CN107632050A - 一种富氧抗干扰的葡萄糖电化学检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种富氧抗干扰的葡萄糖电化学检测方法，所述方法采用富氧电化学检测装置检测，所述的装置包括：三电极体系，所述的三电极体系包括一参比电极、一对电极和一工作电极，其中所述的工作电极为三相富氧电极，所述的三相富氧电极的第一表面与空气或氧气接触，第二表面与电解液接触；且所述的工作电极为阴极；且所述的三相富氧电极为表面修饰过氧化氢还原催化剂，且固定有待测物质相应的氧化酶的载体。所述方法抗干扰能力强，检测精确度好。

Description

一种富氧抗干扰的葡萄糖电化学检测方法

技术领域

本发明涉及富氧抗干扰的葡萄糖电化学检测方法，具体地，本发明是基于第一代葡萄糖酶电极，即使用氧气作为电子受体，通过检测酶促反应生成的过氧化氢的氧化还原电流来对葡萄糖进行电化学检测的方法的改进。

背景技术

糖尿病是世界性的公共健康问题，全球糖尿病患者数量已经超过3亿。因此对血糖的准确检测在临床医疗和日常监测中具有重要的意义。自从1962年以来，酶电极由于其方便快速有效的特点已经成为检测血糖的主要方法。其中第一代葡萄糖酶电极通过检测酶促反应所产生的过氧化氢的浓度，进而监测葡萄糖含量。这种方法使用的电子受体是天然的氧气，其电子传输速度比第二代葡萄糖酶电极所使用的人工电子媒介体得传输速度更快，并且绿色环保，没有毒性，成本较低。但是这种方法存在着一些缺点：

首先葡萄糖传感器响应信号受溶解氧含量的影响较大，当溶解氧的含量量不足时难以对高浓度的血糖进行测定，而且氧气浓度的波动同样会影响响应信号。

其次，检测过氧化氢的电极一般需要选择较高的工作电位，使用阳极氧化的方法进行检测，然而一些内源性还原物质(抗坏血酸、尿酸等)和还原性药物(对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸等)等电化学活性物质同样容易在电极表面发生氧化，对电流信号产生严重干扰，这将会影响葡萄糖浓度的检测。

目前有报道提供了一些方法来解决氧气不足的问题。如在电极表面增加一层限制性扩散膜(聚氨酯、聚碳酸酯)，以提高氧气/葡萄糖的扩散比例，增加葡萄糖传感器的检测范围。但是这样会降低检测的灵敏度，延长响应时间。还有报道使用了富氧电极，用氧气溶解度较高的富氧材料如聚合物矿物油(Kel-F)为葡萄糖氧化酶提供额外的氧气。但是这种电极的检测上限只能达到约10毫摩尔葡萄糖，仍无法满足对高浓度葡萄糖测试的需求。另一种解决方法是使用第二代葡萄糖酶电极，即用人工合成的小分子化合物作为媒介体取代氧气，在酶的活性中心和电极表面传输电子。但是使用这种方法时，具有更高电子传输速度的氧气会与人工电子媒介体竞争电子，这将导致检测准确度低。并且与天然的氧气相比，使用人工电子媒介体的成本也更高。

针对还原物质的干扰问题，也有报道提出了解决方法，如在酶电极表面增加一层选择性透过莫以减少干扰物质扩散至电极表面，但是使用这种方法时膜的厚度的均一性不易控制，粘附力弱，这些会导致检测葡萄糖的可重复性差，并且会降低灵敏度。还有报道使用通过改进电极，在较低的工作电位下(+0.2V～0V vs Ag/AgCl)检测过氧化氢，这样可以减少大多数电活性干扰物质在电极表面的氧化反应。但是在过氧化氢的氧化电位被降低的同时，其他一些干扰物的氧化电位也会降低，这样无法完全避免干扰。如果能在负电位通过还原过氧化氢来检测葡萄糖就可以解决干扰问题。然而，使用阴极还原的方法来检测很难实现，因为在还原电位下，氧气同样会被还原并产生较强的还原电流，随着酶促反应的进行，溶液中的溶解氧的浓度会发生变化，随之产生的氧还原信号的波动会对过氧化氢的还原电流产生严重干扰，导致输出信号无法与葡萄糖浓度形成正比关系。

几乎所有的待测物质在氧化酶和氧气的作用下都会生成过氧化氢(H2O2)，因此，传统的电化学传感器是通过测量H2O2的生产量来确定待测物质的浓度。该方法自从1973年第一代电化学传感器被发明以来，一直被沿用。然而测量H2O2的电化学方法通常需要一个高的氧化电位(如0.3-0.6V在Pt电极上)，在此电位下，人体中各种物质，比如抗坏血酸，尿酸，对乙醯氨基酚，乳酸等也会被氧化，并造成传感器的选择性。相对于传统的电化学氧化法，在负电位，通过电化学还原的方法来测量H2O2可以避免这些容易被电氧化物质的干扰。但是，基于现有条件，该测量方法在现有的电化学传感器上一直无法被实现。

综上所述，本领域迫切需要一种能够避免干扰，准确度高的葡萄糖浓度检测装置。

发明内容

本发明人通过构建固-液-气三相共存的电化学传感器电极，使得氧气可以快速的从气相扩散到电极表面，保证了电极表面的氧气的含量恒定，进而实现了在较低的负电位下通过还原的方法(比如-0.1—-0.3V)来检测H2O2，避免了多种干扰物对测量结果的影响，大大提高了电化学传感器的选择性。同时，该传感器同时还具有宽的线性检测范围，高的灵敏度，以及节能等优势。

本发明的第一方面，提供了一种富氧电化学检测方法，所述方法包括步骤：

(a)提供一富氧电化学检测装置，所述的装置包括：

三电极体系，所述的三电极体系包括一参比电极、一对电极和一工作电极，其中所述的工作电极为三相富氧电极，所述的三相富氧电极的第一表面与空气或氧气接触，第二表面与电解液接触；且所述的工作电极为阴极；

且所述的三相富氧电极为表面修饰过氧化氢还原催化剂颗粒，且固定有待测物质相应的氧化酶的基材；

(b)使所述装置与含有待测物质的样品接触，进行电化学检测，得到阴极还原电流信号；

(c)通过所述的阴极还原电流信号，得到含有待测物质的样品的浓度。

在另一优选例中，所述的工作电极为具备固液气三相界面的电极。

在另一优选例中，所述的阴极还原电流信号是在-1.0V～-0.05V下得到的；优选是在-0.6V～-0.1V下得到的。

在另一优选例中，所述的步骤(c)还包括：将所述的阴极还原电流信号，与标准浓度样品测试得到的标准曲线进行比对，得到待测物质浓度。

在另一优选例中，所述的电化学检测装置是生物传感器。

在另一优选例中，所述的电化学检测包括：进行循环伏安法扫描，并测试输出信号电位处对应的阴极还原电流信号；或在负电压下进行恒电位扫描，并测试阴极还原电流信号。

在另一优选例中，所述的过氧化氢还原催化剂颗粒选自下组：碳、金属、金属盐、合金、有机材料还原催化剂，或其组合；优选地，所述金属选自下组：铂、铑、钌、金、钴、铁或镍，但均不限于此；

