CN114636738B - 一种酶生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶生物传感器及其制备方法和应用。本发明的酶生物传感器为由酶修饰的基底电极、参比电极和对电极组成的三电极体系，酶修饰的基底电极的组成包括依次设置的基底电极、纳米多孔金修饰层、活化的硫辛酸自组装膜层和酶修饰层，酶修饰层的组成包括甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖。本发明的酶生物传感器的制备方法包括以下步骤：先制备含纳米多孔金修饰层、活化的硫辛酸自组装膜层和酶修饰层的基底电极，再组装三电极体系，即得酶生物传感器。本发明的酶生物传感器具有良好的电子传递性能，能够快速转移反应产生的电子，实现对目标分子的选择性检测，响应速度快，且该传感器还具有良好的重现性、稳定性和灵敏度。

Description

一种酶生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种酶生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
丙三醇，又名甘油，是一种无色、无臭、微甜并具有较强吸湿性的粘稠液体，常作为甜味剂、保湿剂、增稠剂应用在食品、日化和医药领域。甘油是果酒饮料中重要的天然发酵成分，可以增加果酒口感的复杂性和丰满度，而甘油含量则是业内人士判断葡萄酒品质的重要依据之一；甘油是生物柴油生产中的主要副产物，其含量会直接影响生物柴油的使用性能，是衡量生物柴油品质的重要指标之一；甘油常作为保湿剂添加到面霜、护发产品和肥皂中，但甘油浓度过高却又会对皮肤产生严重的刺激作用；人血清中甘油的正常浓度水平为0.05mmol/L～0.1mmol/L，甘油可以作为心血管疾病的生物标志物(甘油浓度高于0.327mmol/L±0.190mmol/L，则说明可能患有心血管疾病)。因此，甘油含量的测定具有重要的现实意义。
目前，甘油测定的方法主要包括分光光度法、红外光谱法、色谱法和电化学方法。分光光度法、红外光谱法和色谱法等传统方法普遍存在程序繁杂、成本高昂、仪器设备要求较高等问题，不适用于大批量样品的快速检测。电化学酶生物传感器具有良好的选择性，且还具有操作方便、检测限低、响应快、灵敏度高等优点，成为了近年来的研究热点。然而，酶对外部环境的敏感性以及易脱落性导致现有的酶生物传感器普遍存在难以重复利用的问题，实际应用受到很大限制。
因此，开发一种简便、快速、灵敏、稳定的甘油电化学生物传感器具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶生物传感器及其制备方法和应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种酶生物传感器，其为由酶修饰的基底电极、参比电极和对电极组成的三电极体系；所述酶修饰的基底电极的组成包括依次设置的基底电极、纳米多孔金修饰层、活化的硫辛酸自组装膜层和酶修饰层；所述酶修饰层的组成包括甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖。
优选的，所述参比电极为饱和甘汞电极。
优选的，所述对电极为铂电极。
优选的，所述基底电极为金盘电极。
优选的，所述活化的硫辛酸自组装膜层由硫辛酸自组装膜经过1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化制成。
上述酶生物传感器的制备方法包括以下步骤：
1)将基底电极浸入镀金液中进行电沉积，得到纳米多孔金修饰的基底电极；
2)将纳米多孔金修饰的基底电极浸入硫辛酸溶液中进行自组装，得到自组装膜修饰的基底电极；
3)将自组装膜修饰的基底电极浸入含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行活化，得到活化的基底电极；
4)将含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液涂覆在活化的基底电极表面，干燥，得到酶修饰的基底电极；
5)将酶修饰的基底电极、参比电极和对电极组成三电极体系，即得酶生物传感器。
优选的，上述酶生物传感器的制备方法包括以下步骤：
1)将基底电极浸入镀金液中进行电沉积，得到纳米多孔金修饰的基底电极；
2)将纳米多孔金修饰的基底电极浸入硫辛酸的乙醇溶液中进行自组装，得到自组装膜修饰的基底电极；
3)将1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液等体积混合制成含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液，再将自组装膜修饰的基底电极浸入含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行活化，得到活化的基底电极；
4)将甘油激酶溶液和甘油三磷酸氧化酶溶液等体积混合制成复合酶溶液，再将复合酶溶液和壳聚糖的乙酸溶液等体积混合制成含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液，再将含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液滴涂在活化的基底电极表面，干燥，得到酶修饰的基底电极；
5)将酶修饰的基底电极、参比电极和对电极组成三电极体系，即得酶生物传感器。
优选的，步骤1)所述基底电极进行过预处理，预处理过程如下：将基底电极的表面用直径0.04μm～0.06μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再用水冲洗，再依次在无水乙醇和水中进行超声清洗，取出用水洗净，用N2吹干，再将基底电极置于H2SO4溶液中进行活化处理，再用水洗净电极表面。
