CN114965629A - 一种乳酸生物传感器及其制备方法、一种细胞活力电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种乳酸生物传感器及其制备方法、一种细胞活力电化学检测方法。本发明提供一种乳酸生物传感器，包括有机聚合物基底和设置于所述有机聚合物基底表面的电极图案，所述电极图案包括工作电极、金对电极和参比电极；所述参比电极为层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层和Ag/AgCl层，所述工作电极包括依次层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层、普鲁士蓝层和响应层；所述响应层的组成包括乳酸氧化酶。本发明提供的乳酸生物传感器能够实现对细胞培养基上清液中乳酸浓度高灵敏准确测定；并且可以实现多点采集和监测，全面实现肿瘤模型对药物反应的动态检测过程。

Description

一种乳酸生物传感器及其制备方法、一种细胞活力电化学检 测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种乳酸生物传感器及其制备方法、一种细胞活力电化学检测方法。
背景技术
由于不同的癌症患者对各种癌症治疗方案表现出很大的异质性，因此针对每个病人可能需要合理设计不同的治疗方案以达到精准治疗的效果。
近年来，基于个体化医疗的肿瘤体外培养模型(以下简称微肿瘤模型)被广为研究，主要包括原代肿瘤模型、PDO模型和PDX模型。以PDO模型为例，PDO(Patient DerivedOrganoids)模型为将癌症患者手术获取的肿瘤进行体外细胞培养，建成PDO类器官药敏模型，具有类似于原始组织的“微型器官”的能力，可以弥补传统2D培养技术留下的空白，解决肿瘤细胞系在治疗反应预测中的局限性。在代替其在肿瘤病人对药物的敏感性预测，帮助患者尽快找到疗效最好的药物及组合，争取最佳治疗时间方面显示出极大的应用潜力。
体外微肿瘤模型需要具备时效性，均一性，低成本，培养成功率高，重现性好，尽可能地保留体内肿瘤微环境等特点。同时，微肿瘤模型的体外药敏评价的技术和标准也是一个直接关系到其准确性和临床一致性的重要问题。
目前，大多数肿瘤体外药敏模型采用的是影像学方法和细胞活力检测两种技术。影像学主要用显微镜观察细胞团簇，通过其形貌，数量和大小的变化来判断药物敏感情况，细胞活力测试(例如celltiter-glo试剂盒)则是通过与细胞内相应生物标志物来表征细胞的状态。
上述两种方法各有优势，影像学方法简便快捷，可以在不同时间段实时监测。但是对于细胞活力的判断依据不足，有时细胞团簇依然存在但是细胞的状态已经凋亡或活力不足，这种情况单纯采用影像学是无法识别的。细胞活力测试能够识别这种情况，但是这种检测方法是破坏性的，一旦反应细胞无法继续存活，则无法进行实时动态检测。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种乳酸生物传感器及其制备方法、一种细胞活力检测方法。本发明提供的乳酸生物传感器能够实现对细胞培养基上清液中乳酸浓度进行高灵敏和高稳定性的检测，从而准确测定细胞活力；并且本发明提供的乳酸生物传感器可以实现多点采集和监测，全面得到肿瘤模型对药物的动态检测过程，为肿瘤体外药敏检测提供综合性能强的分析工具。
为了解决前述技术问题，本发明提供了一种乳酸生物传感器，包括有机聚合物基底和设置于所述有机聚合物基底表面的电极图案，所述电极图案包括工作电极、金对电极和参比电极；所述电极图案中，所述工作电极包括第一工作区2-3、第一接线端2-2和连接两者的第一导线2-1；
所述金对电极包括第二工作区1-3、第二接线端1-2和连接两者的第二导线1-1；
所述参比电极包括第三工作区3-3、第三接线端3-2和连接两者的第三导线3-1；
所述第一工作区2-3形状为圆形；
所述第二工作区1-3的形状为3/4圆环，所述3/4圆环环绕于所述第一工作区2-3圆外周并存在间隙；
所述第三工作区3-3形状为正方形；所述第三工作区3-3设置于所述第一工作区2-3外侧并位于所述3/4圆环的缺口处；
所述参比电极的第三工作区3-3为层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层和Ag/AgCl层，所述工作电极的第一工作区2-3包括依次层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层、普鲁士蓝层和响应层；所述响应层的组成包括乳酸氧化酶；所述参比电极中的金单质层与所述工作电极的金单质层均与所述有机聚合物基底接触。
优选的，所述响应层的组成还包括还包括壳聚糖、碳纳米管、石墨烯、金属有机框架材料、共价有机框架材料和金属纳米颗粒中的一种或多种。
优选的，所述响应层的组成还包括壳聚糖和碳纳米管时，所述壳聚糖、所述碳纳米管和所述乳酸氧化酶的质量之比为1:0.2:2。
优选的，所述响应层中所述乳酸氧化酶的酶量为0.1～3.6U。
优选的，所述第一工作区2-3还包括设置于所述响应层表面的全氟磺酸层。
本发明提供上述技术方案所述乳酸生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
按照预定的电极图案采用紫外光曝光有机聚合物基底相应的区域，形成表面改性区域，得到表面改性的有机聚合物基底，所述电极图案的区域包括工作电极区域、对电极区域和参比电极区域；
将所述表面改性的有机聚合物基底浸渍于所述胺化溶液对所述表面改性区域进行胺化改性，得到胺化的有机聚合物基底，所述胺化溶液包括乙二胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
将所述胺化的有机聚合物基底依次浸渍于HAuCl4溶液中和还原剂溶液中，在胺化改性区域表面形成金单质层，得到活化的有机聚合物基底；
将所述活化的有机聚合物基底浸渍于镀金液中对所述金单质层进行化学镀金，得到镀金有机聚合物基底；
在所述镀金有机聚合物基底表面的参比电极区域制备Ag/AgCl层，形成参比电极；
在所述镀金有机聚合物基底表面的工作电极区域电化学沉积普鲁士蓝，得到普鲁士蓝层；
在所述普鲁士蓝层表面滴涂响应溶液，得到所述响应层，在所述工作电极区域形成工作电极；所述响应溶液包括乳酸氧化酶。
优选的，所述响应溶液中，所述乳酸氧化酶的量为2～5U/μL。