所述有机材料还原催化剂选自下组：生物材料和/或金属有机配合物，优选地，所述生物材料为细胞色素C，过氧化氢氧化酶、普鲁士兰，或其组合。

在另一优选例中，所述催化材料可以包括分布金属和/或金属氧化物纳米粒子，但不限于此。

在另一优选例中，所述的基材选自下组：金属材料、碳材料、高分子多孔材料；优选地，所述的基材选自下组：碳纤维纸、碳纳米管、3D石墨烯、泡沫铜。

在另一优选例中，所述金属材料可以选用但不限于泡沫镍、泡沫铜、泡沫钛、泡沫铝铁网、泡沫铜网、泡沫铝网、铝铁网、铜网或铝网。

在另一优选例中，所述碳材料可以包括石墨烯、碳纳米管构建物、碳纤维、膨胀石墨、光刻石墨、多孔碳材料，或其组合。

在另一优选例中，所述高分子多孔材料可以包括聚苯胺膜，聚吡啶膜或聚吡咯膜，或其组合；作为较为优选的实施方之一，所描述的基底为多孔导电碳材料和碳纤维材料，或其组合。

在另一优选例中，所述的基材为疏水碳纤维纸。

疏水在另一优选例中，所述的待测物质选自下组：葡萄糖；和/或胆固醇，乳酸，乙酰胆碱，醇类，或其组合；和/或

所述的待测物质相应的氧化酶选自下组：葡萄糖氧化酶，α-磷酸甘油氧化酶，胆固醇酯酶，胆固醇脱氢酶，胆固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖脱氢酶，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，胆红素氧化酶，抗坏血酸氧化酶，过氧化物酶，尿酸酶，胶原酶，质酸酶，蛋白酶或蛋白水解酶，或其组合。

在另一优选例中，所述的富氧电化学检测装置是通过以下方法制备的：

(1)提供具有疏水结构的导电基材；

(2)在所述疏水结构上加载固定所述催化材料；

(3)在所述疏水结构上施加含有待测物质相应的氧化酶的溶液，并室温干燥，从而使所述待测物质相应的氧化酶附着于所述疏水结构表面。

在另一优选例中，所述具有疏水结构的导电基材通过以下方法制备：对碳纤维纸进行疏水化修饰，得到疏水碳纤维纸。

在另一优选例中，所述的疏水化修饰还包括：将上述疏水碳纤维纸用等离子体处理，得到一面亲水另一面疏水的碳纤维纸。

在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的碳纤维纸为1.2cm﹡1.2cm碳纤维纸。

在另一优选例中，所述的疏水化修饰还包括：用水将聚四氟乳液稀释后形成的悬浊液对所述的碳纤维纸进行浸泡。

在另一优选例中，所述的稀释后，所述的聚四氟乳悬浊液的浓度为0.5-5wt.％。

在另一优选例中，碳纤维纸在其中的浸泡时间为0.5-5小时。

在另一优选例中，所述的浸泡步骤结束后，将所述的碳纤维纸在室温下晾干。

在另一优选例中，所述的晾干步骤结束后，将所述的碳纤维纸放入马弗炉中，(240℃下)加热(60分钟)后，将其自然冷却。

在另一优选例中，在马弗炉中的加热温度为200-550℃。

在另一优选例中，所述的加热时间为5-120分钟。

在另一优选例中，所述的疏水化修饰还包括：将上述疏水碳纤维纸用等离子体处理，得到一面亲水另一面疏水的碳纤维纸。

在另一优选例中，所述的等离子体处理的功率为100-300W。

在另一优选例中，所述的等离子体处理的空气流量为0.1-0.8L/min。

在另一优选例中，所述的纳米铂颗粒修饰包括：使用电化学沉积或物理气相沉积方法，对所述的碳纤维纸进行纳米铂颗粒的修饰。

在另一优选例中，所述的电化学沉积方法疏水化修饰包括：

-将上述碳纤维纸安装在电化学池侧壁；

-配置一定浓度的含纳米催化剂氯铂酸、硫酸的混合溶液作为电沉积液倒入装置的电解池中，使上述碳纤维纸的亲水面被浸没；

-采用三电极体系进行电沉积：以碳纤维纸作为工作电极，铂丝作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极，采用电流-时间法(I-t法)在一定电位电沉积一定时间；

-然后用水清洗电极表面，即得到上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸。

在另一优选例中，使用电化学沉积方法对碳纤维纸进行纳米铂颗粒修饰时，将碳纤维纸安装在电化学池侧壁，从而使其亲水面朝向电化学池的内侧，使疏水面朝向电化学池的外侧。

在另一优选例中，使用电化学沉积方法对碳纤维纸进行纳米铂颗粒修饰时，电沉积液中氯铂酸的浓度为1-15mmol/L。

在另一优选例中，使用电化学沉积方法对碳纤维纸进行纳米铂颗粒修饰时，电沉积液中硫酸的浓度为0.1-0.8mol/L。

在另一优选例中，使用电化学沉积方法对碳纤维纸进行纳米铂颗粒修饰时，电沉积使用电位为-0.3V。

在另一优选例中，使用电化学沉积方法对碳纤维纸进行纳米铂颗粒修饰时，电沉积时间为20-500秒。

在另一优选例中，所述的使用物理气相沉积方法疏水化修饰包括：用电子束蒸发方式在碳纤维纸表面修饰一定厚度的纳米铂颗粒。

在另一优选例中，使用物理气相沉积方法对碳纤维纸进行纳米铂颗粒修饰时，修饰纳米铂颗粒的厚度为5-20纳米。

在另一优选例中，所述的步骤(3)中包括：使用包埋固定法或共价交联与包埋法共用的方法对上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸进行葡萄糖氧化酶的固定。

在另一优选例中，所述的步骤(3)中，所述的包埋固定法时，所述的方法包括：

-将所述的上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸按照一定方法固定在电化学反应装置的侧面模具上，并露出部分区域(优选为直径为8毫米的圆形区域)；

-在上述区域中滴加葡萄糖氧化酶水溶液，并自然晾干；

-待水溶液即将晾干时，向上述区域内滴加一定的壳聚糖溶液；

-放入干燥器中晾干，即得到所述的三相疏水富氧电极装置；

且，

使用共价交联与包埋法共用的方法时，所述的方法包括：

-将所述的上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸按照一定方法固定在电化学反应装置的侧面模具上，并露出部分区域(优选为直径为8毫米的圆形区域)；

-在上述区域中滴加一定的混合溶液，放入干燥器中晾干，从而得到三相疏水富氧电极装置。

在另一优选例中，使用包埋固定法进行葡萄糖氧化酶的固定时，固定方法为使修饰有纳米铂颗粒的一侧向上。

在另一优选例中，所述滴加的葡萄糖氧化酶水溶液的浓度为2-30mg/mL。

在另一优选例中，所述葡萄糖氧化酶水溶液滴加的体积为5-50微升。

在另一优选例中，滴加的壳聚糖溶液为5-50μL。

在另一优选例中，所述的壳聚糖溶液为0.1-5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，其中醋酸的浓度为0.5-2wt.％。

