CN108760853A - 一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

基于有序介孔碳‑壳聚糖（OMC‑CS）和金纳米颗粒‑链霉亲和素（AuNPs‑SA）的超灵敏电化学传感器，检测卡那霉素（KAN）。AuNPs‑SA利用生物素‑链霉亲和素作用固定DNA链（生物素标记），当与KAN结合时，含有KAN适配体的DNA2链用二茂铁标记以增加电极表面上的电流信号。对影响适配体传感器性能的一些因素进行了优化，所提出的适配体传感器在1×10‑10‑4×10‑6 M的范围内具有较宽的线性，KAN的检测限低至47.2 pM，这种适配体传感器具有良好的稳定性，灵敏度和重复性等电化学性能，并且在不受竞争性类似物干扰的情况下也显示出良好的特异性，此外，构建的适配体传感器已成功用于检测实际乳样品中的KAN，该方法可有很大的潜力用于检测更多的其他抗生素。

Description

一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法
技术领域
本发明提供一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，属于生物传感器技术领域。
背景技术
卡那霉素（KAN）是从链霉菌纯化得到的一种抗生素，广泛用于治疗人类和动物的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染，食物中KAN的残留会引起严重如肾毒性、耳毒性和抗生素耐药性的副作用，为确保食品安全和质量，欧盟已确定KAN的最大残留限量为150μg/kg（257.4 nM），因此，对于检测牛奶中的KAN是确保我们健康所必需的。
最近，许多分析方法由于灵敏已用于检测KAN，如气相色谱，毛细管电泳（CE），高效液相色谱（HPLC），固相萃取（SPE），免疫分析，酶（ELISA）和胶体金试纸条，但由于周转时间长，设备昂贵，样品前处理繁琐等原因，上述大部分方法的应用仍受到部分限制，选择敏感和特异分析检测KAN的新方法仍然是必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及敏感而简单检测牛奶中KAN残留的适配体传感器制备方法。
其技术方案为：适配体是通过体外筛选获得的人造单链DNA或RNA分子，其能以高亲和力与选择性结合靶分子，由于稳定性好，毒性低，易于生物传感器设计合成和改造等优点，适配体已经引起了巨大的兴趣，鉴于适配体的显著优点，已经提出了许多基于比色，电化学，荧光，化学发光和悬臂阵列的电化学适配体传感器应用在临床诊断和食品安全领域检测中。
所述的一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：为了提高电化学生物传感器的分析性能，已经将各种纳米材料用于制造生物传感器，有序介孔碳（OMC）纳米材料由于比表面积大，导电性好和生物相容性好而备受关注，此外，OMC可以为生物分子如DNA，酶和蛋白质提供优良的微环境，其高密度边缘位置为电子传输提供了许多有利的位置，然而，OMC的成膜性差，需要额外的材料如壳聚糖（CS）以帮助形成膜，CS由于其廉价，无毒，抗菌，生物相容性和生物降解性等优点被广泛用作固定基质；金纳米粒子（AuNPs）由于其包括易于合成，高电导率和容易控制电极微环境等独特性质，也广泛用于构建适配体传感器，金纳米粒子用链霉亲和素标记可以高亲和力结合生物素并具有高电导率，链霉亲和素对生物素具有很高的亲和力（亲和常数高达1015 mol/L），由于这种亲和力，链霉亲和素-生物素反应方法已经被广泛使用，适配体通常用生物素标记，然后高亲和力结合到已经吸附到电极上的链霉亲和素上，以将适配体固定在电极上。
所述的一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：设计了一种基于有序介孔碳-壳聚糖（OMC-CS），金纳米粒子-链霉亲和素（AuNPs-SA）和适配体互补链的新型电化学传感器用于选择性KAN的灵敏检测，OMC-CS和AuNPs-SA纳米复合材料构建了一个强大的电子传导通路，所提出的适配体传感器在较宽的线性范围内具有较低的检测限，并成功应用于牛奶样品中。
其制备原理为：用生物素标记的DNA1链通过链霉亲和素-生物素的高亲和力与链霉亲和素标记的金纳米颗粒结合，含有KAN适配体的二茂铁标记的DNA2链特异性结合KAN和DNA1，二茂铁固定在电极表面，二茂铁的电化学电流信号会随着KAN浓度的增加而增加，在这里，功能性金属纳米粒子在提供信号和识别目标方面起到双重作用，这使得检测方法步骤简单且高度敏感。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：所述的一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：CS溶于2.0 M乙酸溶液中，磁力搅拌8h以上，得到0.2％CS溶液（4ml，w/v），用NaOH溶液将pH调节至5.0，向上述溶液中加入2mg OMC，超声处理1h直至溶液达到均相稳定状态，成功得到高度分散的OMC-CS悬浮液。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：所述的一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：CV和DPV的电化学信号均在电解质溶液（0.1MKCl，5mM [Fe(CN)6]4-/3-)中测量，扫描电位分别为-0.6 V - +0.1 V和0.0 V - +0.4 V。
