CN109870497B - 一种检测黄曲霉毒素b1电化学适配体传感器的制备方法 - Google Patents
一种检测黄曲霉毒素b1电化学适配体传感器的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明创造提供了一种检测黄曲霉毒素B1电化学适配体传感器的制备方法,包括如下步骤,1)对工作电极滴加介孔碳;2)恒电位沉积金纳米粒子对CMK/GCE进行修饰;3)滴加一端修饰有巯基的AFB1适配体于AuNPs/CMK/GCE电极上;4)将Apt/AuNPs/CMK/GCE浸入亚甲基蓝(MB)溶液中,将MB吸附于适配体链上得MB‑Apt/AuNPs/CMK/GCE电极;5)检测还原峰电流值。本发明创造所述的检测黄曲霉毒素B1电化学适配体传感器可以达到对目标物定量检测的目的,快速和操作简单的特点克服了大型检测仪器操作复杂,检测周期长的弊端。
Description
技术领域
本发明属于光电材料以及光电化学检测领域,尤其是涉及一种检测黄曲霉毒素B1电化学适配体传感器的制备方法。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin)是一种致癌性真菌毒素,黄曲霉毒素具有不同的具体结构和毒性差异,其中以AFB1的毒性和致癌性最强,被国际癌症研究组织确定为I类致癌物。当进入动物体后会表现出强烈的亲肝性,引起肝脏出血、脂肪变性、胆管增生并导致肝癌发生,除此之外还会引起肠胃前段炎症病变、造血功能和血液成分的变化以及免疫功能的损害等其他系统的病变。
电化学传感器是一种小型便携的分析装置,由分子识别元件和电化学换能器组成,目标物经过分子识别后可转化为可以测量的电化学反应信号,是现代传感器的重要组成部分。由于其检测速度快,灵敏度高,成本低等优势,在生物医药、环境检测、食品加工等方面有着重要的应用价值。
适配体是通过指数富集系统进化技术(SELEX)体外筛选得到的一类能够特异性地结合小分子物质、蛋白乃至整个细胞的寡聚核苷酸序列。适配体具有制备简便、易于修饰、亲和力强、稳定性好等特点,作为识别分子应用于传感器的构建增加了检测结果的准确性。
纳米材料又称超微颗粒材料,是指颗粒度为纳米数量级,处于原子簇和宏观物体交接区域内的粒子,颗粒直径一般在1-100nm之间,在光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的都显示出特异的性质。纳米材料在医学、家电、电子、纺织工业等方面具有广泛的应用,而在电极修饰方面更是展现了许多优良的性质,如促进电子传递、高催化活性以及提高分析的灵敏度和选择性等。导电的纳米粒子单层或多层膜具有较大的比表面积,从而成为一类特殊效应的传感材料。纳米粒子修饰电极在应用中的重要特点就是基于纳米粒子的高比表面积所导致的对传感信号放大的功能,从日线是出更高的电催化活性。
有序介孔碳(OMC)是最近发现的一类新型的介孔材料,1999年合成方法首次被Ryoo等人报道。由于介孔碳具有较高的比表面积、有序的孔径分布,同时具有较高的机械强度、较强的吸附能力,可应用于催化、储氢、吸附等领域。有序介孔碳的酸碱稳定性良好,合成方法简单,很容易制得,有序介孔碳本身是很好的良导体,具有较好的导电性,被越来越多的应用于研究物质的电化学行为。
目前检测黄曲霉毒素的方法主要包括:薄层分析法(TLC)、液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、毛细管电泳法(CE)、荧光光度法(IA C/S FB)、金标试纸法和生物传感器法。其中生物传感器是使用固定化技术将具有分子识别能力的生物活性物质与物理化学换能器结合,可以用来探测生物体内外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置。其中利用分子间特异亲和性制备的亲和型生物传感器为免疫传感器口。根据能量转换器所传导的物理或化学信号的不同,免疫传感器又可分为电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电晶体免疫传感器等。由于生物传感器具有选择性高、响应快、操作简单、携带方便和适合于现场检测等优点,因此各国科研工作者正积极探索研制新型生物传感器用于检测黄曲霉素。但目前还没有将适配体与传感器结合用于检测黄曲霉毒素B1的方法。
发明内容