在另一优选例中，使用共价交联与包埋法共用的方法进行葡萄糖氧化酶的固定时，固定方法为使修饰有纳米铂颗粒的一侧向上。

在另一优选例中，滴加的混合溶液的制备方法为将10-100μL的0.5-5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液、20-200μL的10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液、1-10μL的1-10wt.％的戊二醛水溶液以及10-100μL水共混配置成均匀混合液，放置在室温下5-60分钟后再滴加。

在另一优选例中，所述混合溶液滴加的体积为5-50μL。

在另一优选例中，所述的步骤(4)中包括：在还原电位下，进行所述的葡萄糖检测。

在另一优选例中，其特征在于，所述的步骤(4)中，所述的葡萄糖检测包括：向上述的三相疏水富氧电极装置中注入电解液，并向溶液中加入不同浓度的葡萄糖制成标准样本进行测试，从而记录电流信号和葡萄糖浓度的关系，得到标准曲线。

在另一优选例中，所述的葡萄糖检测采用三电极体系进行。

在另一优选例中，所述的葡萄糖检测采用循环伏安法或i-t法进行测试。

在另一优选例中，所述的步骤(4)还包括：对待测样品进行所述的葡萄糖检测，从而得到电流信号，并与所述的标准曲线进行比对，得到葡萄糖浓度。

在另一优选例中，所述注入的电解液为pH＝5-8的KCl/PBS缓冲溶液。

在另一优选例中，使用循环伏安法进行测试时，加入葡萄糖或干扰物后用磁力搅拌器搅拌均匀再进行扫描。

在另一优选例中，所述的扫描包括：扫描范围的最高电位为0.4V，最低电位为-0.3V，扫速为0.01-0.1V/s，输出信号取-0.1V电位处对应的阴极还原电流。

在另一优选例中，使用I-t法进行测试时，使用-0.1V作为恒定电位，扫描时间为80秒，取第60秒的电流值作为输出信号。

在另一优选例中，所述具有疏水结构的导电基材通过以下方法制备：对碳纤维纸进行疏水化修饰，得到疏水碳纤维纸。

在另一优选例中，所述的疏水化修饰还包括：将上述疏水碳纤维纸用等离子体处理，得到一面亲水另一面疏水的碳纤维纸。

本发明的第二方面，提供了一种葡萄糖电化学检测装置，所述的装置包括：

三电极体系，所述的三电极体系包括一参比电极、一对电极和一工作电极，其中所述的工作电极为三相富氧电极，所述的三相富氧电极的第一表面与空气或氧气接触，第二表面与电解液接触；且所述的工作电极为阴极；

且所述的三相富氧电极为表面修饰过氧化氢还原催化剂颗粒，且固定有待测物质相应的氧化酶的基材。

在另一优选例中，所述的装置还包括电解液。

在另一优选例中，所述的电解液为KCl/PBS缓冲溶液。

在另一优选例中，所述的三相富氧电极为三相疏水富氧电极。

在另一优选例中，所述的装置的制备方法包括步骤：将表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸固定在电化学反应装置的侧面模具上，露出直径为8毫米的圆形区域；在上述区域中滴加一定的混合溶液，放入干燥器中晾干；

在另一优选例中，所述的三相疏水富氧电极通过如下方法制备：

(1)对碳纤维纸进行疏水化修饰，得到疏水碳纤维纸；

(2)对所述的疏水碳纤维纸的上层碳纤维表面进行纳米铂颗粒修饰，得到上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸；

(3)对上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸进行葡萄糖氧化酶的固定，得到三相疏水富氧电极。

在另一优选例中，所述的过氧化氢还原催化剂颗粒选自下组：碳、金属、金属盐、合金、有机材料还原催化剂，或其组合；优选地，所述金属选自下组：铂、铑、钌、金、钴、铁或镍，或其组合；所述有机材料还原催化剂选自下组：生物材料和/或金属有机配合物；优选地，所述生物材料为细胞色素C，过氧化氢氧化酶、普鲁士兰，或其组合。

在另一优选例中，所述的基材为碳纤维纸。

在另一优选例中，所述的基材为疏水的碳纤维纸。

在另一优选例中，所述的基材为一面亲水另一面疏水的碳纤维纸。

在另一优选例中，所述的待测物质相应的氧化酶选自下组：葡萄糖氧化酶、α-磷酸甘油氧化酶，胆固醇酯酶，胆固醇脱氢酶，胆固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖脱氢酶，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，胆红素氧化酶，抗坏血酸氧化酶，过氧化物酶，尿酸酶，胶原酶，质酸酶，蛋白酶、蛋白水解酶，或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明实施例1所获三相疏水富氧电极装置的示意图；

图2为本发明实施例1所获三相疏水富氧电极用循环伏安法测量葡萄糖的电流-浓度工作曲线；

图3为本发明实施例2所获三相疏水富氧电极用i-t法测量葡萄糖的电流-浓度工作曲线；

图4为本发明实施例3所获三相疏水富氧电极用循环伏安法测量葡萄糖的电流-浓度工作曲线；

图5为本发明实施例4所获三相疏水富氧电极用i-t法测量葡萄糖的电流-浓度工作曲线；

图6为本发明实施例1所获三相疏水富氧电极用循环伏安法检测葡萄糖时加入干扰物的影响；

图7为本发明实施例2所获三相疏水富氧电极用i-t法检测葡萄糖时加入干扰物的影响；

图8为作为对比的酶铂碳电极用循环伏安法测量葡萄糖的电流-浓度工作曲线；

图9为作为对比的酶铂碳电极用i-t法检测葡萄糖时加入干扰物的影响。

显然，依据图1-图9可以看到使用三相疏水富氧电极以阴极还原过氧化氢的方法进行葡萄糖的检测，电流值随葡萄糖的浓度的增加而增加，其线性范围上限可达到140毫摩尔，使用循环伏安法和i-t法时，人体内易被电化学氧化的干扰物抗坏血酸、对乙酰氨基酚和尿酸对葡萄糖的信号的干扰均可忽略不计，在医疗设备领域中具有广阔的应用前景，具有很好的社会效益和经济效益。

图10为过氧化氢既电化学氧化和电化学还原检测方法对比图，但是电化学氧化方法(图10a)会受到其容易被氧化物质的干扰。而如果在还原电位下检测，则不会受到这些物质的干扰(如图10b)。

图11为在血清中，通过还原过氧化氢和氧化过氧化氢的原理来检测葡萄糖的结果对比，还原过氧化氢法没有受到其他物质的干扰(如图11a)，而通过传统的氧化方法检测葡萄糖，则干扰非常严重(如图11b)。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现了一种富氧抗干扰的葡萄糖电化学检测方法，大幅度提高了葡萄糖检测上限，在还原电位得到了与葡萄糖浓度成正比关系的电流信号，实现了以阴极还原过氧化氢的方法进行葡萄糖检测，从而避免了人体内易被电化学氧化的物质造成的干扰，在医疗设备领域中具有广阔的应用前景，具有很好的社会效益和经济效益。

