CN105651850B - 一种卡那霉素残留的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种基于适体引发的核酸外切酶III(Exo III)循环酶切的卡那霉素残留的检测方法及其应用，属于分析化学技术领域。本发明主要是利用巯基自组装的方式，将与卡那霉素适配体(K‑aptamer)互补的单链DNA(ssDNA)修饰于金电极表面，加入少量K‑aptamer与其配对形成少量双链DNA(dsDNA)。随后加入Exo III，利用可特异性的酶切dsDNA中的ssDNA使得剩余的适配体释放，重新与ssDNA结合形成dsDNA，引发再次酶切，若干循环后使得修饰ssDNA酶切完全。体系存在卡那霉素，通过与适配体的结合抑制循环酶切使ssDNA得以保留，且保留量与卡那霉素的浓度相关。利用电分析方法对ssDNA可静电吸附电信号分子六氨合钌(RuHex)进行定量实现卡那霉素残留的检测。该方法具有较高灵敏度，可实现牛奶中卡那霉素残留的灵敏测定。

Description

一种卡那霉素残留的检测方法

技术领域

本发明是一种基于适体引发的核酸外切酶III(Exo III)循环酶切的卡那霉素的检测方法，特别是牛奶中卡那霉素残留的检测方法，属于分析化学领域。

背景技术

卡那霉素是一种用于治疗革兰阴性菌和革兰阳性菌感染的氨基糖苷类广谱抗生素，是临床上最为常用的抗感染药物之一。和其他的氨基糖苷类抗生素一样，卡那霉素在动物性食品中的残留可能会引起食入者过敏，长期食用卡那霉素残留超标食品还可导致耳和肾毒性等毒副作用。欧共体规定牛奶中的卡那霉素最大残留限量为0.15μg/g(约318.5nM)。因此，需要建立针对卡那霉素检测的有效方法从而加强对产品中抗生素残留的监控，以满足实际生产生活的需要。

核酸适体是通过体外筛选获得的核酸序列，能够与多种目标物质高效、特异地结合。由于上述优势，核酸适体已经成为了抗体的有效替代，广泛的应用于小分子、蛋白质和细胞的检测。伴随着卡那霉素适体(K-aptamer)的发现，基于适体的卡那霉素检测方法得到了发展。核酸外切酶III(Exo III)是一种针对双链DNA的平末端3’端进行切割的核酸酶。通过将K-aptamer和Exo III结合，就可以很方便的实现信号的放大，将其应用于卡那霉素的检测即可实现实际样品中卡那霉素的灵敏检测。

现今检测卡那霉素常见技术主要包括有分光光度法，高效液相色谱法，荧光法，酶联免疫法及电化学法等。与其他分析检测方法相比，电化学方法具有的设备简单，价格低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。

发明内容

本发明的目的是将核酸适体、核酸外切酶的循环酶切及电化学检测技术的优势结合起来，建立一种简单、成本低廉，而又具有极高灵敏度并可方便应用于实际样品卡那霉素残留的检测方法。

本发明的技术方案：本发明是一种基于适体引发的核酸外切酶III(Exo III)循环酶切的卡那霉素残留的检测方法，将金电极表面修饰单链DNA(ssDNA)，加入少量卡那霉素适体(K-aptamer)使之与ssDNA配对结合形成双链DNA(dsDNA)，得到存在少量dsDNA和大量ssDNA的电极修饰界面；加入Exo III，利用Exo III可特异性的酶切dsDNA中ssDNA的特性，导致K-aptamer的释放，而释放的K-aptamer又可以重新和电极表面的ssDNA结合形成dsDNA促使Exo III的再次切割；当体系存在卡那霉素时，卡那霉素与K-aptamer的特异性结合抑制了Exo III的循环酶切，使得电极表面的ssDNA得以保留且保留量与卡那霉素的浓度成正比；利用ssDNA可吸附电信号分子六氨合钌(RuHex)，采用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过测定一系列标准浓度卡那霉素的所得到的RuHex峰值大小绘制标准曲线，即可实现实际牛奶样品中卡那霉素残留的灵敏检测。

方法包括以下步骤：金电极的预处理、ssDNA的修饰、K-aptamer与电极表面ssDNA的互补配对结合、样品孵育、Exo III的循环酶切，卡那霉素残留的电化学表征。

(1)金电极的预处理

用1微米、0.3微米的三氧化二粉末分别对直径为3mm金圆盘电极进行抛光，之后用酒精和超纯水分别超声5分钟。清洗之后将金圆盘电极分别置于水虎鱼(浓硫酸∶H₂O₂的体积比为3∶1)和50％的硝酸溶液中浸泡5分钟和30分钟。之后将处理好的电极置于0.5MH₂SO₄中，在0-1.5V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为0.1V/s，直至达到稳定后，用氮气吹干电极界面。