优选的，得到所述响应层后，还包括在所述响应层表面滴涂全氟磺酸溶液，得到所述全氟磺酸层。
本发明提供一种细胞活力电化学检测方法，包括以下步骤：
采用乳酸生物传感器检测活细胞培养基上清液稀释液的电流信号，获得电流响应值；
将所述电流响应值代入电流响应值和乳酸浓度的线性曲线中，得到所述活细胞培养基上清液的乳酸浓度；所述电流响应值和乳酸浓度的线性曲线为采用乳酸生物传感器检测不同已知乳酸浓度的标准乳酸溶液获得的线性曲线；
由所述活细胞培养基上清液与对照样本的乳酸浓度归一化获得活细胞的细胞活力；
所述乳酸生物传感器为上述技术方案所述的乳酸生物传感器或上述技术方案所述制备方法制备得到的乳酸生物传感器。
优选的，所述乳酸生物传感器的检测限为8.5μmol/L。
优选的，所述线性曲线的线性范围为0.05～0.8mmol/L。
本发明提供一种乳酸生物传感器，包括有机聚合物基底和设置于所述有机聚合物基底表面的电极图案，所述电极图案包括工作电极、金对电极和参比电极；所述电极图案中，所述工作电极包括第一工作区2-3、第一接线端2-2和连接两者的第一导线2-1；所述金对电极包括第二工作区1-3、第二接线端1-2和连接两者的第二导线1-1；所述参比电极包括第三工作区3-3、第三接线端3-2和连接两者的第三导线3-1；所述第一工作区2-3形状为圆形；所述第二工作区1-3的形状为3/4圆环，所述3/4圆环环绕于所述第一工作区2-3圆外周并存在间隙；所述第三工作区3-3形状为正方形；所述第三工作区3-3设置于所述第一工作区2-3外侧并位于所述3/4圆环的缺口处；所述参比电极的第三工作区3-3为层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层和Ag/AgCl层，所述工作电极的第一工作区2-3包括依次层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层、普鲁士蓝层和响应层；所述响应层的组成包括乳酸氧化酶；所述参比电极中的金单质层与所述工作电极的金单质层均与所述有机聚合物基底接触。本发明提供的乳酸生物传感器以乳酸氧化酶作为响应层的关键性物质，同时以普鲁士蓝层辅助响应层不仅实现响应层对乳酸高灵敏准确响应测定，并且提高乳酸生物传感器的稳定性；而且本发明提供的乳酸生物传感器对活细胞的常见代谢成分无电化学响应，使用时无显著的干扰物信号，因此，本发明提供的乳酸生物传感器具有较为优秀的选择性；最后本发明提供的乳酸生物传感器通过采用上述结构有效提供了检测的稳定性。由此，本发明提供的乳酸生物传感器能够实现对细胞培养基上清液中乳酸浓度进行高灵敏和稳定性地准确测定，从而根据瓦氏效应(Warburg效应)，依据上清液中乳酸含量准确测定相对的细胞活力；并且本发明提供的乳酸生物传感器可以实现多点采集和监测，全面得到肿瘤模型对药物的动态检测过程，为肿瘤体外药敏检测提供综合性能强的分析工具。
进一步，本发明提供的乳酸生物传感器的响应层还包括壳聚糖和/或碳纳米管。在本发明中，所述壳聚糖和/或碳纳米管能够吸附响应层中乳酸氧化酶，提高响应层中乳酸氧化酶的稳定性，进而进一步提高所述乳酸生物传感器使用的长期稳定性，由实施例的结果可知，本发明提供的乳酸生物传感器能够在21天内保持信号的稳定性，而且在连续监测长达2000s的时间内仍然能够维持十分稳定的电化学响应。
本发明提供一种细胞活力电化学检测方法，包括以下步骤：采用乳酸生物传感器检测活细胞培养上清液的电流信号，获得电流响应值；将所述电流响应值代入电流响应值和乳酸浓度的线性曲线中，得到所述活细胞培养基上清液的乳酸浓度；所述电流响应值和乳酸浓度的线性曲线为采用乳酸生物传感器检测不同已知乳酸浓度的标准乳酸溶液获得的线性曲线；由所述活细胞培养基上清液的乳酸浓度获得活细胞的细胞活力；所述乳酸生物传感器为上述技术方案任一项所述的乳酸生物传感器或上述技术方案所述制备方法制备得到的乳酸生物传感器。瓦氏效应(Warburg效应)将癌细胞编程为依靠有氧糖酵解来支持其增殖和合成代谢生长，癌细胞有氧糖酵解迅速产生ATP并将碳从葡萄糖转移到前体中，用于合成核苷酸、蛋白质和脂质。由于这种转换，葡萄糖在细胞质基质中转换成的丙酮酸优先分解代谢为乳酸，而不是通过线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)完全代谢为二氧化碳。因此，肿瘤细胞代谢的一个特征性结果就是外环境乳酸的积累，所以乳酸浓度变化可以近似代替肿瘤细胞活力。本发明提供的细胞活力电化学检测方法，采用上述技术方案所述的乳酸生物传感器电化学反应对细胞培养上清液中乳酸含量进行高灵敏准确测定，并且可以实现多点采集和监测，可以得到肿瘤模型对药物的动态响应过程。经过实施例验证，本发明提供的细胞活力电化学检测方法与传统影像学和细胞活力测试具有高度的一致性，通过数据分析，结合影像学可以得到更高的准确性。有望成为一种非常有潜力的肿瘤细胞活力检测方法。
附图说明
图1为本发明实施例制备乳酸生物传感器电极图案示意图；
图1中，1-1为第二导线，1-2为第二接线端，1-3为第二工作区，2-1为第一导线，2-2为第一接线端，2-3为第一工作区。3-1为第三导线。3-2为第三接线端，3-3为第三工作区；
图2为本发明实施例1～4制备的乳酸生物传感器的电化学性能检测结果(电流-扫描圈数)；
图3为本发明实施例1～4制备的乳酸生物传感器的电化学性能检测结果(扫描圈数-检测信号)；
图4为实施例1、实施例5、实施例6和对比例1制备的乳酸生物传感器的电化学性能检测结果(酶量-检测信号)；
图5为实施例1制备的乳酸生物传感器对0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L和0.8mmol/L的标准乳酸溶液进行电化学测试结果；
图6为实施例1制备的乳酸生物传感器电学信号与乳酸浓度的线性曲线；
图7为实施1制备的乳酸生物传感器在0.3mmol/L的常见代谢成分的电化学响应测试结果；
图8为实施例1制备的乳酸生物传感器在3周的时间内评估长期稳定性测试结果；
图9为实施例1制备的乳酸生物传感器在长达2000s的时间内维持十分稳定的电化学响应测试结果；
图10为按照实施例1提供的方法同一批次多个传感器的测试结果对比；
图11为按照实施例1提供的方法分不同批次制备了多个乳酸传感器的测试结果对比；
图12为pH值对实施例1制备的乳酸生物传感器测量的影响；
图13为温度对实施例1制备的乳酸生物传感器测量的影响；
图14为实施例1制备的乳酸生物传感器在准确检测活细胞培养基中乳酸的应用测试结果；
