CN114910535A - 一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品快速检测技术领域，具体涉及一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α‑羟基山椒素的方法；该方法利用生物相容性良好、无毒的海藻酸钠‑明胶凝胶包裹HepG2活细胞，“编织”成一个特殊的三维网络结构，作为识别α‑羟基山椒素的特殊元件，当不同浓度α‑羟基山椒素存在时，将会对细胞造成不同程度的刺激，受体细胞上的膜受体TRPV1接触经由此将信号转导，从而导致细胞电信号发生改变，通过差分脉冲伏安法(DPV)检测三组的峰值电流，获得标准曲线实现对特定麻味物质的快速超灵敏检测。本发明方法灵敏度高、选择性好、响应迅速、成本低，可通过功能化修饰以实现对其他麻味物质的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法。
背景技术
花椒既是一种常用的食品调味品，又是一种传统中药。花椒中的主要化学成分有生物碱、酰胺、木脂素、挥发油、香豆素等，其中酰胺类物质是花椒的主要的麻味成分。目前，从花椒中提取的麻味组分超过了25种，主要包括α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素和δ-山椒素等及其羟基取代衍生物。麻味物质作为麻味信息的载体，其结构决定了是否具备麻味，也影响着麻味的强弱。其中，含量最多的物质为α-羟基山椒素，属于酰胺一类，麻味较强，白色针状晶体，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，微溶于水，暴露于空气中为黄色胶状物质。
有关花椒麻味物质检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、紫外-可见分光光度计、甲醛滴定法检测等。分光光度法具有成本低的优点，但准确性不高；高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法具有检测结果可靠、准确度高的优点，但检测步骤较为繁琐，耗时长，需要专业人员操作；甲醛滴定法快速、简单，但准确性不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型基于细胞的生物传感器(CBB)与电化学相结合，将哺乳动物活细胞作为识别元件，以细胞电化学响应值变化为信号，通过研究活细胞对麻味物质的反应以及作用机理，建立了一种新型的细胞“味觉”检测方法，从而实现对麻味物质的定量检测，最终实现花椒中α-羟基山椒素的快速、灵敏的检测。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，包括以下步骤：
(1)选择电化学三电极体系：工作电极选择ITO导电玻璃；对电极选择铂丝电极；参比电极选择Ag/AgCl电极；
(2)电极预处理：将ITO玻璃电极依次用丙酮、乙醇、超纯水超声浸泡后再用去离子水冲洗，氮气吹干，得到预处理后的ITO玻璃电极，即裸ITO工作电极；
(3)采用特殊的原电位电化学合成法得到具有“树枝状”的金纳米粒子；具体操作为：将步骤(2)处理的裸ITO工作电极固定在电极夹上，铂电极作为参比电极，饱和Ag/AgCl电极作为对电极，同时浸泡在电解液中进行电沉积，得到Au@ITO电极，使用去离子水冲洗，氮气吹干，制备得到Au@ITO电极；
(4)将步骤(3)制备的Au@ITO电极使用H2SO4溶液进行活化；活化得到的Au@ITO电极经紫外照射灭菌后浸泡于L-Cys溶液中进行自组装，自组装完成后得到L-Cys/Au@ITO电极；
(5)所述细胞为HepG2细胞，HepG2细胞培养条件：将HepG2细胞接种在DMEM培养基中进行培养，培养基中葡萄糖含量为4500mg/L；并在培养基中添加占培养基体积10％的胎牛血清和1％的青链霉素双抗(青霉素-链霉素)，在一定条件下培养至细胞对数期；
(6)制备海藻酸钠-明胶溶液，将海藻酸钠和明胶加入DMEM培养基中，37℃下搅拌1-3h直至溶解，静置过夜，得到与海藻酸钠-明胶溶液；
然后取步骤(5)中对数生长期的细胞与海藻酸钠-明胶溶液充分混合获得海藻酸钠-明胶/细胞复合物；
(7)取步骤(6)所得的海藻酸钠-明胶/细胞复合物涂布于步骤(4)所得的L-Cys/Au@ITO电极表面，再滴加氯化钙溶液，交联一定时间，得到稳定的三维结构；然后再经PBS清洗后转移到培养箱中培养，经培养后获得味觉传感器“信号电极”，记为海藻酸钠-明胶/细胞/L-Cys/Au@ITO电极；