富氧电化学检测方法

为实现上述发明目的，本发明采用了一种富氧抗干扰的电化学检测方法，所述方法包括：

(1)将碳纤维纸(1.2cm﹡1.2cm)用有机溶剂和水的混合溶剂浸泡，超声清洗一定时间，然后放入烘箱使用一定温度烘干备用；

(2)用水将聚四氟乳液稀释成一定浓度的悬浊液，将上述处理好的碳纤维纸放入上述悬浊液中浸泡一定时间，然后在室温下晾干，最后放入马弗炉中使用一定温度加热一定时间后自然冷却，即得到疏水碳纤维纸；

(3)将上述疏水碳纤维纸用等离子体处理，即得到一面亲水另一面疏水的碳纤维纸；

(4)使用电化学沉积或物理气相沉积方法对上述碳纤维纸进行纳米铂颗粒的修饰：

使用电化学沉积方法时，将上述碳纤维纸按照一定方法安装在电化学池侧壁；配置一定浓度的氯铂酸、硫酸的混合溶液作为电沉积液倒入装置中电解池中，使上述碳纤维纸的亲水面被浸没；采用三电极体系进行电沉积。以碳纤维纸作为工作电极，铂丝作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极，采用电流-时间法(I-t法)在一定电位电沉积一定时间，然后用水清洗电极表面，即得到上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸；

使用物理气相沉积方法时，用电子束蒸发方式在碳纤维纸表面修饰一定厚度的纳米铂颗粒；

(5)使用包埋固定法或共价交联与包埋法共用的方法对上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸进行葡萄糖氧化酶的固定：

使用包埋固定法时，将上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸按照一定方法固定在电化学反应装置的侧面模具上，露出直径为8毫米的圆形区域，在上述区域中滴加一定的葡萄糖氧化酶水溶液，待水溶液即将晾干时，再向上述区域内滴加一定的壳聚糖溶液，最后放入干燥器中晾干，即得到三相疏水富氧电极装置；

使用共价交联与包埋法共用的方法时，将上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸按照一定方法固定在电化学反应装置的侧面模具上，露出直径为8毫米的圆形区域，在上述区域中滴加一定的混合溶液，放入干燥器中晾干，即得到三相疏水富氧电极装置；

(6)向上述的三相疏水富氧电极装置中注入一定电解液，向溶液中加入不同浓度的葡萄糖，采用三电极体系，使用循环伏安法或i-t法进行测试，记录不同浓度葡萄糖和加入不同干扰物时对应的电流信号。

所述有机溶剂为乙醇、丙酮，乙醇、丙酮、水的比例为1:1:1；所述超声清洗时间为1-30分钟；烘干温度为60-150℃。

所述稀释后聚四氟乳悬浊液浓度的浓度为0.5-5wt％；所述碳纤维纸在其中的浸泡时间为0.5-5小时；所述在马弗炉中的加热温度为200-550℃，加热时间为5-120分钟。

所述对疏水碳纤维纸进行等离子体处理时，功率为100-300W，空气流量为0.1-0.8L/min。

所述将碳纤维纸安装在电化学池侧壁的方法为使其亲水面朝向电化学池的内侧，使疏水面朝向电化学池的外侧。

所述电沉积液中氯铂酸的浓度为1-15mM，硫酸的浓度为0.1-0.8M；电沉积使用电位为-0.3V，电沉积时间为20-500秒。

所述使用物理气相沉积方法对碳纤维纸进行纳米铂颗粒修饰时，修饰纳米铂颗粒的厚度为5-20纳米。

所述使用包埋固定法进行葡萄糖氧化酶的固定时，固定方法为使修饰有纳米铂颗粒的一侧向上；滴加的葡萄糖氧化酶水溶液的浓度为2-30mg/mL，滴加的体积为5-50微升；滴加的壳聚糖溶液为5-50微升，0.1-5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，其中醋酸的浓度为0.5-2wt％。

所述使用共价交联与包埋法共用的方法进行葡萄糖氧化酶的固定时，固定方法为使修饰有纳米铂颗粒的一侧向上；滴加的混合溶液的制备方法为将10-100微升的0.5-5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液、20-200μL的10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液、1-10微升1-10wt％的戊二醛水溶液以及10-100微升水共混配置成均匀混合液，放置在室温下5-60分钟后再滴加；滴加的体积为5-50微升。

所述注入的电解液为pH＝5-8的KCl/PBS缓冲溶液。

所述循环伏安法进行测试时，加入葡萄糖或干扰物后用磁力搅拌器搅拌均匀再进行扫描；扫描范围的最高电位为0.4V，最低电位为-0.3V，扫速为0.01-0.1V/s，输出信号取-0.1V电位处对应的阴极还原电流。

所述I-t法进行测试时，使用-0.1V作为恒定电位，扫描时间为80秒，取第60秒的电流值作为输出信号。

与现有方法相比，本发明的优点包括：大幅度增加了葡萄糖检测范围，检测葡萄糖的检测上限可达到140毫摩尔，实现了以阴极还原过氧化氢的方法进行的氧化酶催化底物的准确检测，避免了人体内易被电化学氧化的物质造成的干扰。

术语

如本文所用，术语“疏水固液气三相共存的生物酶传感器”、“本发明传感器”、“本发明的生物酶传感器”可互换使用，指具有疏水特性的，并且在传感器工作时存在固液气三相共存的状态(或现象)的生物酶传感器。

如本文所用，术语“疏水”、“疏水性能”可互换使用，指物体(如生物酶传感器)或材料(如基材)具有优良的疏水性能。疏水性能可用常规方法进行测定和表征。通常，当在常温、常压测试条件下，接触角≥120度(较佳地≥150°)时，可认为该物质具优良的疏水性。

如本文所用，室温是指环境温度，通常为0-50℃，较佳地4-30℃。

生物酶传感器

本发明的一个方面旨在提供一种疏水固液气三相共存的生物酶传感器，其通过在疏水材料表面形成固气液三相共存的结构，从而可以提供充足的氧气以供应酶促反应，继而能够有效提高生物酶传感器的工作性能(如检测范围和检测限)。

参阅图1所示，本发明中的疏水固液气三相共存的生物酶传感器在应用时，可作为工作电极，并结合一个电化学所需要的参比电极，或同时结合一个参比电极和一个对电极，以及，配以相应的导电介质，即可以进行分析检测，例如葡萄糖的标定或测试。