图15为实施例1制备的乳酸生物传感器在准确检测活细胞培养基中乳酸以及相应的细胞活力测试的应用测试结果；
图16为实施例1制备的乳酸生物传感器实时监测肿瘤细胞分泌的乳酸的变化；
图17为实施例1制备的乳酸生物传感器实时监测肿瘤细胞分泌的乳酸的变化；
图18为用光学显微镜的对PTC培养过程中的活力(尺寸)评价；
图19为PTC在培养第2天，14天和24天时的细胞活力测试结果；
图20PTC1不同药物组合药敏实验中PTC大小和细胞活力测试的结果比较；
图21PTC2不同药物组合药敏实验中PTC大小和细胞活力测试的结果比较；
图22PTC1不同药物组合药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果比较；
图23PTC2不同药物组合药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果比较；
图24PTC1不同浓度相同药物组合药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果比较；
图25PTC1同一药物药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果的半抑制浓度曲线的比较；
图26PTC2同一药物药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果的半抑制浓度曲线的比较；
图27PTC3同一药物药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果的半抑制浓度曲线的比较；
图28PTC1同一药物药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的线性相关性；
图29PTC2同一药物药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的线性相关性；
图30PTC3同一药物药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的线性相关性；
图31PTC4不同药物组合药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果比较；
图32PTC5不同药物组合药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果比较；
图33PTC6不同药物组合药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果比较；
图34PTC7不同药物组合药敏实验中乳酸测试和细胞活力测试的结果比较；
图35为对比例1制备的乳酸生物传感器电极图案示意图。
具体实施方式
本发明提供一种乳酸生物传感器，包括有机聚合物基底和设置于所述有机聚合物基底表面的电极图案，所述电极图案包括工作电极、金对电极和参比电极；所述电极图案中，所述工作电极包括第一工作区2-3、第一接线端2-2和连接两者的第一导线2-1；
所述金对电极包括第二工作区1-3、第二接线端1-2和连接两者的第二导线1-1；
所述参比电极包括第三工作区3-3、第三接线端3-2和连接两者的第三导线3-1；
所述第一工作区2-3形状为圆形；
所述第二工作区1-3的形状为3/4圆环，所述3/4圆环环绕于所述第一工作区2-3圆外周并存在间隙；
所述第三工作区3-3形状为正方形；所述第三工作区3-3设置于所述第一工作区2-3外侧并位于所述3/4圆环的缺口处；
所述参比电极的第三工作区3-3为层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层和Ag/AgCl层，所述工作电极的第一工作区2-3包括依次层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层、普鲁士蓝层和响应层；所述响应层的组成包括乳酸氧化酶；所述参比电极中的金单质层与所述工作电极的金单质层均与所述有机聚合物基底接触。
本发明提供的乳酸生物传感器包括有机聚合物基底。
在本发明中，所述有机聚合物基底的材质具体优选为聚苯乙烯。
在本发明的具体实施例中，所述有机聚合物基底具体优选为聚苯乙烯片。
本发明提供的乳酸生物传感器包括设置于所述有机聚合物基底表面的电极图案。
在本发明中，所述电极图案包括工作电极。
在本发明中，所述所述电极图案中，所述工作电极包括第一工作区2-3、第一接线端2-2和连接两者的第一导线2-1。
在本发明中，所述第一工作区2-3形状为圆形。
在本发明中，所述工作电极的第一工作区2-3包括依次层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层、普鲁士蓝层和响应层；所述金单质层与所述有机聚合物基底接触，所述响应层包括乳酸氧化酶。
在本发明中，所述普鲁士蓝层辅助所述响应层，实现所述乳酸生物传感器对所述乳酸的电化学响应。
在本发明中，所述响应层的组成优选还包括还包括壳聚糖、碳纳米管、石墨烯、金属有机框架材料、共价有机框架材料和金属纳米颗粒中的一种或多种，更优选为壳聚糖和碳纳米管。
在本发明中，所述碳纳米管优选为单壁碳纳米管。
在本发明中，所述响应层优选还包括壳聚糖和碳纳米管时，所述壳聚糖、所述碳纳米管和所述乳酸氧化酶的质量之比优选为1:0.2:2。
在本发明中，所述响应层中所述乳酸氧化酶的酶量为0.1～3.6U，优选为1.2～3.6U，具体优选为1.2U、2.4U或3.6U,，最优选为2.4U。
在本发明中，所述第一工作区2-3优选还包括设置于所述响应层表面的全氟磺酸层。
在本发明中，所述全氟磺酸层优选为所述响应层的保护层，提高所述乳酸生物传感器的使用寿命和使用稳定性。
在本发明中，所述电极图案包括金对电极和参比电极。
在本发明中，所述金对电极包括第二工作区1-3、第二接线端1-2和连接两者的第二导线1-2。
在本发明中，所述参比电极包括第三工作区3-3、第三接线端3-2和连接两者的第三导线3-1。
在本发明中，所述第二工作区1-3的形状为3/4圆环，所述3/4圆环环绕于所述第一工作区2-3圆外周并存在间隙。
在本发明中，所述第三工作区3-3形状为正方形；所述第三工作区3-3设置于所述第一工作区2-3外侧并位于所述3/4圆环的缺口处。
在本发明中，所述第三工作区3-3的边长与所述第二工作区1-3圆环宽度优选相等。