(8)利用DMEM培养基稀释α-羟基山椒素，制备不同浓度梯度的α-羟基山椒素溶液，将步骤(7)制得的海藻酸钠-明胶/细胞/L-Cys/Au@ITO电极在含有不同浓度α-羟基山椒素培养基中进行培养，培养后对其进行电化学差分脉冲伏安法(DPV检测)，测得电化学电流峰值，以电信号电流值为纵坐标，以α-羟基山椒素溶液的浓度为横坐标，构建得到标准曲线；通过测定样品的电化学电流峰值，代入标准曲线，可以实现样品α-羟基山椒素溶液的浓度检测。优选的，步骤(2)中所述丙酮、乙醇、超纯水超声浸泡的时间均为10-15min。
优选的，步骤(3)中所述电解液由HAuCl4、精氨酸和H2SO4组成，所述电解液中包含5mol/L H2SO4，7.5mmol/L HAuCl4，150mmol/L精氨酸。所述电沉积的电压为-0.2V，沉积时间为900s。
优选的，步骤(4)中所述H2SO4溶液浓度为0.5mol/L。
优选的，步骤(4)中所述紫外照射的时间为30-40min；所述L-Cys溶液的浓度为0.5-1mol/L；所述自组装时间为50-80min。
优选的，步骤(5)中所述HepG2细胞接种在DMEM培养基中的细胞密度为2×105-5×105个/ml；所述一定条件下培养具体为：于温度37℃、饱和湿度、CO2浓度5％的恒温培养箱中进行培养24-48h。
优选的，步骤(6)中所述海藻酸钠的用量为培养基质量的2.0％、明胶的用量为培养基质量的0.5％；所述对数生长期的细胞与海藻酸钠-明胶溶液充分混合时，细胞接种量控制在106个/ml。
优选的，步骤(7)中所述涂布、滴加氯化钙溶液和交联均在无菌条件下进行操作，涂布操作时海藻酸钠-明胶/细胞复合物的温度为35～37℃，所述涂布量为30-50μl；所述氯化钙溶液的质量浓度为2-3％，用量300-500μl，所述交联一段时间为8-10min。
优选的，步骤(7)中所述培养的条件温度37℃、饱和湿度、CO2浓度为5％的恒温培养箱中进行培养30-40min。
优选的，步骤(8)中所述α-羟基山椒素标准溶液的浓度为0～80μM；所述培养的时间为12h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明方法根据麻味物质与细胞上的膜受体TRPV1接触，当TRPV1被激活时，能引起Mg2+、Ca2+和Ka+等阳离子第二信使的内流，使胞浆阳离子浓度升高，引起相应的一系列生物学效应，经由此将信号转化为电信号，根据不同的电信号强度，可以实现对α-羟基山椒素的定量检测。
本方法灵敏度高，特异性强，操作简单，检测速度快，可通过改变不同的修饰物实现不同目标物的检测，在构建味觉传感器、感官模拟评判方面具有重要的意义，为之后里利用细胞传感器将“麻味、辣味”可视化奠定一定的基础。
附图说明
图1为电化学三电极原理图；其中1为工作电极(ITO玻璃电极)、2为参比电极、3为对电极。
图2为细胞电化学传感器构建的原理图。
图3为树枝状金纳米粒子在1μm(a)和100nm(b)尺寸条件下的SEM图。
图4为三维细胞/海藻酸钠-明胶表征图；其中(a)为海藻酸钠-明胶凝胶的SEM；(b)细胞/海藻酸钠-明胶凝胶SEM；(c)为活死细胞共聚焦显微三维图。
图5为实际样品检测标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明所使用的DMEM高糖培养基与DMEM培养基成分一致，区别是，其葡萄糖含量为4500mg/L；
实施例1：
本发明的基于细胞电化学味觉传感器模拟人体感官，实现高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，包括以下步骤：
(1)如图1所示，本发明采用经典的三电极体系进行设计；选择电化学三电极体系：工作电极选择ITO导电玻璃；对电极选择铂丝电极；参比电极选择Ag/AgCl电极；
(2)将2.5×1.0cm2的ITO导电玻璃作为工作电极，控制工作面积为1cm2进行清洗；ITO玻璃电极依次用丙酮、乙醇、超纯水超声浸泡清洗，以去除有机物，之后用去离子水冲洗，氮气吹干；得到预处理后的ITO玻璃电极，即裸ITO工作电极；
(3)采用特殊的原电位电化学合成法得到具有“树枝状”的金纳米粒子；图3所示为树枝状金纳米粒子SEM图。树枝状金纳米粒子是通过自发的原电位电化学合成方法进行的。具体操作为：将步骤(2)处理的裸ITO工作电极固定在电极夹上，铂电极作为参比电极，饱和Ag/AgCl电极作为对电极，同时浸泡在电解液中，在-0.2V电位下，沉积900s，得到Au@ITO电极，使用去离子水冲洗，氮气吹干，制备得到Au@ITO电极。