优选的，所述H2SO4溶液的浓度为0.8mol/L～1.2mol/L。
优选的，步骤1)所述镀金液为HAuCl4-H2SO4溶液，HAuCl4的浓度为1mmol/L～100mmol/L，H2SO4的浓度为1mol/L～5mol/L。
优选的，步骤1)所述电沉积采用恒电位法，沉积电压为-1V～-4V，沉积时间为10s～90s。
优选的，步骤2)所述硫辛酸的乙醇溶液的浓度为8mmol/L～12mmol/L。
优选的，步骤2)所述自组装的时间为1h～5h。
优选的，步骤3)所述1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为250mmol/L～350mmol/L，溶剂为pH＝5.6、浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
优选的，步骤3)所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为80mmol/L～120mmol/L，溶剂为pH＝5.6、浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
优选的，步骤3)所述含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2.8～3.2:1。
优选的，步骤3)所述活化的时间为40min～80min。
优选的，步骤4)所述甘油激酶溶液的活性浓度为2U/μL～10U/μL，溶剂为pH＝7.0、浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
优选的，步骤4)所述甘油三磷酸氧化酶溶液的活性浓度为2U/μL～10U/μL，溶剂为pH＝7.0、浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
优选的，步骤4)所述壳聚糖的乙酸溶液的浓度为5mg/mL～15mg/mL。
优选的，步骤4)含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液在活化的基底电极表面的涂覆量为0.6μL/mm2～0.8μL/mm2。
本发明的原理：本发明先制备纳米多孔金材料，该材料具有易修饰性、良好的导电性、出色的生物相容性和高比表面积，有利于后续酶的负载和器件灵敏度的提升，随后进行自组装处理引入羧基基团，增强材料对酶的吸附性和稳定性，然后利用具有丰富氨基基团、易成膜的壳聚糖进一步包埋酶，增加酶在基底电极表面的固定量和稳定性，以利于对底物的催化，再利用修饰后的基底电极(工作电极)配合参比电极和对电极组成三电极体系，最终得到一种新型的可以检测甘油的酶生物传感器。
本发明的有益效果是：本发明的酶生物传感器具有良好的电子传递性能，能够快速转移反应产生的电子，实现对目标分子的选择性检测，响应速度快，且该传感器还具有良好的重现性、稳定性和灵敏度。
具体来说：
1)本发明的酶生物传感器具有良好的电子传递性能，能够快速转移反应产生的电子，实现甘油的检测，响应速度快；
2)本发明的酶生物传感器具有良好的重现性和稳定性，可以对甘油进行准确检测，抗干扰能力强；
3)本发明的酶生物传感器可以用于食品中甘油的检测，操作简单，具有较宽的检测范围(在浓度1×10-4mol/L～5×10-3mol/L的范围内，催化反应的响应电流与甘油浓度变化呈线性关系)和较低的检测限(氧化反应响应电流与甘油浓度的关系为Ipa(μA)＝9.17C+71.42(mmol/L)，相关系数为R2＝0.9923，检测限为7.71×10-5mol/L(S/N＝3)，灵敏度为9.17μA/mmol)，性能稳定，具有良好的应用前景；
4)本发明的酶生物传感器的制备过程简单，适合进行大规模生产应用。
附图说明
图1为实施例3中采用不同浓度的甘油激酶溶液和甘油三磷酸氧化酶溶液制备的酶生物传感器的循环伏安曲线。
图2为实施例3中的酶生物传感器在不同甘油浓度条件下的循环伏安曲线。
图3为实施例3中的酶生物传感器在不同甘油浓度条件下的氧化反应响应电流-甘油浓度关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1：
一种酶生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
1)将直径3mm的金盘电极用直径0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再用蒸馏水冲洗，再依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，再将金盘电极置于浓度1mol/L的H2SO4溶液中在电压-0.1V～1.5V下采用循环伏安法扫描至稳定，再用蒸馏水洗净金盘电极表面，再置于10mL铁氰化钾溶液(含5mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1mol/L的KCl)中在电压-0.2V～0.6V下采用循环伏安法扫描进行电极检测，再取出用蒸馏水冲洗，用N2吹干，得到预处理的金盘电极，再将预处理的金盘电极浸入10mL镀金液(含50mmol/L的HAuCl4和4.0mol/L的H2SO4)中在电压-4V下采用恒电位法电沉积50s，得到纳米多孔金修饰的金盘电极；
2)将纳米多孔金修饰的金盘电极浸入浓度10mmol/L的硫辛酸的乙醇溶液中进行1h自组装，得到自组装膜修饰的金盘电极；
3)将浓度300mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和浓度100mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺溶液等体积混合制成含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液，再将自组装膜修饰的金盘电极浸入含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行1h活化，得到活化的金盘电极；