有鉴于此,本发明创造结合了适配体的优良特异性、稳定性的特点以及电化学传感器检测快速、操作简单的特点,通过对工作电极表面滴加介孔碳和沉积金纳米粒子来提高传感器的灵敏度。旨在实现对AFB1微量检测的目的。
原理:将介孔碳修饰在工作电极表面一方面增加了电信号提高工作电极灵敏度,另一方面介孔碳材料的立体多分枝结构增加了工作电极的表面积。在修饰有介孔碳的工作电极上恒电位沉积金纳米粒子一方面改变了工作电极的表面性质另一方面为巯基化的适配体的连接成为可能。通过化学键的作用将AFB1的适配体固定在AuNPs/CMK/GCE工作电极表面后将Apt/AuNPs/CMK/GCE浸泡于MB溶液中,MB与适配体靠弱的吸附作用连接,当滴加不同浓度的目标物后目标物与适配体特异性结合竞争性去除吸附在适配体链上的MB,导致电信号的变化,从而达到对目标物的定量、灵敏检测。
为达到上述目的,本发明创造的技术方案是这样实现的:
一种检测黄曲霉毒素B1电化学适配体传感器的制备方法,所述传感器包含有工作电极、参比电极和对电极,所述工作电极为玻碳电极,参比电极为饱和氯化钾甘汞电极,对电极为铂柱电极,包括如下步骤:
1)对工作电极修饰介孔碳:取适量介孔碳溶解在N,N-二甲基甲酰胺水溶液中,超声得到均匀分散的介孔碳悬浮液,将介孔碳修饰在工作电极表面来增大工作电极的表面积;
2)金纳米粒子的修饰:将步骤1)修饰好的工作电极浸入HAuCl4和H2SO4混合溶液中恒电位沉积,以改变工作电极的表面性能;
3)连接AFB1适配体:将一端修饰有巯基的AFB1适配体作为识别原件滴加于步骤2)修饰好的工作电极上;
4)亚甲基蓝的引入:步骤3)得到的连接AFB1适配体的工作电极浸入亚甲基蓝溶液中,亚甲基蓝吸附于适配体链上;
5)检测还原峰电流值:AFB1与工作电极上适配体的结合,将不同浓AFB1滴加在步骤4)修饰好的工作电极;差分脉冲伏安法检测,经孵育后在磷酸盐缓冲液中用差分脉冲伏安法测定还原峰电流值,根据产生电流情况来分析与AFB1浓度之间的关系。
优选的,对工作电极修饰介孔碳具体方法为:
取1mg介孔碳溶解在2ml N,N-二甲基甲酰胺水溶液中(v:v,1:1),超声30min得到均匀分散的浓度为0.5mg mL-1的介孔碳悬浮液,取介孔碳悬浮液2-14μL滴加到预处理好的洁净工作电极上,自然晾干,得到介孔碳修饰的CMK/GCE工作电极。
优选的,金纳米粒子的修饰具体方法为:
将获得的CMK/GCE工作电极浸没于5mL含有HAuCl4和H2SO4的混合溶液中,所述HAuCl4和H2SO4的混合溶液中,HAuCl4浓度为2.5mmol/L,H2SO4浓度为0.5mol/L;铂柱电极作为对电极,饱和氯化钾甘汞电极作为参比电极,采用恒电位技术进行金纳米粒子的恒电位沉积,设定恒定电位为-0.2V,采样间隔为0.5s,沉积结束后取出工作电极用超纯水仔细冲洗,氮气吹干,得到AuNPs/CMK/GCE工作电极;
优选的,连接AFB1适配体具体方法为:
5’端修饰有巯基的AFB1适配体用TE缓冲溶液配制成适配体稀释液,所配适配体稀释液pH值为8.0;取10μL适配体稀释液滴加在AuNPs/CMK/GCE工作电极表面并孵育过夜,取10μL巯基己醇MCH滴加在工作电极表面孵育,以封闭工作电极表面未与适配体连接的金纳米粒子的空余位点,得到Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极。TE缓冲液是由Tris-HCl和EDTA配制而成,主要用于溶解核酸,能稳定储存DNA和RNA。TE缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。TE缓冲液是由Tris和EDTA配制而成,主要用于溶解核酸,能稳定储存DNA和RNA,一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。
优选的,亚甲基蓝的引入具体方法为:
将Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极浸泡在MB溶液中10min,使MB通过静电作用和嵌入作用连接到适配体上,取出工作电极后用PBS仔细冲洗以去除未嵌入的MB,得到MB-Apt/AuNPs/CMK/GCE氮气吹干备用。
优选的,检测还原峰电流值具体步骤为:
(1)AFB1与工作电极上适配体的结合:取10μL不同浓度的AFB1标准液滴加在MB-Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极上,孵育后用PBS仔细冲洗以去除工作电极表面未结合的AFB1,用氮气吹干,形成待检测工作电极;
(2)差分脉冲伏安法检测:待检测工作电极浸入pH为7.4的PBS中,以饱和氯化钾甘汞电极为参比电极,以铂柱电极为对电极,在一定的电位范围下进行差分脉冲伏安法扫描。用电流值为纵坐标,以AFB1lg(C)μg/L为横坐标建立两者之间的关系。差分脉冲的响应值与AFB1的浓度在75μg/L-100ng/L的范围内呈线性关系,斜率为-5.85472,相关系数R2为0.99046,最低检出限为36ng/L。
MB作为电化学指示剂可以通过吸附作用和镶嵌作用连接在适配体探针上,它在PBS溶液中进行差分脉冲扫描时在-0.2V电压下可以产生一个较强的电化学信号。适配体与AFB1之间特异性结合,竞争性的去除掉靠吸附作用连接在适配体探针上的MB,在PBS中检测时产生一个相对较小的电化学信号,在一定的浓度范围内电信号随AFB1添加量的增多而减小,以此来对AFB1进行定量检测。
按照本发明方法制得的传感器用于AFB1的检测。
相对于现有技术,本发明创造所述的制备方法具有以下优势:
(1)本发明创造所述的工作电极表面修饰方法中介孔碳在增加电信号提高工作电极灵敏度的同时为下一步恒电位沉积金纳米粒子提供了更大的工作电极表面积。依靠电沉积的方法将金纳米粒子沉积在工作电极表面确保不同工作电极之间均一的状态,提高电极的稳定性。将介孔碳与金纳米粒子结合也为适配体连接提供了多的结合位点。
(2)本发明创造所述的一种用于检测AFB1的电化学适配体传感器构建过程简单、可控、重现性好,对目标物AFB1的检测稳定性好、灵敏度高、检出限低。
(3)本发明所述的电化学分析方法使检测时间缩短至3min。
(4)在修饰方法上,我们选择了介孔碳和恒电位沉积金用来进行电极修饰,修饰过程相对简单,操作也不复杂,并且不具毒性;采用恒电位沉积金的方式还可以降低实验成本。
附图说明
构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解,本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造,并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中:
图1为本发明创造实施例所述的本AFB1浓度与相应差分脉冲电流值的关系图。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
一种检测黄曲霉毒素B1电化学适配体传感器的制备方法,所述传感器包含有工作电极、参比电极和对电极,所述工作电极为玻碳电极,参比电极为饱和氯化钾甘汞电极,对电极为铂柱电极,包括如下步骤:
1)对工作电极修饰介孔碳:取适量介孔碳溶解在N,N-二甲基甲酰胺水溶液中,超声得到均匀分散的介孔碳悬浮液,将介孔碳修饰在工作电极表面来增大工作电极的表面积;
2)金纳米粒子的修饰:将步骤1)修饰好的工作电极浸入HAuCl4和H2SO4混合溶液中恒电位沉积,以改变工作电极的表面性能;
3)连接AFB1适配体:将一端修饰有巯基的AFB1适配体作为识别原件滴加于步骤2)修饰好的工作电极上;
4)亚甲基蓝的引入:步骤3)得到的连接AFB1适配体的工作电极浸入亚甲基蓝溶液中,亚甲基蓝吸附于适配体链上;
5)检测还原峰电流值:AFB1与工作电极上适配体的结合,将不同浓AFB1滴加在步骤4)修饰好的工作电极;差分脉冲伏安法检测,经孵育后在磷酸盐缓冲液中用差分脉冲伏安法测定还原峰电流值,根据产生电流情况来分析与AFB1浓度之间的关系。
实施例2
一种检测黄曲霉毒素B1电化学适配体传感器的制备方法,所述传感器包含有工作电极、参比电极和对电极,所述工作电极为玻碳电极,参比电极为饱和氯化钾甘汞电极,对电极为铂柱电极,包括如下步骤:
1)对工作电极修饰介孔碳:将介孔碳修饰在工作电极表面来增大工作电极的表面积;具体步骤为:
取1mg介孔碳溶解在2ml N,N-二甲基甲酰胺水溶液中(v:v,1:1),超声30min得到均匀分散的浓度为0.5mg mL-1的介孔碳悬浮液,取介孔碳悬浮液2-14μL滴加到预处理好的洁净工作电极上,自然晾干,得到介孔碳修饰的CMK/GCE工作电极。