在本发明中，所述第三工作区3-3的中心点与所述第二工作区1-3圆环宽度方向的中点到所述3/4圆环的圆心距离优选相等。
在本发明中，所述第三工作区3-3的中心与所述第一工作区2-3的圆心位于同一水平线上。
在本发明中，所述参比电极的第三工作区3-3为层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层和Ag/AgCl层，所述参比电极中的金单质层与所述有机聚合物基底接触。
在本发明中，本发明优选将所述金对电极和参比电极设计为上述图案，从而有利于提高电极的检测性能和稳定性。
在本发明中，乳酸生物传感器对所述乳酸的电化学响应具有线性相关性。
在本发明中，所述乳酸生物传感器的检测限为8.5μmol/L。
在本发明中，所述线性相关性的酸酸浓度氛围优选为0.05～0.8mmol/L。
在本发明中，所述线性相关性的相关系数为0.9991。
在本发明中，基于所述线性相关性的线性拟合的斜率，所述乳酸生物传感器的灵敏度为0.411μA·mM-1。
在本发明中，所述线性相关性的信噪比s/n＝3。
本发明提供了上述技术方案所述乳酸生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
按照预定的电极图案采用紫外光曝光有机聚合物基底相应的区域，形成表面改性区域，得到表面改性的有机聚合物基底，所述电极图案的区域包括工作电极区域、对电极区域和参比电极区域；
将所述表面改性的有机聚合物基底浸渍于所述胺化溶液对所述表面改性区域进行胺化改性，得到胺化的有机聚合物基底，所述胺化溶液包括乙二胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
将所述胺化的有机聚合物基底依次浸渍于HAuCl4溶液中和还原剂溶液中，在胺化改性区域表面形成金单质层，得到活化的有机聚合物基底；
将所述活化的有机聚合物基底浸渍于镀金液中对所述金单质层进行化学镀金，得到镀金有机聚合物基底；
在所述镀金有机聚合物基底表面的参比电极区域制备Ag/AgCl层，形成参比电极；
在所述镀金有机聚合物基底表面的工作电极区域电化学沉积普鲁士蓝，得到普鲁士蓝层；
在所述普鲁士蓝层表面滴涂响应溶液，得到所述响应层，在所述工作电极区域形成工作电极；所述响应溶液包括乳酸氧化酶。
在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明按照预定的电极图案采用紫外光曝光有机聚合物基底相应的区域，形成表面改性区域，得到表面改性的有机聚合物基底，所述电极图案的区域包括工作电极区域、对电极区域和参比电极区域。
在本发明中，所述紫外光的波长优选为254nm。
在本发明中，所述紫外光的光辐照度优选为8.8mW/cm2。
在本发明中，所述曝光的时间优选为4h。
在本发明中，所述曝光之前，本发明优选将镂空保护膜放置于所述有机聚合物基底表面。
在本发明中，所述镂空保护膜的漏孔形状为所述电极图案的形状。
本发明优选通过所述紫外光曝光实现光化学成图，在所述有机聚合物基底表面被曝光区域形成羧基和羟基。
得到表面改性的有机聚合物基底后，本发明将所述表面改性的有机聚合物基底浸渍于所述胺化溶液对所述表面改性区域进行胺化改性，得到胺化的有机聚合物基底，所述胺化溶液包括乙二胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
在本发明中，所述胺化溶液中，所述乙二胺的摩尔浓度优选为0.48mol/L。
在本发明中，所述胺化溶液中，所述EDC的质量浓度优选为0.06mol/L。
在本发明中，所述胺化反应的温度优选为室温。
在本发明中，所述胺化反应的时间优选为3h。
本发明通过所述胺化反应，将所述氨基接枝于所述表面改性的有机聚合物基底的羧基上。
得到胺化的有机聚合物基底后，本发明将所述胺化的有机聚合物基底依次浸渍于HAuCl4溶液中和还原剂溶液中，在胺化改性区域表面形成金单质层，得到活化的有机聚合物基底。
在本发明中，所述HAuCl4溶液的摩尔浓度优选为1mmol/L。
在本发明中，所述所述还原剂溶液中的还原剂优选为HAuCl4、柠檬酸钠、鞣酸和抗坏血酸中的一种或多种，更优选为HAuCl4。
在本发明中，所述还原剂溶液的摩尔浓度优选为0.1mol/L。
在本发明中，所述HAuCl4和所述还原剂反应得到的金单质与所述胺化的有机聚合物基底表面的氨基形成特异性吸附。
在本发明中，所述吸附金单质得到初始活化的有机聚合物基底，本发明优选对所述初始活化的有机聚合物基底进行后处理，得到所述活化的有机聚合物基底。在本发明中，所述后处理优选包括超声清洗。在本发明中，所述超声清洗使用的清洗剂优选为KSCN溶液，在本发明中，所述KSCN溶液的摩尔浓度优选为0.5mol/L。在本发明中，所述超声清洗的时间优选≥30min。本发明优选通过所述超声清洗去除所述有机聚合物表面非特异性吸附的金单质。
得到所述活化的有机聚合物基底后，本发明将所述活化的有机聚合物基底浸渍于镀金液中对所述金单质层进行化学镀金，得到镀金有机聚合物基底。
在本发明中，所述镀金液优选包括Na2SO3、甲醇和Na3Au(SO3)2。
在本发明中，所述镀金液中，所述Na2SO3的摩尔浓度优选为0.125mol/L。
在本发明中，所述镀金液中，所述甲醇的摩尔浓度优选为0.6mol/L。
在本发明中，所述镀金液中，所述Na3Au(SO3)2的摩尔浓度优选为8mmol/L。
在本发明中，所述化学镀金的温度优选为室温。
在本发明中，所述化学镀金的时间优选为2h。
得到所述镀金有机聚合物基底后，本发明在所述镀金有机聚合物基底表面的参比电极区域制备Ag/AgCl层，形成参比电极。
在本发明中，制备所述Ag/AgCl参比电极之前，本发明优选将所述镀金有机聚合物基底进行前处理，在本发明中，所前处理优选包括：依次进行清洗和干燥。在本发明中，所述清洗优选为：采用水冲洗所述镀金有机聚合物基底表面，在本发明中，所述水优选为去离子水。在本发明中，所述干燥优选为采用氮气吹干。
在本发明中，制备所述Ag/AgCl参比电极的方法优选包括以下步骤：
将所述银浆涂覆于所述镀金有机聚合物基底的参比电极区域，得到银涂覆参比电极；
将所述银涂覆参比电极浸渍于FeCl3溶液中孵育，得到所述Ag/AgCl参比电极。
在本发明中，所述涂覆银浆之前，本发明优选将所述镀金有机聚合物基底进行加热处理。在本发明中，所述加热处理的的温度优选为50℃，所述加热处理的时间优选为1h。