4)将活性浓度4U/μL的甘油激酶溶液和活性浓度4U/μL的甘油三磷酸氧化酶溶液等体积混合制成复合酶溶液，再将复合酶溶液和浓度10mg/mL的壳聚糖的乙酸溶液等体积混合制成含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液，再取5μL的含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液滴涂在活化的金盘电极表面，干燥，得到酶修饰的金盘电极；
5)将酶修饰的金盘电极(工作电极)、饱和甘汞电极(参比电极)和铂电极(对电极)组成三电极体系，即得酶生物传感器。
性能测试：
在室温下进行电化学试验，测试在含2mmol/L～10mmol/L的二茂铁甲醇、5mmol/L～25mmol/L的三磷酸腺苷和2mmol/L～10mmol/L的MgCl2的10mL的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0，浓度为0.1mmol/L)中进行，测试之前通N2，测试过程中采用循环伏安法，其中空白对照未加入甘油溶液，测试稳定后加入10μL的甘油溶液。
本实施例的酶生物传感器在甘油浓度10mmol/L时，测试得到的氧化峰催化电流为6.24×10-5A。
实施例2：
一种酶生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
1)将直径3mm的金盘电极用直径0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再用蒸馏水冲洗，再依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，再将金盘电极置于浓度1mol/L的H2SO4溶液中在电压-0.1V～1.5V下采用循环伏安法扫描至稳定，再用蒸馏水洗净金盘电极表面，再置于10mL铁氰化钾溶液(含5mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1mol/L的KCl)中在电压-0.2V～0.6V下采用循环伏安法扫描进行电极检测，再取出用蒸馏水冲洗，用N2吹干，得到预处理的金盘电极，再将预处理的金盘电极浸入10mL镀金液(含50mmol/L的HAuCl4和4.0mol/L的H2SO4)中在电压-4V下采用恒电位法电沉积50s，得到纳米多孔金修饰的金盘电极；
2)将纳米多孔金修饰的金盘电极浸入浓度10mmol/L的硫辛酸的乙醇溶液中进行2h自组装，得到自组装膜修饰的金盘电极；
3)将浓度300mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和浓度100mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺溶液等体积混合制成含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液，再将自组装膜修饰的金盘电极浸入含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行1h活化，得到活化的金盘电极；
4)将活性浓度4U/μL的甘油激酶溶液和活性浓度4U/μL的甘油三磷酸氧化酶溶液等体积混合制成复合酶溶液，再将复合酶溶液和浓度10mg/mL的壳聚糖的乙酸溶液等体积混合制成含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液，再取5μL的含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液滴涂在活化的金盘电极表面，干燥，得到酶修饰的金盘电极；
5)将酶修饰的金盘电极(工作电极)、饱和甘汞电极(参比电极)和铂电极(对电极)组成三电极体系，即得酶生物传感器。
性能测试(测试方法同实施例1)：
本实施例的酶生物传感器在甘油浓度10mmol/L时，测试得到的氧化峰催化电流为6.42×10-5A。
实施例3：
一种酶生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
1)将直径3mm的金盘电极用直径0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再用蒸馏水冲洗，再依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，再将金盘电极置于浓度1mol/L的H2SO4溶液中在电压-0.1V～1.5V下采用循环伏安法扫描至稳定，再用蒸馏水洗净金盘电极表面，再置于10mL铁氰化钾溶液(含5mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1mol/L的KCl)中在电压-0.2V～0.6V下采用循环伏安法扫描进行电极检测，再取出用蒸馏水冲洗，用N2吹干，得到预处理的金盘电极，再将预处理的金盘电极浸入10mL镀金液(含50mmol/L的HAuCl4和4.0mol/L的H2SO4)中在电压-4V下采用恒电位法电沉积50s，得到纳米多孔金修饰的金盘电极；
2)将纳米多孔金修饰的金盘电极浸入浓度10mmol/L的硫辛酸的乙醇溶液中进行3h自组装，得到自组装膜修饰的金盘电极；
3)将浓度300mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和浓度100mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺溶液等体积混合制成含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液，再将自组装膜修饰的金盘电极浸入含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行1h活化，得到活化的金盘电极；