(2)ssDNA的修饰

用固定溶液(10mM Tris，1mM EDTA，0.1M NaCl，10mM TCEP，pH 7.4)稀释ssDNA至1μM。将(1)中处理好的金电极置于上述100μL溶液中，室温浸泡12h后，随后用超纯水冲洗，以去除金表面未共价结合的核酸分子。紧接着再将电极浸泡在1mM巯基己醇(MCH)溶液1小时，之后再次用超纯水冲洗。

上述ssDNA的序列为：5′-SH-TCG GCT TAG CCT CAA CCC CCA-3′。

(3)K-aptamer与电极表面ssDNA的互补配对结合

用杂交溶液(10mM PBS，0.25M NaCl，pH 7.4)稀释K-aptamer至1nM。将(2)中得到的ssDNA修饰的电极浸泡于上述100μL溶液中，之后90℃加热5分钟，再缓慢冷却至室温，使得ssDNA与K-aptamer充分配对结合。

上述K-aptamer的序列为：5′-TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3′。

(4)样品孵育

用绑定溶液(10mM PBS，0.1M NaCl，5mM MgCl₂，5mM KCl，pH 7.4)稀释卡那霉素至不同的浓度的标准液。将(3)中得到的修饰电极浸泡在上述50μL不同浓度的卡那霉素溶液中37℃孵育10分钟。之后用冲洗溶液(20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，5mM MgCl2，1％Tween-20，pH 7.4)冲洗。

(5)Exo III的循环酶切

将经过(4)处理得到的电极浸泡在50μL含有1U·μL^-1 Exo III(购自NEB)的1×NEB溶液(与Exo III配套，直接稀释后使用即可)中37℃反应1小时。

(6)卡那霉素残留的电化学表征

用冲洗溶液充分冲洗经过(5)处理的电极，之后用含有5μM RuHex的10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)扫描电极。本检测采用的电化学工作站(CHI 660E)，以饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。使用的扫描手段为方波伏安法，电位设置为-0.56V到-0.1V，扫速0.025V/s。卡那霉素的量越多，被保留的ssDNA也就越多，得到的电信号也就越强。通过绘制标准曲线，计算出样品中卡那霉素的浓度。

在1pM to 500pM范围内，电信号随着卡那霉素浓度的升高而增加，电信号与浓度存在线性关系。

本发明的有益效果：①本方法利用K-aptamer对卡那霉素的选择性，结合Exo III的信号放大和电化学检测方法灵敏、方便的优势，实现了牛奶中卡那霉素的检测，灵敏度极高，对牛奶中卡那霉素的快速、灵敏检测具有重要意义；②在方法学上具有普遍借鉴意义，通过改变体系中的适体序列，就可以设计出多种抗生素残留检测的高灵敏度的分析方法。

附图说明

图1为基于适体引发的Exo III循环酶切的卡那霉素残留检测原理图

图2为基于适体引发的Exo III循环酶切的卡那霉素残留检测条件优化图

图3为基于适体引发的Exo III循环酶切的卡那霉素残留检测专一性图

图4为不同浓度卡那霉素存在下，电化学信号与卡那霉素的浓度关系图

具体实施方式

实施例1.基于适体引发的Exo III循环酶切的卡那霉素残留检测条件优化

为了能够更灵敏的检测卡那霉素，我们对检测的条件进行了优化，研究了K-aptamer浓度以及Exo III浓度对卡那霉素检测的影响。

将上述方法步骤(2)中得到的ssDNA修饰的电极，分别与100μL含有0.1nM，0.25nM，0.5nM，0.75nM，1nM，10nM K-aptamer杂交溶液孵育90℃5分钟后，缓慢冷却至室温。再将其浸泡于50μL绑定溶液孵育10分钟，之后用冲洗溶液冲洗。最后将电极浸泡在50μL含有1U·μL^-1Exo III的1×NEB溶液中37℃反应1小时后再次用冲洗溶液清洗后，进行方波伏安法扫描。测得的扫描结果如图2A，2B所示，随着K-aptamer的浓度的增高，酶切效果越明显，电信号越小，因此选择K-aptamer的浓度为1nM进行后续实验。

将上述方法步骤(2)中得到的ssDNA修饰的电极，与100μL含有1nM K-aptamer杂交溶液孵育90℃5分钟后，缓慢冷却至室温。再将其浸泡于50μL绑定溶液孵育10分钟，之后用冲洗溶液冲洗。最后将电极分别浸泡在50μL含有0.01U·μL^-1，0.1U·μL^-1，0.4U·μL^-1，0.7U·μL^-1，1U·μL^-1，1.5U·μL^-1Exo III的1×NEB溶液中37℃反应1小时后再次用冲洗溶液清洗后，进行方波伏安法扫描。测得的扫描结果如图2C，2D所示，随着Exo III的浓度的增高，酶切效果越明显，电信号越小，因此选择Exo III的浓度为1U·μL^-1进行后续实验。