本发明的一种疏水固液气三相共存的生物酶传感器可以包括：

具有疏水结构的导电基材，

以及，能够与待测物质反应生成过氧化氢的生物酶和具有催化过氧化氢功能的催化材料。

进一步的，作为优选的实施方案之一，所述传感器还可以包括：至少用以保护所述生物酶，并将所述生物酶固定于所述疏水结构表面的保护膜。

更为具体的，所述保护膜覆盖在所述疏水结构(疏水电极)上，其至少能够使用以形成所述选定液相体系的溶剂分子和所述待测物质透过，但能够阻挡所述生物酶。

本发明的一种疏水固液气三相共存的生物酶传感器可以包括：

具有疏水性能的基材，

分布在所述基材上的具有催化过氧化氢功能的催化材料和能够与待测物质反应生成过氧化氢的生物酶。

本发明的另一种疏水固液气三相共存的生物酶传感器可以包括：

具有疏水性能的导电基材，其中，所述基材包含本身就具有催化过氧化氢功能的催化材料，

以及，能够与待测物质反应生成过氧化氢的生物酶。

本发明的又一种疏水固液气三相共存的生物酶传感器可以包括：

具有疏水结构的导电基材，

以及，能够与待测物质反应生成过氧化氢的生物酶和具有催化过氧化氢功能的催化材料；

并且，当所述疏水结构表面被施加选定液相体系时，至少在覆盖所述疏水结构的所述液相体系与填充在所述疏水结构内的含氧气的气相体系的界面上分布有所述生物酶和所述催化材料，构成固液气三相共存的形态。

本发明的再一种疏水固液气三相共存的生物酶传感器可以包括：

具有疏水结构的导电基材，其中，用以形成所述疏水结构的材料包含具有催化过氧化氢功能的催化材料，

以及，能够与待测物质反应生成过氧化氢的生物酶；

并且，当所述疏水结构表面被施加选定液相体系时，至少在覆盖所述疏水结构的所述液相体系与填充在所述疏水结构内的含氧气的气相体系的界面上分布有所述生物酶和所述催化材料，构成固液气三相共存的形态。

基材

对于本发明中的导电基材，其可以选用经过疏水处理之后表面具有疏水性能的导电材料，亦可选用本身即具有疏水表面的导电材料，这些材料可通过市售或自制等多种途径获取。

例如，对于需要经过疏水处理之后才具有疏水性能的导电材料，可以利用具有低表面能的物质对其进行修饰而获取，此类低表面能物质包括(但并不限于)：氟碳化合物、氟硅化合物、硅偶联剂或长链烷基化合物等，亦可为具有低表面能的颗粒等，例如聚四氟乙烯微粉、全氟乙丙烯微粉等，但不限于此。而相应的修饰的方法可以参考CN102815052A、CN102011153A等文献。

前述导电基材可以选用导电疏水材料，包括(但并不限于)：金属材料，碳材料或高分子多孔材料等。例如，所述金属材料包括(但并不限于)泡沫镍、泡沫铜、泡沫钛、泡沫铝铁网、泡沫铜网、泡沫铝网、铝铁网、铜网或铝网，而碳材料包括(但并不限于)石墨烯、碳纳米管构建物、碳纤维、膨胀石墨、光刻石墨、多孔碳材料等等，高分子多孔材料包括(但并不限于)聚苯胺膜，聚吡啶膜或聚吡咯膜等等。

过氧化氢还原催化剂

前述的过氧化氢还原催化剂，是指能够催化过氧化氢进行还原电化学反应的无机、生物、金属及金属氧化物材料，例如，其可选用碳纳米管、石墨烯，细胞色素C，过氧化氢氧化酶、普鲁士兰、铂(Pt)，铑(Rh)，钌(Ru)，金(Au)，钴(Co)氧化物，铁(Fe)氧化物，镍(Ni)氧化物等，而其形态亦不受限制。

在本发明中，所述催化材料可以包括无机材料和/或有机材料；

其中，所述无机材料可以包括碳和/或金属和/或含有金属元素的化合物；

所述有机材料包括(但并不限于)生物材料和/或金属有机配合物，例如，所述生物材料可选用但不限于细胞色素C，过氧化氢氧化酶或普鲁士兰等。

所述金属包括(但并不限于)铂、铑、钌、金、钴、铁或镍。

作为较为优选的实施方案之一，所述催化材料包括(但并不限于)分布金属和/或金属氧化物纳米粒子。

氧化酶

如本文所用，氧化酶可选用任一种能够氧化被检测物质(例如，葡萄糖)并产生过氧化氢的活性酶，例如，其包括(但并不限于)：甘油激酶、α-磷酸甘油氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化物酶、尿酸酶、胶原酶、质酸酶、蛋白酶、蛋白水解酶、或其组合。

成膜物质

如本文所用，成膜物质是指能在材料表面成膜并起到保护并固定酶分子的化合物，包括但不仅限于壳聚糖，全氟磺酸质子膜(Nafion)，其亦可为能够用以构成能够阻止生物材料通过，而不限制小分子或离子透过的半透膜或渗透膜等习见材料，例如常用的制备材料有铜氨法再生纤维素、醋酸纤维素、聚丙烯腈、乙烯-乙烯醇共聚物以及聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚丙烯酰胺等。

另外，在本发明的一实施方案中，对于自身就具有前述催化性能的导电基材，特别是其疏水结构包含具有催化过氧化氢功能的催化材料的导电基材，则也可省去前述在疏水结构上加载催化材料的操作。

生物酶传感器的制法

本发明的另一方面提供了一种疏水固液气三相共存的生物酶传感器的制备方法，其包括：提供具有疏水结构的导电基材，并在所述疏水结构上固定加载具有催化过氧化氢功能的催化材料和能够与待测物质反应生成过氧化氢的生物酶。

并且，当所述疏水结构表面被施加选定液相体系时，至少在覆盖所述疏水结构的所述液相体系与填充在所述疏水结构内的含氧气的气相体系的界面上分布有所述生物酶和所述催化材料，构成固液气三相共存的形态。

前述的“选定液相体系”，是指水或至少含有所述待测物质的水溶液等，亦可为血液或其它生理液体等。

前述的“待测物质”，是指能够被所述生物酶氧化并产生过氧化氢的物质，包括葡萄糖等，但不限于此。

前述的“含氧气的气相体系”，包括空气或由氧气与其它辅助气体(例如，氮气等非活性气体和氩气等惰性气体)形成的气体。

在一具体实施方案中，该制备方法具体可以包括如下步骤：

(1)提供具有疏水结构的导电基材；

(2)在所述疏水结构上加载固定所述催化材料；

(3)在所述疏水结构上施加含有生物酶的溶液，并室温干燥，从而使所述生物酶附着于所述疏水结构表面。

作为较为优选的实施方案之一，该制备方法还可以包括：

在已经载有所述生物酶的疏水结构上施加成膜物质，并室温干燥，从而在所述疏水结构上形成至少能够使用以形成所述选定液相体系的溶剂分子和所述待测物质透过，但能够阻挡所述生物酶的保护膜。

在一具体实施方案中，前述传感器的制备方法可以包括如下步骤，分别为：疏水材料的制备；表面使用金属或金属氧化物材料进行处理；处理后的表面加入生物酶溶液；使用成膜材料成膜进行保护。

一种优选的制备过程如下：

(1)疏水材料的制备

对于本身具有疏水功能的导电基材不需要进一步疏水处理。而对于本身亲水的材料，可以用具有低表面能的物质修饰，例如，可以放入氟硅烷的乙醇溶液中浸泡3-24h，然后取出用乙醇清洗表面残留物质，最终将处理的样品在100℃烘箱中加热聚合2h得到疏水的电极材料(亦即，前述导电基材，或简称疏水材料)。

