5 h，用pH7.8磷酸盐缓冲溶液清洗干净，8 mmol/L铁氰化钾溶液，其他步骤同实施例9。测定结果表明，水样中四种氨基糖苷类抗生素均未检出，属于合格产品；对水样做标准加入回收实验，5次平行测定结果的相对标准偏差均小于3.0 %，加标回收率在96.8% ~ 102%之间，该方法准确可靠。

Claims

1.一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在一个涂覆一层聚酯薄膜的矩形基片（①）表面上，依次以银浆印刷1个参比电极（②），以导电碳浆印刷5个工作电极（③）、1个对电极（④）、7个电极引出线（⑤）及引出线端部（⑥），并在所有电极及电极引出线端部以外的基片上，以绝缘浆印刷一层绝缘层，并在电极区域形成一个圆形电解池凹槽（⑦），制得五通道丝网印刷电极；

（2）在（1）所述的五通道丝网印刷电极的5个工作电极上，滴涂5 ~ 10μL银纳米粒子—氮掺杂石墨烯—羟丙基壳聚糖构成的导电复合纳米材料溶液；所述导电复合纳米材料溶液，其特征是，将银纳米粒子和氮掺杂石墨烯一定的质量比进行混合超声分散30min，然后加上质量分数1.0%的羟丙基壳聚糖溶液超声混合30min，制成质量比为（1 ~ 5）:（8 ~ 12）:（1~ 10）的银纳米粒子—氮掺杂石墨烯—羟丙基壳聚糖导电复合纳米材料溶液；

（3）在步骤（2）制得的5个工作电极上分别滴加5 ~ 10μL的黄曲霉毒素B1抗体、黄曲霉毒素B2抗体、黄曲霉毒素G1抗体、黄曲霉毒素G2抗体及总黄曲霉毒素抗体，再以10μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白封闭电极上的非特异性活性位点，制得一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器，置于4 ℃下保存备用，所述抗体浓度均5 ~ 10 μg/mL。

2.一种同时检测多种黄曲霉毒素的方法，该方法包括以下步骤：

（1）将黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2及总黄曲霉毒素的标准溶液分别滴涂到权利要求1所述的方法制备的一种同时检测多种黄曲霉毒素传感器对应的工作电极表面上，孵化2 ~ 3 h，然后用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗干净，得到修饰好的工作电极；

（2）将参比电极、步骤（1）所述修饰好的工作电极和对电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入5 mmol/L的铁氰化钾溶液，通过循环伏安法检测所述修饰好的工作电极的电流响应；

（3）根据所得电流响应与黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2（简称4种黄曲霉毒素）及总黄曲霉毒素的标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

（4）用待测样品代替4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的标准溶液，按照所述4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素工作曲线的绘制方法进行检测，其检测结果对照所绘制的4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素工作曲线，计算出样品中4种黄曲霉毒素及总黄曲霉毒素的含量。