4)将活性浓度4U/μL的甘油激酶溶液和活性浓度4U/μL的甘油三磷酸氧化酶溶液等体积混合制成复合酶溶液，再将复合酶溶液和浓度10mg/mL的壳聚糖的乙酸溶液等体积混合制成含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液，再取5μL的含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液滴涂在活化的金盘电极表面，干燥，得到酶修饰的金盘电极；
5)将酶修饰的金盘电极(工作电极)、饱和甘汞电极(参比电极)和铂电极(对电极)组成三电极体系，即得酶生物传感器。
性能测试：
1)在室温下进行电化学试验，测试在含2mmol/L～10mmol/L的二茂铁甲醇、5mmol/L～25mmol/L的三磷酸腺苷和2mmol/L～10mmol/L的MgCl2的10mL的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0，浓度为0.1mmol/L)中进行，测试之前通N2，测试过程中采用循环伏安法，其中空白对照未加入甘油溶液，测试稳定后加入10μL的甘油溶液。
本实施例的酶生物传感器在甘油浓度10mmol/L时，测试得到的氧化峰催化电流为6.75×10-5A。
2)参照本实施例的方法，采用不同浓度的甘油激酶溶液和甘油三磷酸氧化酶溶液来制备酶生物传感器，再参照实施例1的操作在室温下进行电化学试验，得到的循环伏安曲线如图1(方框内为甘油激酶溶液和甘油三磷酸氧化酶溶液的浓度，两种酶溶液的浓度相同)所示。
由图1可知：随着酶浓度的增加，催化电流先大幅增加后达到平台，在酶浓度为6U/μL时其氧化催化电流达到最大值7.16×10-5A，说明在该浓度的酶负载量下，其催化性能最佳；酶浓度低于6U/μL时，酶含量较低，此时增加酶浓度可以较大地提高酶促反应速率；酶浓度高于6U/μL时，酶含量趋于饱和状态，酶促反应速率达到最大，不随酶浓度的提高而增加，导致修饰电极的催化电流增长平缓。
3)选用本实施例的酶生物传感器(即选用活性浓度6U/μL的甘油激酶溶液和活性浓度6U/μL的甘油三磷酸氧化酶溶液制备的酶生物传感器)，参照实施例1的操作在室温下进行电化学试验，并调整加入的甘油的浓度，得到的循环伏安曲线如图2(方框内为甘油的浓度，依次为0.1mmo1/L、0.2mmo1/L、0.4mmo1/L、0.6mmo1/L、0.8mmo1/L、1mmo1/L、2mmo1/L、3mmo1/L、4mmo1/L和5mmo1/L)所示。
由图2可知：本发明利用了自组装膜修饰的纳米多孔金材料的良好导电性、高比表面积，甘油激酶与甘油三磷酸氧化酶对甘油的良好催化性能，壳聚糖的良好成膜性能，增加了酶在电极表面的固定量和稳定性，实现对底物的高效催化。
4)选用本实施例的酶生物传感器(即选用活性浓度6U/μL的甘油激酶溶液和活性浓度6U/μL的甘油三磷酸氧化酶溶液制备的酶生物传感器)，参照实施例1的操作在室温下进行电化学试验，并调整加入的甘油的浓度，得到的氧化反应响应电流-甘油浓度关系图如图3所示。
由图3可知：修饰电极对底物检测范围为1×10-4mol/L～5×10-3mol/L，氧化反应响应电流与甘油浓度的关系为Ipa(μA)＝9.17C+71.42(mmol/L)，相关系数为R2＝0.9923，检测限为7.71×10-5mol/L(S/N＝3)，灵敏度为9.17μA/mmol。
实施例4：
一种酶生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
1)将直径3mm的金盘电极用直径0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再用蒸馏水冲洗，再依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，再将金盘电极置于浓度1mol/L的H2SO4溶液中在电压-0.1V～1.5V下采用循环伏安法扫描至稳定，再用蒸馏水洗净金盘电极表面，再置于10mL铁氰化钾溶液(含5mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1mol/L的KCl)中在电压-0.2V～0.6V下采用循环伏安法扫描进行电极检测，再取出用蒸馏水冲洗，用N2吹干，得到预处理的金盘电极，再将预处理的金盘电极浸入10mL镀金液(含50mmol/L的HAuCl4和4.0mol/L的H2SO4)中在电压-4V下采用恒电位法电沉积50s，得到纳米多孔金修饰的金盘电极；
2)将纳米多孔金修饰的金盘电极浸入浓度10mmol/L的硫辛酸的乙醇溶液中进行4h自组装，得到自组装膜修饰的金盘电极；
3)将浓度300mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和浓度100mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺溶液等体积混合制成含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液，再将自组装膜修饰的金盘电极浸入含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行1h活化，得到活化的金盘电极；
4)将活性浓度4U/μL的甘油激酶溶液和活性浓度4U/μL的甘油三磷酸氧化酶溶液等体积混合制成复合酶溶液，再将复合酶溶液和浓度10mg/mL的壳聚糖的乙酸溶液等体积混合制成含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液，再取5μL的含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液滴涂在活化的金盘电极表面，干燥，得到酶修饰的金盘电极；
