CN105116028A - 石墨烯修饰的乳酸生物传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石墨烯修饰的乳酸生物传感器，包括：基板，平行设置于所述基板上的参比电极、对电极和工作电极、包覆于所述参比电极、对电极和工作电极的部分表面上的绝缘层，所述绝缘层与所述参比电极、对电极和工作电极的裸露部分围成反应腔，所述的工作电极包括碳糊导线、石墨烯层和酶液层，所述石墨烯层覆盖在碳糊导线的反应区上；所述的酶液层位于反应腔内结合在石墨烯层上，并且所述的酶液层中包含乳酸氧化酶和酶活性添加剂。该乳酸生物传感器不依赖于电子传递剂、成本低、灵敏度高、抗干扰性好的微型化的乳酸传感器，可以快速而准确测量人体血清中的乳酸含量。

Description

石墨烯修饰的乳酸生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种石墨烯修饰的乳酸生物传感器及其制备方法。

背景技术

乳酸是糖类代谢的中间产物。血液中乳酸的含量检测能揭示某些疾病的严重程度，当人体组织缺氧或者患有某些肝脏疾病，就会引起血液中乳酸浓度的增加。血液中乳酸的含量检测还能帮助指导运动员进行合理训练，人体血液中正常的乳酸浓度是1.2～2.7mmol/L，但激烈运动后浓度可以达到25mmol/L。以上特性使得乳酸可以作为临床和运动医学中的相关指示，因此快速、简便、准确的测定血液中的乳酸含量是非常重要的。

乳酸生物传感器一般为电流型酶传感器，采用乳酸氧化酶作为生物敏感物质，以人工电子传递剂如铁氰化钾来增强传感器的响应电流。

近年来，丝网印刷技术成为大规模生产电流型酶传感器的主要技术之一。通过丝网印刷技术可以廉价地在塑料基板上制作基底电极，极大地方便了电流型酶传感器的生产。同时，丝网印刷技术的引入，能够让工作电极、对电极和参比电极同时集成在很小的范围内，通常只需要一滴溶液便可以进行分析检测，这使得采样量大大缩减。

在生物传感器的应用中，蛋白质或酶的活性中心和电极可以被看作一对电子受体-供体，因此只有当活性中心处于电极表面足够近的区域时，才能发生直接电子转移。但是，对多数氧化还原蛋白质或酶，其活性中心通常被包埋在非导电的蛋白结构中，阻碍了电子的转移，从而影响了生物传感器的准确度和灵敏度。

发明内容

本发明提供了一种石墨烯修饰的乳酸生物传感器及其制备方法，该乳酸生物传感器不依赖于电子传递剂、成本低、灵敏度高、抗干扰性好，可以快速而准确测量人体血清中的乳酸含量。

一种石墨烯修饰的乳酸生物传感器，包括：

基板；

平行设置于所述基板上的参比电极、对电极和工作电极；

包覆于所述参比电极、对电极和工作电极的部分表面上的绝缘层，所述绝缘层与所述参比电极、对电极和工作电极的裸露部分围成反应腔，其特征在于，所述的工作电极包括碳糊导线、石墨烯层和酶液层，所述石墨烯层覆盖在碳糊导线的反应区上；

所述的酶液层结合在石墨烯层上，并且所述的酶液层中包含乳酸氧化酶和酶活性添加剂。

由于石墨烯具有优异的电子传递性能，本发明将酶液层结合到石墨烯层上后，利用石墨烯充当电极表面和酶的氧化还原中心的导电元件，从而实现电流型酶传感器的直接电子传递，提高了整个乳酸生物传感器的灵敏度高，并且抗干扰性好，可以快速而准确测量人体血清中的乳酸含量。

作为优选，所述的石墨烯层的材料为羧基石墨烯或氧化石墨烯。这两种石墨烯价格便宜，并且具有较好的电子传递性能。

所述的酶活性添加剂包括增活剂和/或保活剂；

所述的增活剂采用钙离子、柠檬酸或邻苯二甲酸缓冲液；

所述的保活剂为海藻糖、壳聚糖和牛血清白蛋白中的至少一种。增活剂的加入有利于提高乳酸生物传感器的灵敏度，保活剂的加入使乳酸生物传感器更便于保存。

水合渗透性能也是影响所述的乳酸生物传感器性能的重要参数，作为优选，所述的酶液层中还包含亲水高分子；

所述的亲水高分子包括羧甲基纤维素、十二烷基苯磺酸钠、TritonX-100、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶及其衍生物、十二烷基三甲基溴化铵中的至少一种。这些亲水高分子可以有效地提高酶液层的水合渗透性能，进一步提高检测速率和灵敏度。

作为优选，所述的参比电极由银导线和镀于其表面的氯化银镀层组成，所述的氯化银镀层位于反应腔内；

所述的对电极为碳糊电极。

作为优选，所述的反应腔的开口覆盖有亲水层，所述的亲水层上开设有用于进样的毛细孔。待测液滴在该毛细孔上，即可进行测量。

本发明还提供了一种所述的乳酸生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用丝网印刷方法或薄膜蒸涂技术在基板上形成一根银导线和两根碳糊导线；