所述适配体传感器的制备工艺如下：图1为适配体传感器的制备过程。首先用0.05μm的氧化铝粉抛光裸露的玻碳电极（GCE），然后在乙醇，硝酸和双蒸水中进行超声波清洗，将电极置于0.5M H2SO4溶液中循环扫描进行活化（-0.1 V - +1.0 V），将7μL CS-OMC悬浮液滴在电极表面上，电极干燥后，加入7μL SA-AuNPs到其表面上，接下来，干燥的修饰电极在Bio-DNA1溶液中温育0.5小时，然后将电极浸入0.5％BSA中以封闭非特异性位点，最后，将Fc-DNA2和KAN的混合物溶液滴在电极上并用PBS冲洗除去未结合的DNA。
附图说明
图1为适配体传感器的构建过程。
图2为纳米材料的电镜表征。
图3为适配体组装过程的CV图。
图4为试验条件的单因素优化。
图5为试验条件的实验因素水平编码表。
图6为试验条件的的实验安排与结果。
图7为试验条件的参数优化正交实验的响应曲面。
图8（a）对不同浓度卡那霉素的DPV反应（1×10-10-1×10-6 M）；（b）卡那霉素的标准曲线。
图9为传感器的特异性（KAN：卡那霉素，TOB：妥布霉素，GEN：庆大霉素，OTT：土霉素，NEO：新霉素，STR：链霉素，TET：四环素）。
图10为实际样品处理的实验因素水平编码表。
图11为实际样品处理的实验安排与结果。
图12为实际样品处理的样品处理条件正交实验响应曲面。
图13为牛奶样品中KAN的回收率。
具体实施方式
实施例：如图2所示，用SEM和TEM分别对OMC-CS和SA-AuNPs复合材料的形貌进行了表征，图2（a）显示OMC-CS由大量均匀有序分布的棒状颗粒组成，这使OMC-CS具有高孔隙率和高表面积，为适配体提供更好的保护性微环境；SA-AuNPs的SEM图（图2（b））显示在链霉亲和素分子存在的情况下AuNPs颗粒彼此分离；如图2（c）所示，AuNPs颗粒成功地用链霉素标记；当添加生物素时，在链霉亲和素和生物素基团之间的高亲和力相互作用下AuNPs颗粒聚集（图2（d））。
实施例：使用CV表征适配体传感器的构建过程（图3），由于探针（[Fe(CN)6]4-/3-）的氧化还原反应，裸露的GCE的CV显示出一对良好的对称的氧化还原峰（曲线a）；由于OMC-CS的高电导率，随着OMC-CS的添加，峰值电流显著增加（曲线b）；由于SA-AuNPs复合材料也具有优异的导电性能，加入SA-AuNPs复合材料后，SA-AuNPs/OMC-CS/GCE的峰值电流显示出更高的电流（曲线c）；结果表明，OMC-CS和SA-AuNPs复合材料可为该传感器提供有效的电子传输能力；由于寡核苷酸的非导电能力，当Bio-DNA1固定在SA-AuNPs/OMC-CS/GCE表面时，峰电流显著降低（曲线d）；接着将电极放入BSA中浸泡，由于BSA作为分离层成功地阻断了非特异性位点的吸附，所以电流进一步降低（曲线e）；最后，当加入KAN和Fc-DNA2时电流增加（曲线f），由于互补探针（DNA2）被Fc标记，当Fc-DNA与DNA1杂交形成双链体时，Fc可以接近电极表面以交换电子并产生高电流。
实施例：为了获得满意的检测效果，对DNA1浓度，DNA2浓度，工作溶液的pH值和培养时间等因素的影响进行了调查和优化（图4），如图4（a-b）所示，选择不同浓度的DNA1和DNA2以探讨适配体浓度对电流信号的影响，正如预期的那样，电流差值（ΔI）随着DNA1（DNA2）浓度的增加而增加，ΔI在20μM时达到最大值，因此，20μM是用于制备传感器的DNA1和DNA2的最佳浓度；使用不同的pH电解质溶液（6.0-7.8）研究了pH对适配体传感器响应的影响，ΔI先增大后减小，在pH为7.5时ΔI达到最大值（图4（c）），因此，选择电解质溶液的pH值为7.5；为达到快速检测的目的，对制备过程中的孵育时间进行了调查，将一系列BSA/Bio-DNA1/SA-AuNPs/OMC-CS/GCE分别温育60，80，100，110，120，130，140和160min，如图4（d）所示，由于KAN结合的活性位点已经达到饱和，所以ΔI随时间增加，直到120min后变得稳定，因此，选择最佳的孵育时间为120min。
实施例：为了解四种试验条件之间的相互作用对适配体传感器检测结果的影响，结合单因素试验的结果，设计了二次正交旋转试验来优化试验条件，编码的自变量（X1，X2，X3，X4）和变量（X1=抑制时间/min，X2=底部的pH值，X3=DNA1/μM浓度，X4=DNA2/μM浓度）水平见图5，测试和响应结果的排列如图6所示，测试结果的响应面如图7所示，随着pH值的增加，响应电流先上升后下降，最大ΔI出现在pH值为7.5，随着DNA1浓度和DNA2浓度的增加，响应的ΔI也增加，趋于稳定，直至浓度为20μM，这可能是由于有限的电极面积导致DNA的过量累积从而阻碍了电极表面的电子转移，当DNA1的孵育时间超过120min时，ΔI略有下降，但基本趋势基本稳定，与单一控制条件相比，测试结果没有改变。
