CN102680550A - 基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极及其制备方法 - Google Patents

基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极及其制备方法 Download PDF

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吕珺
吴玉程
郑治祥
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本发明公开了一种基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极，由上至下依次由包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列（1）、导电层（2）、导电胶（3）和支撑电极（4）构成。本发明可明显提高酶的有效固载量及与待测溶液的接触面积，从而提高生物传感器的灵敏度和检测极限。

Description

基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极及其制备方法
一、技术领域
本发明涉及一种基于导电聚合物一维纳米阵列的电化学生物传感器用的酶电极，涉及电化学分析技术领域，具体涉及一种采用模板法合成的导电聚合物一维纳米阵列并包埋生物酶制成基于导电聚合物一维纳米阵列的电化学生物传感器用酶电极的制备技术及检测方式。
二、背景技术
采用生物活性酶（如硝酸还原酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶等）作为敏感元件，制得的酶电极生物传感器相比较普通电化学传感器具有高度选择性，抗干扰能力强，已在临床诊断、环境检测、食品和药物检测及生物技术等方面得到广泛的应用。
制作酶生物传感器最为关键的部分就是生物酶在电极上的固定，目前常用的酶的固定方式有四种：共价键合固定法、胶囊固定法、物理吸附法和电化学聚合包埋法。其中电化学聚合包埋法可将酶及其他辅酶、介体包埋于高分子膜（聚吡咯、聚苯胺等）内固定在电极表面，具有快捷、可控、便于实现自动化操作的特点，尤其适合于生物传感器的微型化构造，是近年来快速发展的聚合物包埋技术。S.B.Adeloju的研究小组利用聚吡咯包埋法制备各种酶电极电位法生物传感器，用于检测溶液中磷酸盐、硝酸盐、葡萄糖、硫酸盐、尿酸等成分。
这种基于聚合物膜的生物传感器为了增大酶的有效负载量，势必增大膜的厚度或者增大单位体积内酶的浓度，这二者都会对膜的导电性产生不利影响，而利用纳米材料巨大的比表面积则可有效解决这一问题。纳米材料由于比表面积大、表面反应活性高、表面原子配位不全等导致表面活性位点增加，催化效率提高、吸附能力增强，为生物传感器性能的提升提供了新的研究途径。专利号为ZL03257848.2的发明专利《生物传感器用的生物酶电极》采用纳米颗粒改善基质包埋层，能一定程度提高基质的导电性能，进而提高酶电极的检测灵敏度。但其仍然局限在薄膜传感器范畴之类，未能实际有效提高酶固载量和表面积。
三、发明内容
本发明旨在提供一种基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极及其制备方法，所要解决的技术问题是增加聚合物膜电极的接触面积、提高生物酶的固载量，从而提高酶电极的检测灵敏度并拓宽酶电极的检测范围。
本发明解决该技术问题采用如下技术方案：
本发明基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极，由上至下依次由包埋生物
酶的导电聚合物一维纳米阵列1、导电层2、导电胶3和支撑电极4构成。
所述生物酶选自葡萄糖氧化酶、硝酸还原酶、磷酸化酶、亚硫酸氧化酶、胆固醇氧化酶或辣根过氧化酶；
所述导电聚合物选自聚吡咯（PPy）、聚苯胺（PAn）或聚噻吩（PT）。
所述导电层选自金、银或铂；导电层可通过真空蒸镀或电化学沉积的方法制备得到；
所述导电胶选自导电银浆或导电金浆；
所述支撑电极选自金电极、铂电极、玻碳电极或碳纸电极。
本发明基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极的制备方法，包括多孔氧化铝模板（AAO）的制备和包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列的制备各单元过程，其特征在于：
所述多孔氧化铝模板的制备是以草酸溶液为电解液，以高纯铝箔为阳极，以石墨电极为阴极，采用二次阳极氧化法（50V，6h）制备得到多孔氧化铝模板（X.Y.Zhang,D.Li,L.Bourgeois,et al.Direct electrodeposition of Porous Gold Nanowire Arrays for Biosensing Applications,ChemPhysChem,2009,10(2):436-441.）；
所述包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列的制备是在多孔氧化铝模板的背面沉积导电层2，然后通过导电胶3将导电层2和支撑电极4粘接固定后作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt/Ti电极作为对电极，电解液为导电聚合物单体、生物酶和支撑电解质的混合溶液，混合溶液中导电聚合物单体的质量浓度为0.01-0.5mol/L，生物酶的浓度为1-1000U/mL，支撑电解质的浓度为0.05-0.5mol/L，采用恒电流法在多孔氧化铝模板内生长包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列，电流密度为0.05-0.5mA/cm2，聚合反应时间为100-1000s，随后置于0.3-0.8mmol/L的NaOH溶液或磷酸溶液中浸泡10-20min去除多孔氧化铝模板，得到基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极；
所述导电聚合物单体选自吡咯单体、苯胺单体或噻吩单体；
所述生物酶选自葡萄糖氧化酶、硝酸还原酶、磷酸化酶、亚硫酸氧化酶、胆固醇氧化酶或辣根过氧化酶；
所述支撑电解质选自可溶性的氯化物、磷酸盐、硫酸盐或硝酸盐。
所述生物酶为硝酸还原酶、磷酸化酶、胆固醇氧化酶或辣根过氧化酶时电解液中还需加入介体；所述介体选自紫罗碱（MV）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、天青A（AzA）、亚铁氰化钾或番红；电解液中介体的浓度为0.1-10mmol/L。
将本发明制备的生物传感器用酶电极直接作为工作电极，采用计时电流法或计时电位法对待测物进行检测。计时电流法检测采用三电极系统，本发明制备的基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极为工作电极，KCl饱和的Ag/AgCl电极为参比电极，Pt/Ti电极为对电极，以pH值为7的磷酸盐缓冲溶液为电解质，设定工作电位，待电流稳定后，逐步加入一定浓度的待测物，得到电流变化与浓度关系，并根据数据的线性模拟，得到线性范围、检测极限、检测灵敏度等性能参数；计时电位法采用二电极系统，本发明制备的基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极为工作电极，KCl饱和的Ag/AgCl电极为参比电极，以pH值为7的磷酸盐缓冲溶液为电解质，测量其开路电位，待电位稳定后，逐步加入一定浓度的待测物，得到的电位变化与浓度之间复合能斯特方程（即电位变化与浓度的负对数成正比），并根据数据的线性模拟，得到线性范围、检测极限、检测灵敏度等性能参数。
本发明在导电聚合物单体溶液中加入所需的生物酶，在纳米线阵列生长的同时包埋活性生物酶及介体，从而大大提高生物酶在导电聚合物中的有效包埋量，起到提高电化学生物传感器灵敏度和检测范围的作用。
与已有技术相比较，本发明的效果体现在：
本发明以聚合物的一维纳米阵列替代传统的聚合物膜可大大提高生物酶的有效包埋量，并且其大的比表面积也增加了酶电极与待测溶液的接触面积，从而提升生物传感器的灵敏度和检测范围，缩短传感器的响应时间。
本发明利用导电聚合物一维纳米阵列特殊的表面结构，有望实现生物酶与纳米电极之间的直接电子迁移，从而提高生物传感器的抗干扰能力。
本发明采用具有良好生物相容性的导电聚合物包埋生物酶的方式实现酶的固定，延长了酶的存活时间，从而延长生物传感器的使用寿命。
本发明基于导电聚合物一维纳米阵列的生物酶电极使得传统膜生物传感器的性能得到质的提升。
四、附图说明
图1是本发明基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极的结构示意图，其中，1包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列，2导电层，3导电胶，4支撑电极。
图2是本发明中的导电聚合物（聚吡咯）一维纳米阵列SEM形貌图。
五、具体实施方式
实施例1：
本实施例中基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极的结构由上至下依次由包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列1、镀金层2、导电银浆3和圆盘金电极4构成；其中所述生物酶为葡萄糖氧化酶；所述导电聚合物为聚吡咯。
制备方法：
1、将制备好的多孔氧化铝模板（AAO）背面采用真空蒸镀的方式形成镀金层2，并通过导电银浆3将镀金层2和圆盘金电极3粘结固定。
2、电解液的配制：组成：吡咯单体：0.4M，KCl：0.1M，葡萄糖氧化酶：500U/ml，各成分溶解在去离子水中，并经过高纯N2流的搅动和除氧。
3、包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列的制备：