在本发明中，得到银涂覆参比电极后，本发明优选将所述银涂覆参比电极进行清洗后，再进行所述孵育。
在本发明中，所述清洗优选为：将所述银涂覆参比电极浸渍于所述清洗液中进行循环伏安法(CV)清洗。在本发明中，所述清洗的次数优选为2～3次，在本发明中，每次清洗时，所述清洗液优选为H2SO4溶液，所述H2SO4溶液的用量优选为30μL，所述H2SO4溶液的摩尔浓度优选为0.1mol/L。在本发明中，每次清洗时，循环圈数优选为10次。
本发明优选通过上述清洗去除所述银涂覆参比电极表面的杂质，同时对所述银涂覆参比电极进行活化。
在本发明中，所述孵育时使用的FeCl3溶液的摩尔浓度优选为0.1mol/L。在本发明中，所述孵育时使用的FeCl3溶液的体积优选为30μL。
在本发明中，所述孵育的时间优选为内1min。
得到所述Ag/AgCl参比电极后，本发明在所述镀金有机聚合物基底表面的工作电极区域电化学沉积普鲁士蓝，得到普鲁士蓝层。
在本发明中，所述电化学沉积使用的电化学溶液优选包括FeCl3、K3Fe(CN)6、KCl和HCl。
在本发明中，所述电化学溶液中FeCl3的摩尔浓度优选为2.5mmol/L。
在本发明中，所述电化学溶液中K3Fe(CN)6的摩尔浓度优选为2.5mmol/L。
在本发明中，所述电化学溶液中KCl的摩尔浓度优选为100mmol/L。
在本发明中，所述电化学溶液中HCl的摩尔浓度优选为100mmol/L。
在本发明中，所述电化学沉积的扫描速率优选为20mV/s。
在本发明中，所述电化学沉积的电压相对于Ag/AgCl参比电极优选为从-0.15V到0.3V。
在本发明中，所述电化学沉积的循环圈数优选为8～16次，更优选为14次。
在本发明中，所述电化学沉积后得到初始普鲁士蓝层。本发明优选对所述初始普鲁士蓝层进行后处理，得到所述普鲁士蓝层。本发明中，所述后处理优选包括清洗。在本发明中，所述清洗优选为：将所述初始普鲁士蓝层浸渍于所述清洗液中进行循环伏安法清洗。在本发明中，所述清洗的次数优选为2～3次，在本发明中，每次清洗时，所述清洗液优选为KCl/HCl溶液，所述KCl/HCl溶液溶液的用量优选为30μL，所述循环伏安法清洗时，扫描速率优选为50mV/s，循环电压相对于Ag/AgCl参比电极优选为从-0.2V到0.5V。
得到普鲁士蓝层后，本发明在所述普鲁士蓝层表面滴涂所述响应溶液，得到所述响应层，在所述工作电极区域形成工作电极；所述响应溶液包括乳酸氧化酶。
在本发明中，所述响应溶液中，所述乳酸氧化酶的量优选为2～5U/μL，更优选为3～4.5U/μL，进一步优选为4U/μL。
在本发明中，所述响应溶液优选还包括壳聚糖和/或碳纳米管。
在本发明中，所述响应溶液优选还包括壳聚糖和/或碳纳米管时，所述响应溶液的配置方法优选包括以下步骤：
将壳聚糖溶解在乙酸水溶液中，得到壳聚糖溶液；
将所述碳纳米管分散于所述壳聚糖溶液中，得到壳聚糖和碳纳米管混合液；
将所述壳聚糖和碳纳米管混合液与乳酸氧化酶溶液混合。
在本发明中，所述乙酸水溶液的质量百分含量优选为2％。
在本发明中，所述壳聚糖溶液的质量百分含量优选为1％。
在本发明中，所述分散优选为超声分散。
在本发明中，所述分散的时间优选为30min。
在本发明中，所述壳聚糖和碳纳米管混合液中，所述碳纳米管的质量浓度优选为2mg/mL。
在本发明中，所述乳酸氧化酶溶液优选为乳酸氧化酶的PBS缓冲液。
在本发明中，所述PBS缓冲液的pH优选为7。
在本发明中，所述PBS缓冲液的摩尔浓度优选为100mmol/L。
在本发明中，所述乳酸氧化酶溶液的质量浓度优选为20mg/mL。
在本发明中，所述壳聚糖和碳纳米管混合液与乳酸氧化酶溶液混合时的体积比优选为1:1。
在本发明中，所述滴涂优选在室温条件下进行。
在本发明中，所述滴涂所述响应溶液之后干燥的温度优选为室温。
在本发明中，得到所述响应层后，本发明优选还包括在所述响应层表面滴涂所述全氟磺酸溶液(Nafion溶液)，得到所述全氟磺酸层，在所述工作电极区域形成工作电极。
在本发明中，所述Nafion溶液的质量百分含量优选为0.5wt％。
在本发明中，所述Nafion溶液的用量优选为2.5μL。
在本发明中，滴涂所述Nafion溶液之后干燥的温度优选为室温。
在本发明中，所述乳酸生物传感器优选储存于4℃条件下备用。
本发明提供一种细胞活力电化学检测方法，包括以下步骤：
采用乳酸生物传感器检测活细胞培养基上清液稀释液的电流信号，获得电流响应值；
将所述电流响应值代入电流响应值和乳酸浓度的线性曲线中，得到所述活细胞培养基上清液的乳酸浓度；所述电流响应值和乳酸浓度的线性曲线为采用乳酸生物传感器检测不同已知乳酸浓度的标准乳酸溶液获得的线性曲线；
由所述活细胞培养基上清液的乳酸浓度获得活细胞的相对细胞活力；
所述乳酸生物传感器为上述技术方案所述的乳酸生物传感器或上述技术方案所述制备方法制备得到的乳酸生物传感器。
本发明采用乳酸生物传感器检测活细胞培养基上清液稀释液的电流信号，获得电流响应值。
在本发明中，所述活细胞培养基上清液具体优选为人肺癌细胞(A549)培养基上清液稀释液。
在本发明中，所述人肺癌细胞(A549)培养基上清液的制备方法优选包括以下步骤：
将人肺癌细胞(A549)在含有质量含量为10％肽牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中置于5％CO2的加湿培养箱中于37℃培养。培养48h后收集细胞上清液。为了检测不同培养环境细胞产生的乳酸，A549细胞以给定的细胞密度接种在96孔培养板中，待细胞贴壁后，吸去上清加入含有不同成分的培养基。培养1～7天，用显微镜观察细胞生长状态，同时收集细胞上清液。
在本发明中，得到细胞上清液后，本发明优选采用磷酸缓冲液(PBS)稀释所述细胞上清液，得到活细胞培养基上清液稀释液。
在本发明中，所述检测的电压优选为恒定电压。
在本发明中，所述检测的电压优选为0.1V。
在本发明中，所述电流响应值优选为将所述乳酸生物传感器置于活细胞培养基上清液中孵育150s后的电流相应值。
获得电流响应值后，本发明将所述电流响应值代入电流响应值和乳酸浓度的线性曲线中，得到所述活细胞培养基上清液的乳酸浓度；所述电流响应值和乳酸浓度的线性曲线为采用乳酸生物传感器检测不同已知乳酸浓度的标准乳酸溶液获得的线性曲线。
在本发明中，所述电流响应值和乳酸浓度的线性曲线的乳酸浓度范围为0.05～0.8mmol/L。
在本发明中，所述电流响应值和乳酸浓度的线性曲线为采用乳酸生物传感器检测不同已知乳酸浓度的标准乳酸溶液获得的线性曲线。