实施例：为研究制备的适配体传感器的分析能力，在最佳条件下，测试了一系列浓度的KAN标准溶液的DPV（图8），KAN可以以较高的亲和力与适配体结合，并且DNA1和Fc-DNA2的部分链互补配对，随着KAN和Fc-DNA2浓度的增加，Fc暴露的表面积增加。因此，DPV中的峰电流随着KAN浓度的增加而逐渐增加（图8（a））；KAN在100 pM-1μM的范围内得到y=8.6092+8.2836x的线性方程，相关系数为0.9917（图8（b）），检测限为47.2 pM（S/N=3），远远低于欧盟定义的牛奶中KAN最大污染水平（257.4 nM）。
实施例：选择性是评价生物传感器性能的重要因素之一，用适配体传感器测定含有10μM其他抗生素（链霉素（STR），庆大霉素（GEN），新霉素（NEO），妥布霉素（TOB）和土霉素（OTT））的100nM KAN溶液，结果如图9所示，这些干扰物存在的变化小于4％，表明适配体传感器对KAN具有良好的特异性，对其他抗生素具有抗干扰性。
实施例：重现性是评价适配体传感器的另一个重要因素，以相同的方式准备五个适配体传感器用于检测KAN以分析重现性，计算的相对标准偏差（RSD）为3.54％，表明该适配体传感器具有良好的重现性。
实施例：制备5个电极，保存4℃下4周后检测相同浓度KAN以检测适配体传感器的稳定性，结果仅下降5.72％，表明适配体传感器具有良好的稳定性，这可能是由于DNA适配体的稳定性和链霉亲和素与生物素之间的高度亲和力。
实施例：为了评估适配体传感器的可再生性，将已经检测KAN的适配体传感器浸入甘氨酸-盐酸（0.2M，pH2.0）中1min以打破适配体-KAN的键合，适配器检测KAN后，再次浸入甘氨酸-盐酸中，5次再生周期后，适配体传感器的电流响应保留了原始响应值的87.69％（RSD=4.25％），说明适配体传感器具有良好的再生性。
实施例：为了研究在实际样品中制备的适配体传感器的适用性和精密度，在含有多种干扰物质的实际样品（牛奶）中通过加标法检测不同浓度的KAN，并计算其回收率，将牛奶样品离心以除去脂肪等干扰物质，通过二次正交旋转实验优化离心条件，图10显示了实验因素的水平，图11显示了实验安排和结果，图12显示了离心条件下的响应面，最佳离心速度为10000 r/min，最佳离心时间和静置时间均为10min，不含KAN的牛奶首先用PBS（pH7.5）稀释，然后离心10min（10000 r/min），静置10min，收集乳汁上清液，经0.22μm无菌微孔膜过滤，加入KAN标准溶液制备不同浓度的KAN样品溶液，适配体传感器被用来分析记录的响应信号，如图13所示，回收率在97.2％-104.50％范围内，相对标准偏差小于5.4％，因此，即使在牛奶等复杂的生物环境中，所提出的适配体传感器也能够高选择性和可靠地识别目标。
在这项工作中，基于OMC-CS和AuNPs-SA的KAN定量检测适配体传感器已经成功制备，OMC-CS和AuNPs-SA纳米复合物不仅极大地提高了适配体等生物分子的固定量，而且显著提高了适配体传感器的电流信号，设计的适配体传感器检测限低（47.2 pM），线性响应范围宽（1×10-10-1×10-6 M），所提出的适配体传感器显示良好的重复性，特异性和稳定性，适配体传感器已经成功地应用于复杂实际牛奶样品中的KAN高灵敏度检测（97.2％-104.50％），预期开发的基于OMC-CS和AuNPs-SA的适配体传感器可进一步扩展到简单实时检测其他抗生素。

Claims (3)

1.一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：构建了基于有序介孔碳-壳聚糖（OMC-CS）和金纳米-链霉亲和素（AuNPs-SA）的超灵敏电化学传感器，检测卡那霉素（KAN）。
2.如权利要求1所述的一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：AuNPs-SA利用生物素-链霉亲和素作用固定DNA链（生物素标记），当与KAN结合时，含有KAN适配体的DNA2链用二茂铁标记以增加电极表面上的电流信号。
3.如权利要求1所述的一种检测牛奶中卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：对影响适配体传感器性能的一些因素进行了优化，所提出的适配体传感器在较宽的范围内（1×10-10-4×10-6 M）具有线性关系，KAN的检测限低至47.2 pM，这种适配体传感器具有具有良好的稳定性，灵敏度和重复性等电化学性能，并且在不受竞争性类似物干扰的情况下也显示出良好的特异性，此外，构建的适配体传感器已成功用于检测实际乳样品中的KAN，该方法有很大的潜力用于检测更多的其他抗生素。
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