(2)使用金属或金属氧化物材料进行修饰

将上述步骤1)中得到的疏水材料固定于电极池中，在电极池中加入与需要载入的催化材料相关的溶液中。以Pt为例，为在疏水材料表面沉积Pt金属，在电极池中加入氯铂酸溶液(10g/L H₂PtCl₆，其浓度比为H₂PtCl₆:1M H₂SO₄:H₂O＝13:25:12)。使用处理过的疏水材料作为工作电极，加入铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，使用即时电流法，在0～-0.5V的电势下电沉积150-1500s。

(3)生物酶的载入

将上述制备好的金属和/或金属氧化物材料处理过的疏水材料继续固定在电极池中，并且在疏水材料表面滴加含有生物酶的溶液，例如葡萄糖氧化酶的水溶液(其中含酶量可以为0.1-20U，U为酶活力单位)，随后，将疏水材料放置于室温自然干燥，干燥后的疏水材料载有生物酶，且生物酶拥有反应活性。

(4)成膜保护

在上述载有生物酶的疏水材料表面使用保护膜进行保护，以保护载于疏水材料表面的生物酶分子不至于溶解或脱落。其操作方法可以为：在上述步骤中干燥后的疏水材料表面施加一定量的成膜物质，随后继续将疏水材料放置于室温自然干燥，干燥后的疏水材料表面有一层成膜物质所形成的膜，从而使疏水材料被施加水溶液后，生物酶分子不会溶解在溶液中。

以壳聚糖为成膜物质为例，在上述载有生物酶的疏水材料表面，滴加10μL壳聚糖溶液，其中壳聚糖含量可以为1mg-250mg，随后，将疏水材料放置于室温自然干燥，干燥后的疏水材料表面可明显观察到有壳聚糖膜的存在。

此外，上述步骤(3)和(4)也可以集中在一步完成，即将生物酶和保护膜材料共混后一起成膜。

在本发明中，可将上述步骤(2)制备好的金属和/或金属氧化物材料处理过的疏水材料，固定于电极池，并且在疏水材料表面添加(如滴加)含有生物酶和成膜保护材料的混合溶液，例如葡萄糖氧化酶和含成膜物质(如壳聚糖)的溶液。通常，所述溶液可用含酶的水溶液与含成膜物质的溶液混合而成，其中，两者的混合比例没有特别限制，只要可形成保护膜即可，通常为1:50至50:1，较佳地为1:10至10:1，更佳地为2:1-1:2。在所述溶液中，酶的含量以及成膜物质的含量可根据物质的种类等情况而确定，只要能够在表面形成具有一定酶含量的保护膜即可。通常，对于1-4cm²的表面而言，所述的保护膜中含酶量通常为0.1-20U(U为酶活力单位)，而成膜物质(如壳聚糖)的含量通常为1mg-250mg。

随后，将疏水材料进行干燥处理(如室温下自然干燥)。

在本发明中，干燥后形成的疏水材料表面生物酶具有反应活性。另外，疏水材料被放入水溶液后，生物酶分子可被成膜物质保护因而不会溶解在溶液中。

本发明的主要优点包括：

本发明提供了一种富氧抗干扰的葡萄糖电化学检测方法，藉以实现具有高检测上限的葡萄糖电化学检测，并且避免了人体内易被电化学氧化的物质造成的干扰，在医疗设备领域中具有巨大的商业价值。

实施例1

1)将碳纤维纸(1.2cm﹡1.2cm)用乙醇、丙酮、水(比例为1:1:1)的混合溶剂浸泡，超声清洗10分钟，然后放入烘箱使用60℃烘干备用；

2)用水将聚四氟乳液稀释成0.5wt％的悬浊液，将上述处理好的碳纤维纸放入上述悬浊液中浸泡1小时，然后在室温下晾干，最后放入马弗炉中使用200℃加热30分钟后自然冷却，即得到疏水碳纤维纸；

3)将上述疏水碳纤维纸用等离子体处理，使用功率100W，空气流量0.3L/min，即得到一面亲水另一面疏水的碳纤维纸；

4)使用物理气相沉积方法对上述碳纤维纸进行纳米铂颗粒的修饰：用电子束蒸发方式在碳纤维纸表面修饰厚度为5纳米的纳米铂颗粒；

5)使用共价交联与包埋法共用的方法对上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸进行葡萄糖氧化酶的固定：将10微升的4mg/mL的壳聚糖醋酸溶液、20μL的10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液、2微升10wt％的戊二醛水溶液以及100微升水共混配置成均匀混合液，放置在室温下20分钟后待用；将上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸固定在电化学反应装置的侧面模具上，使修饰有纳米铂颗粒的一侧向上，露出直径为8毫米的圆形区域，在上述区域中滴加10微升上述混合溶液，放入干燥器中晾干，即得到三相疏水富氧电极装置；装置如附图1中所示。

6)向上述的三相疏水富氧电极装置中注入pH＝7.2的KCl/PBS缓冲溶液；向上述缓冲溶液中加入不同浓度的葡萄糖，用磁力搅拌器搅拌均匀后再采用三电极体系进行循环伏安法扫描，实施例结果如附图2左所示，其中，扫描范围的最高电位为0.4V，最低电位为-0.3V，扫速为0.05V/s，输出信号取-0.1V电位处对应的阴极还原电流，记录不同浓度葡萄糖对应的电流信号，得到浓度-电流曲线，如附图2右所示。

7)使用上述的循环伏安检测方法，在扫描缓冲溶液和加入5mM葡萄糖后，继续向溶液中加入0.1mM抗坏血酸、0.1mM对乙酰氨基酚和0.1mM尿酸，分别记录加入每一种干扰物后得到的循环伏安信号，实施例结果如附图6所示。从图6中可以看出，当体系中存在干扰物时，检测的循环伏安信号没有明显的改变，说明本发明的测试方法可以有效地防止常见干扰物的干扰。

实施例2

1)将碳纤维纸(1.2cm﹡1.2cm)用乙醇、丙酮、水(比例为1:1:1)的混合溶剂浸泡，超声清洗30分钟，然后放入烘箱使用140℃烘干备用；

2)用水将聚四氟乳液稀释成3wt％的悬浊液，将上述处理好的碳纤维纸放入上述悬浊液中浸泡2.5小时，然后在室温下晾干，最后放入马弗炉中使用300℃加热90分钟后自然冷却，即得到疏水碳纤维纸；

3)将上述疏水碳纤维纸用等离子体处理，使用功率200W，空气流量0.8L/min，即得到一面亲水另一面疏水的碳纤维纸；

4)使用电化学沉积法对上述碳纤维纸进行纳米铂颗粒的修饰：将上述碳纤维纸安装在电化学池侧壁，使其亲水面朝向电化学池的内侧，使疏水面朝向电化学池的外侧；配置氯铂酸、硫酸的混合溶液(其中氯铂酸的浓度为3mM，硫酸的浓度为0.6M)作为电沉积液倒入装置中电解池中，使上述碳纤维纸的亲水面被浸没；采用三电极体系进行电沉积。以碳纤维纸作为工作电极，铂丝作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极，采用电流-时间法(I-t法)在-0.3V电沉积420秒，然后用水清洗电极表面，即得到上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸；