在本发明中，所述电流响应值和乳酸浓度的线性曲线的建立方法与所述乳酸生物传感器检测活细胞培养基上清液的过程相同，再次不再赘述。
得到所述活细胞培养基上清液的乳酸浓度后，本发明由所述活细胞培养基上清液的乳酸浓度获得活细胞的细胞活力。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例使用的原料和试剂来源具体如下：
氮气(99.99％纯度，杭州金工物资有限公司)；石英玻璃片(4cm×6cm,上海新沪光电材料有限公司，上海)；亚硫酸金钠溶液(Na3Au(SO3)2，50gAu/L，常州化工研究所)；乙二胺、硼氢化钠(NaBH4)、六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)、L-乳酸、nafion全氟树脂溶液、无水亚硫酸钠(Na2SO3)、D-葡萄糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)均购于Sigma-Aldrich(上海、美国)；氯金酸(HAuCl4)、甲醛、硫酸、甲醇、乙酸、盐酸、尿素、売聚糖、氯化钾、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠(K2HPO4)均购于国药集团化学试剂有限公司(上海)；硫氰化钾(KSCN，麦克林生化科技有限公司，上海)；银浆(维修佬，深圳)；单壁碳纳米管(中科时代纳米，成都)；200mmol/L磷酸盐缓冲液(生工生物工程股份有限公司，上海)；铁氰化钾(K3Fe(CN)6)；乳酸氧化酶(9028-72-2，上海源叶生物科技有限公司，上海)；乳酸检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，北京)；2-脱氧-D-葡萄糖(阿达玛斯试剂有限公司，上海)；RPMI-1640细胞培养基(生工生物工程上海有限公司，上海)；0.25％胰酶+0.02％EDTA溶液(浙江森瑞生物科技有限公司，浙江)；胎牛血清(Foetal BovineSerum，BiologicalIndustries，BI，以色列)；PBS溶液(Millipore 0.1μm滤膜两次过滤除菌，浙江森瑞生物科技有限公司，浙江)；dd H2O(双蒸水，康为世纪)；二甲亚砜(DMSO，BBI，美国)；ddp，CCK8试剂盒；细胞活力试剂；PTC专用培养基。
A549(人肺癌细胞，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，上海)；一次性灭菌注射器(5mL，上海米沙瓦医科工业有限公司，上海)；96孔板(康宁)；培养皿(PS材质，康宁，美国)；移液器枪头(Axygen，康宁生命科学有限公司，吴江)；针筒微孔滤膜过滤器(0.22μm，水系，上海兴亚净化材料厂，上海)；离心管(beckman，美国)；96孔低吸附(康宁，美国)。
无特殊说明，实验室用水均为浙江大学化学实验中心提供的去离子水，试剂均为分析纯。
实施例1
按照图1所示乳酸生物传感器示意图，将一块PS片材表面覆上镂空保护膜后暴露于8.8mW/cm2的紫外光(波长254nm)条件下4h；然后将其置于含有乙二胺和EDC的胺化溶液中胺化3h；之后，用HAuCl4和NaBH4处理PS基材成功地吸附金纳米颗粒，然后在0.5mol/LKSCN溶液中超声处理30min以去除非特异性吸附；最后，将活化的PS置于含有0.125mol/LNa2SO3、0.6mol/L甲醇和8mmol/LNa3Au(SO3)2的镀金液中化学镀2h；用去离子水冲洗并用氮气吹干后，将镀金PS片在50℃条件下加热1h后，将银浆涂在镀金PS片的参比电极区域上，然后通过循环伏安法从0.2V到1.2V以1V/s的扫描速率在30μL、0.1mol/L的H2SO4溶液中清洗2～3次，每次清洗循环10个循环，以去除杂质并活化电极，然后将涂有Ag的电极浸入30μL、0.1mol/LFeCl3溶液中并孵育1min获得Ag/AgCl参比电极；
在含有2.5mmol/L FeCl3、2.5mmol/L K3Fe(CN)6、100mmol/L KCl和100mmol/L HCl的电化学溶液中，以20mV/s的扫描速率，通过循环伏安法从-0.15V到0.3V(相对于Ag/AgCl)循环14次将一层PB沉积到金电极上，得到PB层；
将PB层电极在30μL的100mmol/L KCl/HCl溶液中以50mV/s的扫描速率通过循环伏安法从-0.2V到0.5V(相对于Ag/AgCl)2～3个循环清洁电极；
将壳聚糖溶解在2％的乙酸水溶液中，磁力搅拌约1h，制备得到1％壳聚糖溶液；通过超声搅拌30min将壳聚糖溶液与单壁碳纳米管混合以制备壳聚糖和碳纳米管的混合溶液，壳聚糖和碳纳米管的混合溶液中，单壁碳纳米管的质量浓度为2mg/mL，将壳聚糖和碳纳米管溶液与质量浓度为20mg/mL的乳酸氧化酶溶液(溶剂为pH＝7.0，100mM PBS缓冲液)以1:1(体积比)的比例充分混合，得到响应溶液，响应溶液中，乳酸氧化酶的酶量为4U/μL；
将0.6μL乳酸氧化酶溶液(响应溶液)，酶量为2.4U，滴涂在PB层电极的工作电极区域金电极表面上，在室温环境条件下晾干电极后得到响应层，将2.5μL的0.5wt％nafion溶液滴涂在响应层上之后在室温条件下干燥，得到乳酸生物传感器，将乳酸生物传感器储存在4℃备用。
对比例1
与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：电极图案的形状如图35所示。
通过比较实施例1和对比例1制得的乳酸生物传感器的信号稳定性，发现：对比例1制备的传感器在连续监测的稳定时长明显低于实施例1。表明本发明实施例制备的乳酸传感器通过改进传感器的结构提高了传感器的稳定性。
实施例2
与实施例的制备方法基本相同，不同之处在于，电化学沉积所述普鲁士蓝层时，循环次数为8次。
实施例3
与实施例的制备方法基本相同，不同之处在于，电化学沉积所述普鲁士蓝层时，循环次数为12次。
实施例4
与实施例的制备方法基本相同，不同之处在于，电化学沉积所述普鲁士蓝层时，循环次数为16次。
实施例5
与实施例的制备方法基本相同，不同之处在于，滴涂了0.3uL乳酸氧化酶溶液，酶量为1.2U。
实施例6
与实施例的制备方法基本相同，不同之处在于，滴涂了0.9uL乳酸氧化酶溶液，酶量为3.6U。
对比例2
与实施例的制备方法基本相同，不同之处在于，乳酸氧化酶的酶量为0U。