所述电解液由HAuCl4、精氨酸和H2SO4组成，所述电解液中包含5mol/L H2SO4，7.5mmol/L HAuCl4，150mmol/L精氨酸。
(4)将步骤3)将制备好的Au@ITO电极使用0.5mol/L H2SO4溶液进行活化；
(5)将活化后Au@ITO电极在超净台紫外灯照射下30min，以达到杀菌消毒的作用。其次，称取L-Cys，配制0.5mol/L的L-Cys溶液，并把制备好的Au@ITO电极浸泡在溶液里，室温条件下自组装1h，在电极表面形成一层L-Cys薄膜；自组装完成后得到L-Cys/Au@ITO电极；
(6)将HepG2细胞接种在DMEM高糖培养基中进行培养，细胞密度为5×105个/ml；培养基中添加体积分数为10％胎牛血清溶液和体积分数为1％双抗(青霉素-链霉素)溶液，于温度37℃，饱和湿度，CO2浓度5％的恒温培养箱中进行培养至细胞对数期；
(7)制备海藻酸钠-明胶溶液，将海藻酸钠和明胶加入DMEM高糖培养基中，37℃下搅拌3h直至溶解，静置过夜，直至气泡消失，得到与海藻酸钠-明胶溶液；其中海藻酸钠的用量为培养基质量的2.0％、明胶的用量为培养基质量的0.5％；
然后取步骤(6)中对数生长期的细胞与海藻酸钠-明胶溶液充分混合获得海藻酸钠-明胶/细胞复合物；所述对数生长期的细胞与海藻酸钠-明胶溶液充分混合时，细胞接种量控制在106个/ml。
为了使细胞牢固的固定在电极上，使用海藻酸钠-明胶溶液(培养基配制)与收集的对数生长期细胞进行均匀混合，最终在氯化钙条件下形成三维结构，保持细胞活性同时防止外界环境对细胞造成的影响。图4所示，分别为海藻酸钠-明胶溶液的SEM图、海藻酸钠-明胶/细胞复合物的SEM图(即细胞在凝胶中的SEM图)以及细胞在凝胶中的共聚焦显微图，说明所制备的细胞三维体系可以很好地包裹细胞，细胞是可以在所制备的凝胶三维结构中生存的，且细胞活性良好，表明工作电极制作成功；
(8)取30μl海藻酸钠-明胶/细胞混合物均匀涂布在L-Cys/Au@ITO电极上，胶头滴管吸取500μl质量浓度为2％氯化钙溶液沿边缘缓慢滴入，交联8min，得到稳定的三维结构，上述整个过程保证在无菌环境下进行操作；然后再经PBS清洗之后转移到培养箱中，37℃培养30min得到海藻酸钠-明胶/细胞/L-Cys/Au@ITO电极，待用；
(9)制备已知浓度的检测体系：得到不同浓度梯度的α-羟基山椒素溶液(0μM、1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM)，具体操作是：将α-山椒素标品溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，避光保存在-20℃冰箱中，使用时用DMEM高糖培养基进行稀释，配制不同浓度的α-羟基山椒素溶液，对海藻酸钠-明胶/细胞/L-Cys/Au@ITO电极的工作电极进行处理，用于检测；
通过电极夹将海藻酸钠-明胶/细胞/L-Cys/Au@ITO电极固定，置于三电极体系中进行差分脉冲伏安法(DPV)电化学检测。将不同浓度α-羟基山椒素溶液进行电化学检测，具体参数为：使用1mM Fe(CN)6 3-/4-和0.1M KCl溶液进行PDV检测。DPV检测在一下条件下进行：初始电位,-0.5V；最终电位，0V；增量电位，4mV；脉冲宽度，50ms；脉冲周期，500ms。测得电化学信号变化值，以电信号电流值为纵坐标，以α-羟基山椒素溶液绘制标准曲线；如图5示，绘制标准曲线，y＝-0.017849x+5.84952R2＝0.98962，说明α-羟基山椒素的浓度与电极电流值成线性相关的，即本发明提供的方法可以用来快速检测α-羟基山椒素浓度。
因此，本发明设计出灵敏度高、特异性强、操作简单、检测速度快的细胞电化学传感器，并可通过更换修饰物，实现其它目标物的检测，在构建味觉传感器、感官模拟评判方面具有重要的意义。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择电化学三电极体系：工作电极选择ITO导电玻璃；对电极选择铂丝电极；参比电极选择Ag/AgCl电极；
(2)电极预处理：将ITO玻璃电极依次用丙酮、乙醇、超纯水超声浸泡后再用去离子水冲洗，氮气吹干，得到预处理后的ITO玻璃电极，即裸ITO工作电极；
(3)采用特殊的原电位电化学合成法得到具有“树枝状”的金纳米粒子；具体操作为：将步骤(2)处理的裸ITO工作电极固定在电极夹上，铂电极作为参比电极，饱和Ag/AgCl电极作为对电极，同时浸泡在电解液中进行电沉积，得到Au@ITO电极，使用去离子水冲洗，氮气吹干，制备得到Au@ITO电极；