实施例2.基于适体引发的Exo III循环酶切的卡那霉素残留检测专一性图

将上述方法步骤(3)中得到的修饰电极，分别与50μL含有500pM不同种类抗生素的绑定溶液孵育10分钟，之后用冲洗溶液清洗，再将电极分别浸泡在50μL含有1U·μL^-1ExoIII的1×NEB溶液中37℃反应1小时后，再次用冲洗溶液清洗后，进行方波伏安法扫描。测得的扫描结果如图3A，3B所示，该检测方法对卡那霉素有很好的选择性。

实施例3.不同浓度卡那霉素标准溶液电化学信号-浓度标准曲线的测定

将上述方法步骤(3)中得到的修饰电极，分别与50μL不同浓度的卡那霉素标准液孵育10分钟，之后用冲洗溶液清洗，再将电极分别浸泡在50μL含有1U·μL^-1 Exo III的1×NEB溶液中37℃反应1小时后，再次用冲洗溶液清洗后，进行方波伏安法扫描。测得的扫描结果如图4A，4B所示，在卡那霉素浓度为1-500pM的范围内，电化学信号峰值随着卡那霉素浓度的增高而增加，两者符合y＝-2.7163-1.2117×lgx(R²＝0.996)，式中y为电化学信号峰值(μA)，x为卡那霉素的浓度(pM)。

往牛奶中添加标准浓度卡那霉素制备人工污染牛奶的方法获得卡那霉素残留的牛奶样品替代上述不同浓度的卡那霉素标准溶液，实验结果(表1)所示，证明了该体系具有实际的操作性，很好的可信度和重复性。

表1.牛奶样品实测结果

Claims (5)

1.一种基于适体引发的核酸外切酶III(Exo III)循环酶切的卡那霉素残留的检测方法，其特征在于电极表面修饰的单链DNA(ssDNA)与少量卡那霉素适体(K-aptamer)配对结合形成双链DNA(dsDNA)，得到存在少量dsDNA和大量ssDNA的电极修饰界面；加入核酸外切酶III(Exo III)，利用Exo III特异性的酶切dsDNA中ssDNA的特性，使得dsDNA中ssDNA逐渐水解，与此同时促使与之结合的K-aptamer释放，释放的K-aptamer又可以重新和电极表面的ssDNA结合形成dsDNA，促使Exo III循环酶切；当体系存在卡那霉素时，卡那霉素与K-aptamer可特异性结合，这种结合会抑制Exo III的循环酶切，使得电极表面的ssDNA得以保留且保留量与卡那霉素的浓度相关；利用ssDNA可吸附电信号分子六氨合钌(RuHex)，采用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，即可实现卡那霉素残留的灵敏检测。

2.根据权利要求1所述的卡那霉素残留的检测方法，其特征是K-aptamer与ssDNA形成dsDNA后引发的酶切，经预处理的金电极与100μL 1μM ssDNA溶液室温孵育12小时后，再将该电极浸泡于1mM巯基己醇溶液1小时，紧接着再将电极浸泡于100μL 1nM K-aptamer溶液放置于90℃孵育，5分钟后缓慢冷却至室温。

3.根据权利要求1所述的卡那霉素残留的检测方法，其特征是卡那霉素和K-aptamer的结合抑制了Exo III的循环酶切，权利要求2中修饰的金电极与50μL用10mM PBS，0.1MNaCl，5mM MgCl₂，5mM KCl的绑定溶液，溶液pH值为7.4，稀释成不同浓度的卡那霉素溶液37℃孵育10分钟后，用含20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，5mM MgCl₂，1％Tween-20的冲洗溶液冲洗，溶液pH值为7.4。

4.根据权利要求1所述的卡那霉素残留的检测方法，其特征是Exo III特异的酶切dsDNA中ssDNA促使K-aptamer的释放，释放的K-aptamer再次与电极界面的ssDNA配对结合形成dsDNA引发的Exo III循环酶切，经过权利要求3处理的电极与50μL含有1U·μL^-1ExoIII的1×NEB溶液37℃孵育1小时。

5.根据权利要求1所述的卡那霉素残留的检测方法，其特征是利用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，即可实现卡那霉素残留的灵敏检测，经过权利要求4处理的电极直接置于5mL含5μM RuHex的10mM Tris-HCl缓冲溶液中扫描检测，溶液的pH为7.4，扫描液中RuHex的浓度为5μM，不同于常用的50μM的浓度，用5μM浓度扫描RuHex只会出现一个特征峰，更适用于电分析定量实验，扫描方法为方波伏安法，电位设置为-0.56V到-0.1V，频率60Hz，电位增量0.004V，振幅0.025V。