5)使用包埋固定法对上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸进行葡萄糖氧化酶的固定：将上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸固定在电化学反应装置的侧面模具上，使修饰有纳米铂颗粒的一侧向上，露出直径为8毫米的圆形区域，在上述区域中滴加45微升，5mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液，待水溶液即将晾干时，再向上述区域内滴加20微升，2mg/mL的壳聚糖醋酸溶液(其中醋酸的浓度为0.8wt％)，最后放入干燥器中晾干，即得到三相疏水富氧电极装置；

6)向上述的三相疏水富氧电极装置中注入pH＝6.2的KCl/PBS缓冲溶液；向上述缓冲溶液中加入不同浓度的葡萄糖，用磁力搅拌器搅拌均匀后再采用三电极体系以-0.1V作为恒定电位进行i-t扫描，实施例结果如附图3中所示，其中，扫描时间为80秒，取第60秒的电流值作为输出信号，得到浓度-电流曲线。

7)向上述的三相疏水富氧电极装置中注入pH＝6.2的KCl/PBS缓冲溶液，持续用磁力搅拌器搅拌；向上述缓冲溶液中依次加入5mM葡萄糖、0.1mM抗坏血酸、0.1mM对乙酰氨基酚、0.1mM尿酸和5mM葡萄糖，在此过程中采用三电极体系以-0.1V作为恒定电位进行i-t扫描，实施例结果如附图7中所示，其中，加入葡萄糖和干扰物的时间间隔为80秒。将所加入的三种干扰物质得到的电流信号增加与葡萄糖的电流信号增加作对比，实施例结果如附图11左所示。从图11中可以看出，当体系中存在干扰物时，检测的循环伏安信号没有明显的改变，说明本发明的测试方法可以有效地防止常见干扰物的干扰。

实施例3

1)将碳纤维纸(1.2cm﹡1.2cm)用乙醇、丙酮、水(比例为1:1:1)的混合溶剂浸泡，超声清洗5分钟，然后放入烘箱使用90℃烘干备用；

2)用水将聚四氟乳液稀释成5wt％的悬浊液，将上述处理好的碳纤维纸放入上述悬浊液中浸泡0.5小时，然后在室温下晾干，最后放入马弗炉中使用400℃加热20分钟后自然冷却，即得到疏水碳纤维纸；

3)将上述疏水碳纤维纸用等离子体处理，使用功率300W，空气流量0.1L/min，即得到一面亲水另一面疏水的碳纤维纸；

4)使用电化学沉积法对上述碳纤维纸进行纳米铂颗粒的修饰：将上述碳纤维纸安装在电化学池侧壁，使其亲水面朝向电化学池的内侧，使疏水面朝向电化学池的外侧；配置氯铂酸、硫酸的混合溶液(其中氯铂酸的浓度为12mM，硫酸的浓度为0.2M)作为电沉积液倒入装置中电解池中，使上述碳纤维纸的亲水面被浸没；采用三电极体系进行电沉积。以碳纤维纸作为工作电极，铂丝作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极，采用电流-时间法(I-t法)在-0.3V电沉积30秒，然后用水清洗电极表面，即得到上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸；

5)使用共价交联与包埋法共用的方法对上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸进行葡萄糖氧化酶的固定：将100微升的0.5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液、200μL的10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液、8微升2wt％的戊二醛水溶液以及30微升水共混配置成均匀混合液，放置在室温下60分钟后待用；将上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸固定在电化学反应装置的侧面模具上，使修饰有纳米铂颗粒的一侧向上，露出直径为8毫米的圆形区域，在上述区域中滴加40微升上述混合溶液，放入干燥器中晾干，即得到三相疏水富氧电极装置；

6)向上述的三相疏水富氧电极装置中注入pH＝7.8的KCl/PBS缓冲溶液；向上述缓冲溶液中加入不同浓度的葡萄糖，用磁力搅拌器搅拌均匀后再采用三电极体系进行循环伏安法扫描，实施例结果如附图4中所示，其中，扫描范围的最高电位为0.4V，最低电位为-0.3V，扫速为0.08V/s，输出信号取-0.1V电位处对应的阴极还原电流，记录不同浓度葡萄糖对应的电流信号，得到浓度-电流曲线。

实施例4

1)将碳纤维纸(1.2cm﹡1.2cm)用乙醇、丙酮、水(比例为1:1:1)的混合溶剂浸泡，超声清洗20分钟，然后放入烘箱使用150℃烘干备用；

2)用水将聚四氟乳液稀释成2.5wt％的悬浊液，将上述处理好的碳纤维纸放入上述悬浊液中浸泡5小时，然后在室温下晾干，最后放入马弗炉中使用100℃加热120分钟后自然冷却，即得到疏水碳纤维纸；

3)将上述疏水碳纤维纸用等离子体处理，使用功率150W，空气流量0.5L/min，即得到一面亲水另一面疏水的碳纤维纸；

4)使用物理气相沉积方法对上述碳纤维纸进行纳米铂颗粒的修饰：用电子束蒸发方式在碳纤维纸表面修饰厚度为20纳米的纳米铂颗粒；

5)使用包埋固定法对上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸进行葡萄糖氧化酶的固定：将上述上层纤维表面修饰纳米铂颗粒的碳纤维纸固定在电化学反应装置的侧面模具上，使修饰有纳米铂颗粒的一侧向上，露出直径为8毫米的圆形区域，在上述区域中滴加10微升，30mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液，待水溶液即将晾干时，再向上述区域内滴加40微升，4mg/mL的壳聚糖醋酸溶液(其中醋酸的浓度为1.5wt％)，最后放入干燥器中晾干，即得到三相疏水富氧电极装置；

6)向上述的三相疏水富氧电极装置中注入pH＝5.8的KCl/PBS缓冲溶液；向上述缓冲溶液中加入不同浓度的葡萄糖，用磁力搅拌器搅拌均匀后再采用三电极体系以-0.1V作为恒定电位进行i-t扫描，实施例结果如附图5中所示，其中，扫描时间为80秒，取第60秒的电流值作为输出信号，得到浓度-电流曲线。

实施例5

1)将玻碳电极(直径3mm)打磨后用乙醇、丙酮、水(比例为1:1:1)的混合溶剂浸泡，超声清洗3分钟，然后氮气吹干备用；

2)使用物理气相沉积方法对上述玻碳电极表面进行纳米铂颗粒的修饰：用电子束蒸发方式在玻碳电极表面修饰厚度为5纳米的纳米铂颗粒；

3)使用共价交联与包埋法共用的方法对上述表面修饰纳米铂颗粒的玻碳电极进行葡萄糖氧化酶的固定：将10微升的4mg/mL的壳聚糖醋酸溶液、20μL的10mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液、2微升10wt％的戊二醛水溶液以及100微升水共混配置成均匀混合液，放置在室温下20分钟后，取3微升滴加在上述玻碳电极表面，放入干燥器中晾干，即得到作为对比的酶玻碳电极。