将步骤1制备的固定在圆盘金电极上的多孔氧化铝模板作为工作电极浸泡在步骤2配制的电解液中30min，以KCl饱和的Ag/AgCl电极作参比电极，Pt/Ti电极为对电极，采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列，电流密度为0.1mA/cm2，聚合时间为600s；聚合完成后，将工作电极进行清洗除去残留溶液，并放置在0.5M的NaOH溶液中浸泡，去除AAO模板，获得包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米线阵列，置于0.05M磷酸盐缓冲液中，与-4℃保存备用。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达9.97μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例2：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的电流密度为0.025mA/cm2。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达1.75μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例3：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的电流密度为0.05mA/cm2。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达4.53μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例4：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的电流密度为0.075mA/cm2。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达5.68μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例5：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的电流密度为0.15mA/cm2。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达1.89μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例6：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的聚合时间为300s。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达0.877μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例7：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的聚合时间为400s。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达1.897μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例8：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的聚合时间为500s。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达4.157μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例9：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的聚合时间为700s。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达5.024μA cm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例10：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的聚合时间为800s。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达2.855μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例11：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的聚合时间为900s。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达2.491μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例12：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤3中采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列时的聚合时间为1000s。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达1.287μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例13：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤2中配制电解液时葡萄糖氧化酶的浓度为100U/ml。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达3.02μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例14：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤2中配制电解液时葡萄糖氧化酶的浓度为300U/ml。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达5.963μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例15：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤2中配制电解液时葡萄糖氧化酶的浓度为400U/ml。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达5.46μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例16：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤2中配制电解液时葡萄糖氧化酶的浓度为500U/ml。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达6.16μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。实施例17：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤2中配制电解液时葡萄糖氧化酶的浓度为600U/ml。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达3.046μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例18：
本实施例的制备方法同实施例1，不同的是步骤2中配制电解液时葡萄糖氧化酶的浓度为700U/ml。
所制备的包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列作为葡萄糖生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电流法进行葡萄糖浓度的检测，灵敏度可达2.71μAcm-2mM-1,线性范围0.1mM-8mM。
实施例19：
本实施例的制备方法同实施例1。制备完成后采用计时电位法检测葡萄糖浓度，灵敏度为50mV/decade，线性范围为0.005-5mM。
实施例20：
本实施例中基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极的结构由上至下依次由包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列1、镀金层2、导电银浆3和圆盘金电极4构成；其中所述生物酶为硝酸还原酶（NaR）；所述导电聚合物为聚吡咯。
制备方法：
1、将制备好的多孔氧化铝模板（AAO）背面采用真空蒸镀的方式形成镀金层2，并通过导电银浆3将镀金层2和圆盘金电极3粘结固定。
2、电解液的配制：组成：吡咯单体：0.4M，KCl：0.1M，硝酸还原酶：1U/ml，紫罗碱：0.25mM，各成分溶解在去离子水中，并经过高纯N2流的搅动和除氧。
3、包埋葡萄糖氧化酶的聚吡咯一维纳米阵列的制备：
将步骤1制备的固定在圆盘金电极上的多孔氧化铝模板作为工作电极浸泡在步骤2配制的电解液中30min，以KCl饱和的Ag/AgCl电极作参比电极，Pt/Ti电极为对电极，采用恒电流法生长聚吡咯纳米阵列，电流密度为0.5mA/cm2，聚合时间为600s；聚合完成后，将工作电极进行清洗除去残留溶液，并放置在0.5M的NaOH溶液中浸泡，去除AAO模板，获得包埋硝酸还原酶的聚吡咯一维纳米线阵列，置于0.05M磷酸盐缓冲液中，与-4℃保存备用。
所制备的包埋硝酸还原酶的聚吡咯纳米阵列作为硝酸盐生物传感器对葡萄糖具有高灵敏度的响应，采用计时电位法进行硝酸钾浓度的检测，灵敏度可达40mV/decade，线性范围:0.5mM-7mM。
实施例21-24：
生物酶分别用磷酸化酶、亚硫酸氧化酶、胆固醇氧化酶、辣根过氧化酶替换葡萄糖氧化酶，其他与实施例1相同。
实施例25-26：
导电聚合物分别用聚苯胺、聚噻吩替换聚吡咯，其他与实施例1相同。