(2)在银导线和碳糊导线上覆盖带有开口的绝缘层，开口部分形成反应腔；

(3)采用电镀的方法在银导线的裸露表面上镀上氯化银形成参比电极；

(4)将石墨烯悬浊液滴加在一根碳糊导线的裸露表面上，避光干燥后得到石墨烯层；

(5)步骤(4)得到的石墨烯层在氯化钠溶液中进行电化学还原，并在活化液中进行活化；

(6)将酶溶液滴加在活化后的石墨烯层上，避光干燥得到工作电极；

(7)在绝缘层的表面进一步覆盖上亲水层，得到所述的乳酸生物传感器。

该制备方法操作简便，乳酸生物传感器的性能容易控制，便于工业化生产。

步骤(5)中，所述的氯化钠溶液的浓度为0.1～0.3M，所述的活化液为羧基活化液。

步骤(6)中，所述的酶溶液采用点涂的方法滴加在所述的石墨烯层上。

同现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明生物传感器采用还原石墨烯修饰电极，其中石墨烯充当电极表面和乳酸氧化酶的氧化还原中心的导电元件，从而实现乳酸氧化酶传感器的直接电子传递，大大降低电子传递剂引入的检测干扰。

2、将乳酸氧化酶通过共价结合的方式固定在石墨烯上，防止了乳酸氧化酶在反应过程脱落污染待测液。

3、采用丝网印刷电极作为基底电极，实现传感器的微型化和集成化，便于携带，操作简便。

4、采用三电极结构，可以有效避免电化学交互反应，三电极结构中，参比电极与对电极分开，在工作电极表面生成的氢氧根离子在对电极上被氧化，避免了氢氧根对电极环境的污染，延长传感器的使用寿命。

附图说明

图1为本发明生物传感器的结构示意图；

图2为图1所示的生物传感器的A-A剖面图；

图3为图1所示的生物传感器的B-B剖面图；

图4为图1所示的生物传感器的C-C剖面图；

图5为实施例1所得乳酸传感器对乳酸的循环伏安曲线以及其对应的电流-浓度校正曲线；

图6为修饰了石墨烯的乳酸传感器和未修饰的乳酸传感器对乳酸溶液的电流-浓度响应曲线对比图。

具体实施方式

如图1所示，本发明的石墨烯修饰的乳酸生物传感器，包括基板1、位于基板1上的参比电极2、对电极3和工作电极4。参比电极2、工作电极4和对电极3相互平行设置在基板1上，参比电极2位于工作电极4一侧，对电极3位于工作电极4另一侧。

图2是图1所示的生物传感器的A-A剖面图，即对电极3的结构示意图，如图2所示，对电极3由碳糊导线3a和碳糊电极3b组成。

图3是图1所示的生物传感器的B-B剖面图，即工作电极4的结构示意图，如图3所示，工作电极4由碳糊导线4a、石墨烯层4b和酶液层4c组成。

图4是图1所示的生物传感器的C-C剖面图，即参比电极(2)的结构示意图，如图4所示，参比电极2由银导线2a和镀有银/氯化银电极2b组成。

绝缘层5覆盖在参比电极2、工作电极3和对电极4上，并设有使参比电极2的银/氯化银电极2b、工作电极4的反应区和对电极3的碳糊电极裸露的开口，形成反应腔体6，在绝缘层5的上表面用胶体8固定了亲水层7。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

本发明的石墨烯修饰的乳酸生物传感器的制备步骤如下：

(1)采用丝网印刷的方法，用银浆在聚丙烯基板上印上如图1所示的参比电极的银导线，所用的网布为420目，网距为1.5mm，刮板硬度为80°，刮板角度为64.3°，刮板速度为8mm/s，刮板压力为4kg/cm²，印刷完毕将基板在烘箱里避光干燥2min，烘箱温度50℃，形成干燥的银导线；

(2)采用丝网印刷的方法，用碳浆在聚丙烯基板上印上如图1所示的工作电极的碳糊导线和对电极，所用的网布为420目，网距1.5mm，刮板硬度80°，刮板角度64.3°，刮板速度8mm/s，刮板压力4kg/cm²，印刷完毕将基板在烘箱里避光干燥2min，烘箱温度50℃，形成干燥的工作电极的碳糊导线和对电极；

(3)在基底上印刷绝缘材料，绝缘材料覆盖参比电极、工作电极和对电极区域的外周部分，并使银导线、工作电极和对电极的反应区域裸露，所用的网布为420目，网距1.5mm，刮板硬度80°，刮板角度64.3°，刮板速度8mm/s，刮板压力4kg/cm²，印刷完毕将基板在烘箱里避光干燥4min，烘箱温度50℃，形成绝缘层；

(4)将银膜部分浸入饱和氯化钠溶液中，将参比电极的引线与铂电极和恒压源构成回路，在参比电极和铂电极之间加0.2V电压，通电60s后形成氯化银镀层，得到参比电极，并用去离子水清洗干净，自然避光干燥；