4)向pH＝7.2的KCl/PBS缓冲溶液中加入不同浓度的葡萄糖，用磁力搅拌器搅拌均匀后采用三电极体系进行循环伏安法扫描，其中工作电极为上述酶玻碳电极，实施例结果如附图8左所示，其中，扫描范围的最高电位为0.4V，最低电位为-0.3V，扫速为0.05V/s，输出信号取-0.1V电位处对应的阴极还原电流，记录不同浓度葡萄糖对应的电流信号，得到浓度-电流曲线，如附图8右所示，浓度-电流呈现较好的线性关系。

对比例6

1)将玻碳电极(直径3mm)打磨后用乙醇、丙酮、水(比例为1:1:1)的混合溶剂浸泡，超声清洗3分钟，然后氮气吹干备用；

2)使用电化学沉积法对上述玻碳电极进行纳米铂颗粒的修饰：将上述玻碳电极浸入氯铂酸、硫酸的混合电沉积液(其中氯铂酸的浓度为3mM，硫酸的浓度为0.6M)中，采用三电极体系进行电沉积。以玻碳电极作为工作电极，铂丝作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极，采用电流-时间法(I-t法)在-0.3V电沉积420秒，然后用水清洗电极表面，即得到表面修饰纳米铂颗粒的玻碳电极；

3)使用包埋固定法对上述表面修饰纳米铂颗粒的玻碳电极进行葡萄糖氧化酶的固定：在上述表面修饰纳米铂颗粒的玻碳电极上滴加4.5微升，5mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液，待水溶液即将晾干时，再向上述玻碳电极表面滴加2微升，2mg/mL的壳聚糖醋酸溶液(其中醋酸的浓度为0.8wt％)，最后放入干燥器中晾干，即得到作为对比的酶玻碳电极；

4)向pH＝6.2的KCl/PBS缓冲溶液中依次加入1mM葡萄糖、0.1mM抗坏血酸、0.1mM对乙酰氨基酚、0.1mM尿酸和1mM葡萄糖，在此过程中采用三电极体系以+0.5V作为恒定电位进行i-t扫描，其中工作电极为上述酶玻碳电极，实施例结果如附图9中所示，其中，加入葡萄糖和干扰物的时间间隔为40秒。将所加入的三种干扰物质得到的电流信号增加与葡萄糖的电流信号增加作对比，实施例结果如附图11b所示。结果显示，采用电化学氧化方法测试时，体系中存在的干扰物如对乙酰氨基酚、尿酸和抗坏血酸等会对测试结果产生明显的影响。

对比例7

1)将玻碳电极(直径3mm)打磨后用乙醇、丙酮、水(比例为1:1:1)的混合溶剂浸泡，超声清洗3分钟，然后氮气吹干备用；

2)使用物理气相沉积方法对上述玻碳电极表面进行纳米铂颗粒的修饰：用电子束蒸发方式在玻碳电极表面修饰厚度为5纳米的纳米铂颗粒；

3)分别配制pH＝7.2的KCl/PBS缓冲溶液，以及含有10Mm H₂O₂和10Mm抗坏血酸的pH＝7.2的KCl/PBS缓冲溶液；采用三电极体系对上述溶液进行线性伏安法扫描，其中工作电极为上述表面修饰纳米铂颗粒的玻碳电极，实施例结果如附图10所示，其中，扫描范围的最高电位为0.6V，最低电位为-0.6V，扫速为0.05V/s，扫描方向为从负电位到正电位。从图10中可以看出，采用电化学氧化方法测试时，非常容易受到体系中的干扰物的影响(图10a)；然而，采用如本发明中的还原方法进行检测时，当体系中存在干扰物时，检测的循环伏安信号没有明显的改变(图10b)，说明本发明的测试方法可以有效地防止常见干扰物的干扰。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种富氧电化学检测方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一富氧电化学检测装置，所述的装置包括：

三电极体系，所述的三电极体系包括一参比电极、一对电极和一工作电极，其中所述的工作电极为三相富氧电极，所述的三相富氧电极的第一表面与空气或氧气接触，第二表面与电解液接触；且所述的工作电极为阴极；

且所述的三相富氧电极为表面修饰过氧化氢还原催化剂颗粒，且固定有待测物质相应的氧化酶的基材；

(b)使所述装置与含有待测物质的样品接触，进行电化学检测，得到阴极还原电流信号；

(c)通过所述的阴极还原电流信号，得到含有待测物质的样品的浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的过氧化氢还原催化剂颗粒选自下组：碳、金属、金属盐、合金、有机材料还原催化剂，或其组合；优选地，所述金属选自下组：铂、铑、钌、金、钴、铁或镍，或其组合；所述有机材料还原催化剂选自下组：生物材料和/或金属有机配合物；优选地，所述生物材料为细胞色素C，过氧化氢氧化酶、普鲁士兰，或其组合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基材选自下组：金属材料、碳材料、高分子多孔材料；优选地，所述的基材选自下组：碳纤维纸、碳纳米管、3D石墨烯、泡沫铜。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基材为疏水的碳纤维纸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测物质选自下组：葡萄糖，胆固醇，乳酸，乙酰胆碱，醇类，或其组合；和/或

所述的待测物质相应的氧化酶选自下组：葡萄糖氧化酶，α-磷酸甘油氧化酶，胆固醇酯酶，胆固醇脱氢酶，胆固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖脱氢酶，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，胆红素氧化酶，抗坏血酸氧化酶，过氧化物酶，尿酸酶，胶原酶，质酸酶，蛋白酶或蛋白水解酶，或其组合。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的基材是通过以下方法制备的：

(1)提供具有疏水结构的导电基材；

(2)在所述疏水结构上加载固定所述催化材料；

(3)在所述疏水结构上施加含有待测物质相应的氧化酶的溶液，并室温干燥，从而使所述待测物质相应的氧化酶附着于所述疏水结构表面。

7.一种葡萄糖电化学检测装置，其特征在于，所述的装置包括：

三电极体系，所述的三电极体系包括一参比电极、一对电极和一工作电极，其中所述的工作电极为三相富氧电极，所述的三相富氧电极的第一表面与空气或氧气接触，第二表面与电解液接触；且所述的工作电极为阴极；

且所述的三相富氧电极为表面修饰过氧化氢还原催化剂颗粒，且固定有待测物质相应的氧化酶的基材。

8.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述的基材选自下组：金属材料、碳材料、高分子多孔材料；优选地，所述的基材选自下组：碳纤维纸、碳纳米管、3D石墨烯、泡沫铜。

9.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述的过氧化氢还原催化剂颗粒选自下组：碳、金属、金属盐、合金、有机材料还原催化剂，或其组合；优选地，所述金属选自下组：铂、铑、钌、金、钴、铁或镍，或其组合；所述有机材料还原催化剂选自下组：生物材料和/或金属有机配合物；优选地，所述生物材料为细胞色素C，过氧化氢氧化酶、普鲁士兰，或其组合。

10.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述的待测物质相应的氧化酶选自下组：葡萄糖氧化酶、α-磷酸甘油氧化酶，胆固醇酯酶，胆固醇脱氢酶，胆固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖脱氢酶，乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶，胆红素氧化酶，抗坏血酸氧化酶，过氧化物酶，尿酸酶，胶原酶，质酸酶，蛋白酶、蛋白水解酶，或其组合。