5)将酶修饰的金盘电极(工作电极)、饱和甘汞电极(参比电极)和铂电极(对电极)组成三电极体系，即得酶生物传感器。
性能测试(测试方法同实施例1)：
本实施例的酶生物传感器在甘油浓度10mmol/L时，测试得到的氧化峰催化电流为6.57×10-5A。
实施例5：
一种酶生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
1)将直径3mm的金盘电极用直径0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再用蒸馏水冲洗，再依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗2min，再将金盘电极置于浓度1mol/L的H2SO4溶液中在电压-0.1V～1.5V下采用循环伏安法扫描至稳定，再用蒸馏水洗净金盘电极表面，再置于10mL铁氰化钾溶液(含5mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1mol/L的KCl)中在电压-0.2V～0.6V下采用循环伏安法扫描进行电极检测，再取出用蒸馏水冲洗，用N2吹干，得到预处理的金盘电极，再将预处理的金盘电极浸入10mL镀金液(含50mmol/L的HAuCl4和4.0mol/L的H2SO4)中在电压-4V下采用恒电位法电沉积50s，得到纳米多孔金修饰的金盘电极；
2)将纳米多孔金修饰的金盘电极浸入浓度10mmol/L的硫辛酸的乙醇溶液中进行5h自组装，得到自组装膜修饰的金盘电极；
3)将浓度300mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和浓度100mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺溶液等体积混合制成含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液，再将自组装膜修饰的金盘电极浸入含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行1h活化，得到活化的金盘电极；
4)将活性浓度4U/μL的甘油激酶溶液和活性浓度4U/μL的甘油三磷酸氧化酶溶液等体积混合制成复合酶溶液，再将复合酶溶液和浓度10mg/mL的壳聚糖的乙酸溶液等体积混合制成含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液，再取5μL的含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液滴涂在活化的金盘电极表面，干燥，得到酶修饰的金盘电极；
5)将酶修饰的金盘电极(工作电极)、饱和甘汞电极(参比电极)和铂电极(对电极)组成三电极体系，即得酶生物传感器。
性能测试(测试方法同实施例1)：
本实施例的酶生物传感器在甘油浓度10mmol/L时，测试得到的氧化峰催化电流为6.34×10-5A。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种酶生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 将基底电极浸入镀金液中进行电沉积，得到纳米多孔金修饰的基底电极；
2) 将纳米多孔金修饰的基底电极浸入硫辛酸溶液中进行自组装，得到自组装膜修饰的基底电极；
3) 将自组装膜修饰的基底电极浸入含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行活化，得到活化的基底电极；
4) 将含甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖的溶液涂覆在活化的基底电极表面，干燥，得到酶修饰的基底电极；
5) 将酶修饰的基底电极、参比电极和对电极组成三电极体系，即得酶生物传感器；
步骤1）所述镀金液为HAuCl4-H2SO4溶液，HAuCl4的浓度为1mmol/L～100mmol/L，H2SO4的浓度为1mol/L～5mol/L；
步骤1）所述电沉积采用恒电位法，沉积电压为-1V～-4V，沉积时间为10s～90s；
所述酶生物传感器为由酶修饰的基底电极、参比电极和对电极组成的三电极体系；所述酶修饰的基底电极的组成包括依次设置的基底电极、纳米多孔金修饰层、活化的硫辛酸自组装膜层和酶修饰层；所述酶修饰层的组成包括甘油激酶、甘油三磷酸氧化酶和壳聚糖；所述活化的硫辛酸自组装膜层由硫辛酸自组装膜经过1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化制成。
2.根据权利要求1所述的酶生物传感器的制备方法，其特征在于：所述参比电极为饱和甘汞电极；所述对电极为铂电极；所述基底电极为金盘电极。
3.根据权利要求1所述的酶生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤2）所述自组装的时间为1h～5h。
4.根据权利要求1所述的酶生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤3）所述含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2.8～3.2:1。
5.根据权利要求1、3和4中任意一项所述的酶生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤3）所述活化的时间为40min～80min。
6.权利要求1～5中任意一项所述的制备方法制得的酶生物传感器在甘油检测中的应用。
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