(4)将步骤(3)制备的Au@ITO电极使用H2SO4溶液进行活化；活化得到的Au@ITO电极经紫外照射灭菌后浸泡于L-Cys溶液中进行自组装，自组装完成后得到L-Cys/Au@ITO电极；
(5)所述细胞为HepG2细胞，HepG2细胞培养条件：将HepG2细胞接种在DMEM培养基中进行培养，培养基中葡萄糖含量为4500mg/L；并在培养基中添加占培养基体积10％的胎牛血清和1％的青链霉素双抗，在一定条件下培养至细胞对数期；
(6)制备海藻酸钠-明胶溶液，将海藻酸钠和明胶加入DMEM培养基中，37℃下搅拌1-3h直至溶解，静置过夜，得到与海藻酸钠-明胶溶液；
然后取步骤(5)中对数生长期的细胞与海藻酸钠-明胶溶液充分混合获得海藻酸钠-明胶/细胞复合物；
(7)取步骤(6)所得的海藻酸钠-明胶/细胞复合物涂布于步骤(4)所得的L-Cys/Au@ITO电极表面，再滴加氯化钙溶液，交联一定时间，得到稳定的三维结构；然后再经PBS清洗后转移到培养箱中培养，经培养后获得味觉传感器“信号电极”，记为海藻酸钠-明胶/细胞/L-Cys/Au@ITO电极；
(8)利用DMEM培养基稀释α-羟基山椒素，制备不同浓度梯度的α-羟基山椒素溶液，将步骤(7)制得的海藻酸钠-明胶/细胞/L-Cys/Au@ITO电极在含有不同浓度α-羟基山椒素培养基中进行培养，培养后对其进行电化学差分脉冲伏安法，测得电化学电流峰值，以电信号电流值为纵坐标，以α-羟基山椒素溶液的浓度为横坐标，构建得到标准曲线；通过测定样品的电化学电流峰值，代入标准曲线，可以实现样品α-羟基山椒素溶液的浓度检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，步骤(2)中所述丙酮、乙醇、超纯水超声浸泡的时间均为10-15min。
3.根据权利要求1所述的一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，步骤(3)中所述电解液由HAuCl4、精氨酸和H2SO4组成，所述电解液中包含5mol/L H2SO4，7.5mmol/L HAuCl4，150mmol/L精氨酸；所述电沉积的电压为-0.2V，沉积时间为900s。
4.根据权利要求1所述的一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，步骤(4)中所述H2SO4溶液浓度为0.5mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，步骤(4)中所述紫外照射的时间为30-40min；所述L-Cys溶液的浓度为0.5-1mol/L；所述自组装时间为50-80min。
6.根据权利要求1所述的一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，步骤(5)中所述HepG2细胞接种在DMEM培养基中的细胞密度为2×105-5×105个/ml；所述一定条件下培养具体为：于温度37℃、饱和湿度、CO2浓度5％的恒温培养箱中进行培养24-48h。
7.根据权利要求1所述的一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，步骤(6)中所述海藻酸钠的用量为培养基质量的2.0％、明胶的用量为培养基质量的0.5％；所述对数生长期的细胞与海藻酸钠-明胶溶液充分混合时，细胞接种量控制在106个/ml。
8.根据权利要求1所述的一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，步骤(7)中所述涂布、滴加氯化钙溶液和交联均在无菌条件下进行操作，涂布操作时海藻酸钠-明胶/细胞复合物的温度为35～37℃，所述涂布量为30-50μl；所述氯化钙溶液的质量浓度为2-3％，用量300-500μl；所述交联一段时间为8-10min。
9.根据权利要求1所述的一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，步骤(7)中所述培养的条件温度37℃、饱和湿度、CO2浓度为5％的恒温培养箱中进行培养30-40min。
10.根据权利要求1所述的一种基于细胞电化学味觉传感器高灵敏快速检测α-羟基山椒素的方法，其特征在于，步骤(8)中所述α-羟基山椒素标准溶液的浓度为0～80μM；所述培养的时间为12h。
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