(5)将5μL的1mg/L羧基石墨烯悬浊液滴加在工作电极的反应区域上，进行避光干燥；

(6)将干燥后的石墨烯基底电极浸入0.2M氯化钠溶液，石墨烯电极、标准银/氯化银参比电极和铂对电极构成三电极体系，采用循环伏安法扫描，扫描电位0.7V～-0.9V，扫速0.1V/s，还原后将石墨烯基底电极在pH7.4的磷酸盐缓冲液中浸洗；

(7)将还原后的石墨烯工作电极在羧基活化液中浸泡50min，羧基活化液中含有10mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与15mM的N-羟基琥珀酰亚胺，活化后将电极在pH7.4的磷酸盐缓冲液中浸洗；

(8)将300U/mL的乳酸氧化酶、24mg/mL的海藻糖和2.5mg/mL羧甲基纤维素溶解在磷酸盐缓冲液中(pH7.4，含0.1M氯化钠)，制得酶溶液；

(9)在活化后的石墨烯工作电极上滴加3微升制备好的酶溶液，避光干燥，在反应腔体上覆盖亲水膜，制得石墨烯修饰的乳酸生物传感器；

在制得的乳酸传感器上滴加30μL待测液，外接的测试装置分别于参比电极、工作电极、对电极的引线相连形成测试回路。采用循环伏安法进行测定。分别测试不同乳酸浓度(2mM、4mM、6mM、8mM、10mM)时电极的循环伏安曲线，得到的结果如图5所示。从图中可以看出，乳酸氧化酶的还原峰电流随着乳酸浓度的增加而减小，它的反应机理为：

LOD_red+O₂→LOD_ox+H₂O₂

在溶解氧的存在下，LOD_ox的产生导致还原峰电流的增加。当乳酸浓度增加时，电催化反应就受到酶催化反应的影响，如下述等式LOD_ox的浓度减小：

Lactate+LOD_ox→pyruvate+LOD_red

因此，还原峰电流随着乳酸浓度的增大而减小。

取-0.5V电压处的电流值做出电流-浓度响应曲线，结果如图6所示。

对比例1

该对比例的结果与实施例1的操作基本相同，不同之处在于，工作电极中无石墨烯层，即省略了步骤(5)～(7)，得到无石墨烯修饰的乳酸生物传感器，取-0.5V电压处的电流值做出电流-浓度响应曲线，结果如图6所示。

由图6可知，由于石墨烯层的存在，乳酸生物传感器的检测灵敏度大幅度上升。

Claims (8)

1.一种石墨烯修饰的乳酸生物传感器，包括：

基板；

平行设置于所述基板上的参比电极、对电极和工作电极；

包覆于所述参比电极、对电极和工作电极的部分表面上的绝缘层，所述绝缘层与所述参比电极、对电极和工作电极的裸露部分围成反应腔，其特征在于，所述的工作电极包括碳糊导线、石墨烯层和酶液层，所述石墨烯层覆盖在碳糊导线的反应区上；

所述的酶液层结合在石墨烯层上，并且所述的酶液层中包含乳酸氧化酶和酶活性添加剂。

2.根据权利要求1所述的乳酸生物传感器，其特征在于，所述的石墨烯层的材料为羧基石墨烯或氧化石墨烯。

3.根据权利要求1所述的乳酸生物传感器，其特征在于，所述的酶活性添加剂包括增活剂和/或保活剂；

所述的增活剂包括钙离子、柠檬酸或邻苯二甲酸缓冲液；

所述的保活剂为海藻糖、壳聚糖和牛血清白蛋白中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的乳酸生物传感器，其特征在于，所述的酶液层中还包含亲水高分子；

所述的亲水高分子包括羧甲基纤维素、十二烷基苯磺酸钠、TritonX-100、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶及其衍生物和十二烷基三甲基溴化铵中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的乳酸生物传感器，其特征在于，所述的参比电极由银导线和镀于其表面的氯化银镀层组成，所述的氯化银镀层位于反应腔内；

所述的对电极为碳糊电极。

6.根据权利要求1所述的乳酸生物传感器，其特征在于，所述的反应腔上覆盖有亲水层，所述的亲水层上开设有用于进样的毛细孔。

7.一种如权利要求1～6任一项所述的乳酸生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用丝网印刷方法或薄膜蒸涂技术在基板上形成一根银导线和两根碳糊导线；

(2)在银导线和碳糊导线上覆盖带有开口的绝缘层，开口部分形成反应腔；

(3)采用电镀的方法在银导线的裸露表面上镀上氯化银形成参比电极；

(4)将石墨烯悬浊液滴加在一根碳糊导线的裸露表面上，避光干燥后得到石墨烯层；

(5)步骤(4)得到的石墨烯层在氯化钠溶液中进行电化学还原，并在活化液中进行活化；

(6)将酶溶液滴加在活化后的石墨烯层上，避光干燥得到工作电极；

(7)在绝缘层的表面进一步覆盖上亲水层，得到所述的乳酸生物传感器。

8.根据权利要求7所述的乳酸生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的酶溶液采用点涂的方法滴加在所述的石墨烯层上。