2)金纳米粒子的修饰:将CMK/GCE工作电极浸入HAuCl4和H2SO4混合溶液中恒电位沉积,以改变工作电极的表面性能;具体步骤为:
将获得的CMK/GCE工作电极浸没于5mL含有HAuCl4和H2SO4溶液中,所述HAuCl4和H2SO4的混合溶液中,HAuCl4浓度为2.5mmol/L,H2SO4浓度为0.5mol/L。铂柱电极作为对电极,饱和氯化钾甘汞电极作为参比电极,采用恒电位技术进行金纳米粒子的恒电位沉积,设定恒定电位为-0.2V,采样间隔为0.5s,在60-360s的时间区间内优化沉积时间,沉积结束后取出工作电极用超纯水仔细冲洗,氮气吹干,得到AuNPs/CMK/GCE工作电极;
3)连接AFB1适配体:将一端修饰有巯基的AFB1适配体作为识别原件滴加AuNPs/CMK/GCE工作电极上;具体步骤为:
将5’端修饰有巯基的AFB1适配体用TE缓冲溶液(Tris-HCl和EDTA配制而成)配制成适配体稀释液,适配体稀释液pH值为8.0;取10μL适配体稀释液滴加AuNPs/CMK/GCE的工作电极表面并孵育过夜,在0.1-10μmol/L的范围内优化滴加浓度;取10μL MCH滴加在工作电极表面孵育,以封闭工作电极表面未与适配体连接的金纳米粒子的空余位点,得到Apt/AuNPs/CMK/GCE;
4)亚甲基蓝(MB)的引入:将Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极浸入MB溶液中,MB吸附于适配体链上;具体步骤为:
将Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极浸泡在MB溶液中10min,使MB通过静电作用和嵌入作用连接到适配体上,取出工作电极后用磷酸盐缓冲液(PBS)仔细冲洗以去除未嵌入的MB,得到MB-Apt/AuNPs/CMK/GCE氮气吹干备用。
5)检测还原峰电流值:将不同浓AFB1滴加在MB-Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极,经孵育后在PBS中用差分脉冲伏安法测定还原峰电流值,根据产生电流情况来分析与AFB1浓度之间的关系;具体步骤为:
(1)AFB1与工作电极上适配体的结合:取10μL不同浓度的AFB1标准液滴加在MB-Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极上,孵育后用PBS仔细冲洗以去除工作电极表面未结合的AFB1,在10-60min的时间区间内优化孵育时间,用氮气吹干,形成待检测工作电极;
(2)差分脉冲伏安法检测:待检测工作电极浸入pH为7.4的PBS中,以饱和氯化钾甘汞电极为参比电极,以铂柱电极为对电极,在+0.2~-0.5v的电位范围下进行差分脉冲伏安法扫描。
实施例2制备的传感器用于检测
一种检测黄曲霉毒素B1电化学适配体传感器的制备方法,所述传感器包含有工作电极、参比电极和对电极,所述工作电极为玻碳电极,参比电极为饱和氯化钾甘汞电极,对电极为铂柱电极,其特征在于:包括如下步骤:
1)对AFB1标准液的检测:使用最终修饰好的工作电极对标准溶液中的AFB1进行检测;具体步骤为:
将修饰好的工作电极表面滴加不同浓度的AFB1标准溶液,经过孵育后在+0.2~-0.5v的电压范围下在PBS中进行差分脉冲伏安检测,以AFB1lg(C)μg/L为横坐标建立两者之间的关系。电化学检测过程在几分钟内便可完成,差分脉冲的响应值与AFB1的浓度在75μg/L-100ng/L的范围内呈线性关系。建立的标准曲线如图1所示。
2)对实际样品中AFB1的检测:使用最终修饰好的工作电极对大米、玉米、糯米三种不同实际样品中的AFB1进行检测;具体步骤为:
利用本发明的电化学适配体传感器对实际样品(大米、糯米、玉米)采用AFB1标准加入法进行加标回收实验。实际检测过程选用了LK2006型电化学工作站系统中的差分脉冲法进行检测,电压范围选择+0.2~-0.5v,平行测定三次,读取电流响应值。最终得到构建的传感器对实际样品中AFB1的回收率在92.3-103.6%范围之间,说明利用本发明的制备方法得到的适配体传感器具有很高的准确度和实际应用价值。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已,并不用以限制本发明创造,凡在本发明创造的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种基于电化学适配体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法,所述传感器包含有工作电极、参比电极和对电极,所述工作电极为玻碳电极,参比电极为饱和氯化钾甘汞电极,对电极为铂柱电极,其特征在于:所述方法包括:
1)对工作电极修饰介孔碳:取适量介孔碳溶解在N,N-二甲基甲酰胺水溶液中,超声得到均匀分散的介孔碳悬浮液,将介孔碳修饰在工作电极表面来增大工作电极的表面积;具体方法为:取1 mg 介孔碳溶解在2 ml N,N-二甲基甲酰胺水溶液中,超声30 min得到均匀分散的浓度为0.5 mg /mL的介孔碳悬浮液,取介孔碳悬浮液2-14μL滴加到预处理好的洁净工作电极上,自然晾干,得到介孔碳修饰的CMK/GCE工作电极;所述N,N-二甲基甲酰胺水溶液是用N,N-二甲基甲酰胺和水按照体积比1:1配制而成;
2)金纳米粒子的修饰:将步骤1)修饰好的工作电极浸入HAuCl4和H2SO4混合溶液中恒电位沉积,以改变工作电极的表面性能;具体方法为:将获得的CMK/GCE工作电极浸没于5 mLHAuCl4和H2SO4的混合溶液中,铂柱电极作为对电极,饱和氯化钾甘汞电极作为参比电极,采用恒电位技术进行金纳米粒子的恒电位沉积,设定恒定电位为 -0.2 V,采样间隔为0.5 s,沉积结束后取出工作电极用超纯水仔细冲洗,氮气吹干,在介孔碳修饰的基础上得到金纳米粒子修饰的AuNPs/CMK/GCE工作电极;
3)连接AFB1适配体:将一端修饰有巯基的AFB1适配体作为识别原件滴加于步骤2)修饰好的工作电极上; 具体方法为:5’端修饰有巯基的AFB1适配体用TE缓冲溶液配制成适配体稀释液,所配适配体稀释液pH值为8.0;取10μL 适配体稀释液滴加在AuNPs/CMK/GCE工作电极表面并孵育过夜,取10μL巯基己醇 MCH滴加在工作电极表面孵育,以封闭工作电极表面未与适配体连接的金纳米粒子的空余位点,得到Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极;
4)亚甲基蓝的引入:步骤3)得到的连接AFB1适配体的工作电极浸入亚甲基蓝溶液中,亚甲基蓝吸附于适配体链上;具体方法为:将Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极浸泡在MB溶液中10min,使MB通过静电作用和嵌入作用连接到适配体上,取出工作电极后用PBS 仔细冲洗以去除未嵌入的MB,得到MB-Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极,氮气吹干备用;
5)检测还原峰电流值:AFB1与工作电极上适配体的结合,将不同浓度的AFB1滴加在步骤4)修饰好的工作电极;差分脉冲伏安法检测,经孵育后在磷酸盐缓冲液中用差分脉冲伏安法测定还原峰电流值,根据产生电流情况来分析与AFB1浓度之间的关系;具体步骤为:(1)AFB1与工作电极上适配体的结合:取10μL 不同浓度的AFB1标准液滴加在MB-Apt/AuNPs/CMK/GCE工作电极上,孵育后用PBS仔细冲洗以去除工作电极表面未结合的AFB1,用氮气吹干,形成待检测工作电极;
(2)差分脉冲伏安法检测:待检测工作电极浸入pH为7.4的PBS中,以饱和氯化钾甘汞电极为参比电极,以铂柱电极为对电极,在一定的电位范围下进行差分脉冲伏安法扫描。
2.根据权利要求1所述一种基于电化学适配体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于:所述HAuCl4和H2SO4的混合溶液中,HAuCl4浓度为2.5 mmol/L, H2SO4浓度为0.5mol/L。
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2019
- 2019-03-25 CN CN201910228145.XA patent/CN109870497B/zh active Active
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN109870497A (zh) | 2019-06-11 |
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