测试例1
对实施例1～4制备的乳酸生物传感器的电化学性能进行检测，采用电化学沉积制备普鲁士蓝层时，循环圈数越多，鲁士蓝层的量越大。由图2所示，电极沉积PB的过程中氧化峰电流会随着扫描的循环圈数逐步提升，当循环圈数达到12圈(实施例3)时，氧化峰电流变化率会有明显的减小，循环圈数为14圈的时候，实施1制备的乳酸生物传感器的测量范围较前面有个明显的提升，继续增加扫描次数，传感器的测量范围会有一个较小的提升，但是金电极的耐受会受到更大的压力(如图3所示)，因此，综合考虑选取14圈最佳方案。
测试例2
对实施例1、实施例5、实施例6和对比例1制备的乳酸生物传感器的电化学性能进行检测，如图4所示，随着滴涂酶量的增加，乳酸生物传感器的灵敏度随之增加；当滴涂的酶量达到3.6U(实施例6)时，乳酸生物传感器的测量范围有了一定的受限，可能是因为3.6U的酶量达到了传感器工作电极的饱和吸附量，综合考虑选用2.4U的酶量作为最佳方案。
测试例3
采用实施例1制备的乳酸生物传感器对0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L和0.8mmol/L的标准乳酸溶液进行电化学测试。测试结果如图5所示，实施1制备的乳酸生物传感器的表现出不同的电化学响应。在图6中以误差棒的形式绘制了标准曲线，电流信号与浓度为0.05～0.8mmol/L范围内的乳酸表现出良好的线性关系，相关系数为0.9991。基于线性拟合的斜率，实施例1制备的乳酸生物传感器的灵敏度计算为0.411μA·mM-1，检测限为8.5μM(S/N＝3)。
测定实施1制备的乳酸生物传感器在0.3mmol/L的常见代谢成分的电化学响应，常见代谢成分包括葡萄糖(GLU)、尿酸(UA)、对乙酰氨基酚(AP)、尿素(UREA)、多巴胺(DA)和抗坏血酸(AA)。测试结果如图7所示，实施例1制备的乳酸生物传感器展示出较为优秀的选择性，上述代谢物均没有显著的信号。
测试例4
将实施例1制备的乳酸生物传感器在3周的时间内评估长期稳定性，结果如图8所示，实施例1制备的乳酸生物传感器相对稳定。实施例1制备的乳酸生物传感器可以在长达2000s的时间内维持十分稳定的电化学响应(图9)。实施例1制备的乳酸生物传感器具有良好的重现性和长期稳定性可能归功于壳聚糖、碳纳米管和nafion，它们吸附并稳定了乳酸氧化酶。
图10和图11为按照实施例1提供的方法分不同批次制备了多个乳酸传感器，如图10和图11，同一批次的传感器展现出相同的测试范围以及相似的灵敏度，而不同的批次的传感器的灵敏度展现出些许的差异，这也许与传感器制备的环境变化相关。
测试例5
对实施例1制备的乳酸生物传感器进行pH值和温度性能测试。此外，以实施例1制备的乳酸生物传感器pH值为7，温度为25℃为参，本发明研究了pH值和温度对实施例1制备的乳酸生物传感器测量的影响，结果如图12和13所示，如图12所示，当实施例1制备的乳酸生物传感器的环境的pH值从5变化到8时，观察到灵敏度有所增加，在pH值为7附近变化较小，当PH从7变化到8，传感器灵敏度变化为5％。在温度影响的实验中，加热模块采用PCR仪(MGL96G/Y，LongGene，杭州，中国)调节温度，红外温度计(GM320，BENETECH，深圳，中国)用于在检测前确认测试溶液的温度。由图13可知，温度对实施例1制备的乳酸生物传感器有显着影响，电流随着温度升高稳步攀升。这可能是由根据温度改变乳酸氧化酶的活性。
测试例6
采用实施例1制备的乳酸生物传感器进行A549药敏实时监测，鉴于实施例1制备的乳酸生物传感器在无细胞培养基中具有理想的电化学性能，本发明进一步探索了实施例1制备的乳酸生物传感器在准确检测活细胞培养基中乳酸方面的实际医学应用。如图14所示，本发明首先收集培养了48h的A549细胞上清，分别用市售的乳酸检测试剂盒以及实施例1制备的乳酸传感器进行测试。根据图7中的标准曲线计算出确切乳酸浓度，从基于乳酸氧化酶的电化学分析中测得的值与检测试剂盒获得的值相当。值得注意的是，使用这种电化学方法记录电流响应所需的时间仅为几分钟，远快于试剂盒的检测方法，这表明我们的方法可以用于肿瘤细胞生长体系的乳酸检测。
为了进一步证明实施例1制备的乳酸生物传感器替代CCK8的合理性，如图15，本发明分别将一定密度A549细胞与培养基、含有5mM葡萄糖的培养基、含有5mM 2-DG的培养基进行孵育。48h后分别检测了细胞上清的乳酸浓度以及相应的细胞活力。结果显示在2-DG存在时，A549细胞活力受到了一定的抑制，同时其分泌的乳酸大大减少,这是因为2-DG抑制了肿瘤细胞的糖酵解，降低了代谢速率；而葡糖糖的存在对细胞的代谢有一定的促进作用，可能是因为培养基原有的葡糖糖的存在，额外的葡萄糖对细胞代谢的影响并不明显。总的来说，乳酸浓度的改变和细胞活力的改变趋于一致。
如图16所示，为了实时监测肿瘤细胞活力的变化，本发明分别在24h、48h、72h、96h、120h检测了生长在含有不同浓度DMSO的培养基细胞上清，可以看出在不同时间点，含1％DMSO的培养基细胞上清的乳酸水平和空白相当，而含有高浓度DMSO的培养基细胞上清乳酸水平显著低于空白。24h后，随着时间的推移，可以发现含有高浓度DMSO的细胞培养基上清乳酸水平几乎不变，而含有低浓度DMSO的细胞培养基先增长后趋于平稳，这证明了高浓度DMSO的强大细胞杀伤性，与报道DMSO的药敏实验结果相当。但是所有样本的乳酸浓度在72h后并没有显著的变化，这可能与培养环境恶化导致的细胞衰亡相关。同时如图17，本发明做了含有6μM DDP的A549细胞培养上清的实时监测，发现其上清乳酸浓度较空白有一定的降低，但远高于含有高浓度DMSO的细胞培养上清，这与显微镜观察的细胞生长状态较为一致。总的来说乳酸检测可以用来实时监测肿瘤细胞的生长状态。
测试例7
为了研究实施1制备的乳酸生物传感器的PTC的药敏评价效果，如图18所示，本发明将成球的PTC接种在低吸附96孔板中，显微镜结果显示PTC生长分三个周期，生长期、稳定期、衰亡期，本发明同时测定了其在2d、14d、24d的细胞活力，发现其在生长期、稳定期的细胞活力表现的相对稳定(如图19所示)，药效也需要一定时间才能体现，所以本发明最后选择7d作为药敏结果的观察期。