Claims (3)

1.基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极，其特征在于：由上至下依次由包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列（1）、导电层（2）、导电胶（3）和支撑电极（4）构成。
所述生物酶选自葡萄糖氧化酶、硝酸还原酶、磷酸化酶、亚硫酸氧化酶、胆固醇氧化酶或辣根过氧化酶；
所述导电聚合物选自聚吡咯、聚苯胺或聚噻吩。
所述导电层选自金、银或铂；
所述导电胶选自导电银浆或导电金浆；
所述支撑电极选自金电极、铂电极、玻碳电极或碳纸电极。
2.一种权利要求1所述的基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极的制备方法，包括多孔氧化铝模板的制备和包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列的制备各单元过程，其特征在于：
所述包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列的制备是在多孔氧化铝模板的背面沉积导电层（2），然后通过导电胶（3）将导电层（2）和支撑电极（4）粘接固定后作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt/Ti电极作为对电极，电解液为导电聚合物单体、生物酶和支撑电解质的混合溶液，电解液中导电聚合物单体的浓度为0.01-0.5mol/L，生物酶的浓度为1-1000U/mL，支撑电解质的浓度为0.05-0.5mol/L，采用恒电流法在多孔氧化铝模板内生长包埋生物酶的导电聚合物一维纳米阵列，电流密度为0.05-0.5mA/cm2，聚合反应时间为100-1000s，随后置于0.3-0.8mmol/L的NaOH溶液或磷酸溶液中浸泡10-20min去除多孔氧化铝模板，得到基于导电聚合物一维纳米阵列的生物传感器用酶电极；
所述导电聚合物单体选自吡咯单体、苯胺单体或噻吩单体；
所述生物酶选自葡萄糖氧化酶、硝酸还原酶、磷酸化酶、亚硫酸氧化酶、胆固醇氧化酶或辣根过氧化酶；
所述支撑电解质选自可溶性的氯化物、磷酸盐、硫酸盐或硝酸盐。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述生物酶为硝酸还原酶、磷酸化酶、胆固醇氧化酶或辣根过氧化酶时电解液中还需加入介体；所述介体选自紫罗碱、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、天青A、亚铁氰化钾或番红；电解液中介体的浓度为0.1-10mmol/L。
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