本发明成功构建了20例来自不同癌症的病人的PTC模型，并将其接种在含有不同药物的培养基中。我们通过光学成像、细胞活力检测对PTC的生长状态进行了评估，如图20～23，结果显示，对于来自胃癌的PTC1、PTC2，从两个不同维度测得的结果不尽相同，但有着较为明显的关联，综合评估才能得到较为准确的结果，但是由于原代肿瘤细胞的数量有限，细胞活力的实时监测很难实现，所以乳酸检测作为新的能够代替细胞活力的实时监测的方法值得期待。如图24～30，对于PTC1、PTC2和PTC3，乳酸可以很好地评估其在不同浓度药物条件下的细胞活力变化，与细胞活力有着较强的相关性，如图其线性相关性都可以达到0.9以上，基于此乳酸检测可以在一定程度上用来评估药物的IC50，不过用乳酸检测得到药物的IC50较细胞活力判断的较大，这是因为乳酸测定的是一个平均代谢速率，而细胞活力测定的是瞬时代谢速率，当我们缩短检测时间就会缩小其差别。除了确定对于不同患者药物治疗的IC50，乳酸还能筛选出治疗特定患者的最适药物，如图，我们成功培养了来自胃癌、肾癌、胰腺癌、软组织肉瘤癌的PTC4-PTC8，不同癌种来源的PTC表现出了较高的异质性。图31～34比较了不同样本的乳酸和细胞活力检测的药敏结果，从图中看出两者显示出很高的一致性，这证明了可以通过监测细胞培养液中的乳酸水平来评估肿瘤细胞的活力，乳酸检测可以代替细胞活力测试，在体外肿瘤药敏实验中具有普适性。本发明提供的乳酸生物传感器展示了复杂生物样品中乳酸检测所需的一系列有利特性，包括高选择性、抗干扰能力、长期稳定性和可重复性。本发明提供的乳酸生物传感器能够准确量化不同细胞系复杂培养基中广泛浓度范围的乳酸，检测时间大大低于商用试剂盒。本发明提供的乳酸生物传感器可以用来检测不同药物条件的PTC的乳酸平均分泌速率以来代替细胞活力的检测，可以和光学成像手段连用实时监测PTC的生长状态，因此更好地针对不同患者来制定最佳治疗方案。此外，本发明提供的乳酸生物传感器对来自不同癌症的PTC都具有普适性。总之，本发明提供的乳酸生物传感器为PTC的药敏监测提供了一种有前途的传感工具，有可能适用于病人个性化治疗方案的制订。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种乳酸生物传感器，其特征在于，包括有机聚合物基底和设置于所述有机聚合物基底表面的电极图案，所述电极图案包括工作电极、金对电极和参比电极；所述电极图案中，所述工作电极包括第一工作区(2-3)、第一接线端(2-2)和连接两者的第一导线(2-1)；
所述金对电极包括第二工作区(1-3)、第二接线端(1-2)和连接两者的第二导线(1-1)；
所述参比电极包括第三工作区(3-3)、第三接线端(3-2)和连接两者的第三导线(3-1)；
所述第一工作区(2-3)形状为圆形；
所述第二工作区(1-3)的形状为3/4圆环，所述3/4圆环环绕于所述第一工作区(2-3)圆外周并存在间隙；
所述第三工作区(3-3)形状为正方形；所述第三工作区(3-3)设置于所述第一工作区(2-3)外侧并位于所述3/4圆环的缺口处；
所述第三工作区(3-3)为层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层和Ag/AgCl层，所述第一工作区(2-3)包括依次层叠设置于所述有机聚合物基底表面的金单质层、普鲁士蓝层和响应层；所述响应层的组成包括乳酸氧化酶；所述参比电极中的金单质层与所述工作电极的金单质层均与所述有机聚合物基底接触。
2.根据权利要求1所述的乳酸生物传感器，其特征在于，所述响应层的组成还包括壳聚糖、碳纳米管、石墨烯、金属有机框架材料、共价有机框架材料和金属纳米颗粒中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的乳酸生物传感器，其特征在于，所述响应层的组成还包括壳聚糖和碳纳米管时，所述壳聚糖、所述碳纳米管和所述乳酸氧化酶的质量之比为1:0.2:2。
4.根据权利要求1所述的乳酸生物传感器，其特征在于，所述响应层中所述乳酸氧化酶的酶量为0.1～3.6U。
5.根据权利要求1所述的乳酸生物传感器，其特征在于，所述第一工作区(2-3)还包括设置于所述响应层表面的全氟磺酸层。
6.权利要求1～5任一项所述乳酸生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
按照预定的电极图案采用紫外光曝光有机聚合物基底相应的区域，形成表面改性区域，得到表面改性的有机聚合物基底，所述电极图案的区域包括工作电极的区域、对电极的区域和参比电极的区域；
将所述表面改性的有机聚合物基底浸渍于所述胺化溶液对所述表面改性区域进行胺化改性，得到胺化的有机聚合物基底，所述胺化溶液包括乙二胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
将所述胺化的有机聚合物基底依次浸渍于HAuCl4溶液中和还原剂溶液中，在胺化改性区域表面形成金单质层，得到活化的有机聚合物基底；
将所述活化的有机聚合物基底浸渍于镀金液中对所述金单质层进行化学镀金，得到镀金有机聚合物基底；
在所述镀金有机聚合物基底表面的参比电极区域制备Ag/AgCl层，形成参比电极；
在所述镀金有机聚合物基底表面的工作电极区域电化学沉积普鲁士蓝，得到普鲁士蓝层；
在所述普鲁士蓝层表面滴涂响应溶液，得到所述响应层，在所述工作电极区域形成工作电极；所述响应溶液包括乳酸氧化酶。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，得到所述响应层后，还包括在所述响应层表面滴涂全氟磺酸溶液，得到所述全氟磺酸层。
8.一种细胞活力电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用乳酸生物传感器检测活细胞培养基上清液稀释液的电流信号，获得电流响应值；
将所述电流响应值代入电流响应值和乳酸浓度的线性曲线中，得到所述活细胞培养基上清液的乳酸浓度；所述电流响应值和乳酸浓度的线性曲线为采用乳酸生物传感器检测不同已知乳酸浓度的标准乳酸溶液获得的线性曲线；
由所述活细胞培养基上清液与对照样本的乳酸浓度归一化获得活细胞的细胞活力；
所述乳酸生物传感器为权利要求1～5任一项所述的乳酸生物传感器或权利要求6或7所述制备方法制备得到的乳酸生物传感器。
9.根据权利要求8所述的电化学检测方法，其特征在于，所述乳酸生物传感器的检测限为8.5μmol/L。
10.根据权利要求8所述的电化学检测方法，其特征在于，所述线性曲线的线性范围为0.05～0.8mmol/L。
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