CN114740068A - 一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，包括：制备二氯二甲基联吡啶锇；将二氯二甲基联吡啶锇加入到无水乙醇中混合，在混合溶液中加入聚乙烯异丁基醚，氮气置换，在氮气保护下加热回流以充分反应，反应结束后加入乙醚溶液搅拌过滤，得到锇氧化还原聚合物溶液；将得到的锇氧化还原聚合物溶液与葡萄糖氧化酶、Genipin溶液进行混合，配置成内膜混合溶液；将内膜混合溶液涂覆盖在电极表面，待内膜混合溶液干燥后再涂覆一层聚氨酯外膜，电极干燥后保存备用。本发明采用一种天然生物交联剂Genipin来代替传统的交联剂以制备葡萄糖传感器，在类似条件下与使用传统交联剂的酶电极相比，提供了更好的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，具体的说，是涉及一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法。
背景技术
糖尿病是一类以高血糖为主要特征的由体内胰岛素分泌缺陷或者组织细胞的胰岛素抵抗引起的代谢性疾病。糖尿病可导致许多并发症，如肾损伤、失明、神经疾病和血管疾病。为了避免糖尿病引起的并发症，仔细的血糖监测和管理是必要的，持续监测血糖水平对糖尿病治疗具有重要意义。葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOx)因其高选择性和极高的灵敏度而成为目前应用最广泛的葡萄糖分析试剂。通过葡萄糖与葡萄糖氧化酶GOx反应产生的法拉奇电流可以检测出葡萄糖的浓度。
用于葡萄糖氧化的介导酶电极作为高特异性的葡萄糖生物传感器具有广泛应用。有效的介导酶电极操作需要一个固定策略，以限制酶和氧化还原介质接近电极表面。有多种方法可以捕获生物催化剂而不影响其活性，例如酶在修饰电极表面的共价接枝、采用层层技术、以及最广泛使用的交联剂将生物催化剂与氧化还原聚合物链结合。迄今为止，在氧化还原聚合物水凝胶中共固定化酶的大多数研究都是基于二环氧交联剂聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)的使用，以提高膜的稳定性。
发明内容
为了克服现有的技术的不足， 本发明提供一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法。
本发明技术方案如下所述：
一方面，一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，包括：
步骤S1、制备二氯二甲基联吡啶锇；
步骤S2、将二氯二甲基联吡啶锇加入到无水乙醇中混合，在混合溶液中加入聚乙烯异丁基醚，氮气置换，在氮气保护下加热回流以充分反应，反应结束后加入乙醚溶液搅拌过滤，得到锇氧化还原聚合物溶液；
步骤S3、将得到的锇氧化还原聚合物溶液与葡萄糖氧化酶、Genipin溶液进行混合，配置成内膜混合溶液；
步骤S4、将内膜混合溶液涂覆盖在电极表面，待内膜混合溶液干燥后再涂覆一层聚氨酯外膜，电极干燥后保存备用。
根据上述方案的本发明，步骤S1具体包括：
步骤S11、将氯锇酸钾、二甲基联吡啶加入到二甲基甲酰胺中，氩气保护，搅拌使溶液混合均匀，加热回流以充分反应，反应结束后将溶液过滤；
步骤S12、在滤液中加入甲醇，产生沉淀物，然后用乙醚洗涤沉淀物，得到暗红色产物；
步骤S13、待暗红色产品干燥后，将暗红色产品溶解在二甲基甲酰胺/甲醇溶液中，然后再加入连二亚硫酸钠溶液，搅拌使溶液混合均匀；
步骤S14、将搅拌均匀后的溶液置于冰浴中结晶，得到二氯二甲基联吡啶锇。
根据上述方案的本发明，步骤S1具体包括：
步骤S11、将50mg的氯锇酸钾、405mg的二甲基联吡啶加入到40ml的二甲基甲酰胺中，氩气保护，搅拌使溶液混合均匀，加热回流以充分反应，反应结束后将溶液过滤；
步骤S12、在滤液中加入20ml的甲醇，产生沉淀物，然后用乙醚洗涤沉淀物，得到暗红色产物；
步骤S13、待暗红色产品干燥后，将暗红色产品溶解在19ml 2：1的二甲基甲酰胺/甲醇溶液中，然后再加入130ml 1%的连二亚硫酸钠溶液，搅拌使溶液混合均匀；
步骤S14、将搅拌均匀后的溶液置于冰浴中结晶，得到二氯二甲基联吡啶锇。
根据上述方案的本发明，步骤S2具体为：将132mg的二氯二甲基联吡啶锇加入到200mL的无水乙醇中混合，在混合溶液中加入200mg的聚乙烯异丁基醚，氮气置换，在氮气保护下78℃加热回流以充分反应，反应结束后加入1.5L的乙醚溶液搅拌过滤，得到锇氧化还原聚合物溶液。
进一步的，在步骤S2中，氮气置换的次数为3次。
进一步的，在步骤S3之前还包括：配置20mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液和10%的Genipin溶液。
根据上述方案的本发明，步骤S3具体为：取140μL的锇氧化还原聚合物溶液与60μL的葡萄糖氧化酶、7.5μL 10%的Genipin溶液进行混合，配置成内膜混合溶液。
根据上述方案的本发明，步骤S4具体为：将内膜混合溶液涂覆盖在丝网印刷碳电极表面，待内膜混合溶液干燥后再涂覆一层聚氨酯外膜，丝网印刷碳电极干燥后保存备用。
进一步的，在步骤S4中，丝网印刷碳电极干燥后放入磷酸缓冲盐溶液中保存备用。
另一方面，本发明提供一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，包括：
步骤S1、制备二氯二甲基联吡啶锇；
步骤S2、将132mg的二氯二甲基联吡啶锇加入到200mL的无水乙醇中混合，在混合溶液中加入200mg的聚乙烯异丁基醚，氮气置换，在氮气保护下78℃加热回流以充分反应，反应结束后加入1.5L的乙醚溶液搅拌过滤，得到锇氧化还原聚合物溶液；
步骤S3、取140μL的锇氧化还原聚合物溶液与60μL的葡萄糖氧化酶、7.5μL 10%的Genipin溶液进行混合，配置成内膜混合溶液；
步骤S4、将内膜混合溶液涂覆盖在丝网印刷碳电极表面，待内膜混合溶液干燥后再涂覆一层聚氨酯外膜，丝网印刷碳电极干燥后放入磷酸缓冲盐溶液中保存备用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明采用一种天然生物交联剂Genipin来代替传统的交联剂以制备葡萄糖传感器，在类似条件下与使用传统交联剂的酶电极相比，提供了更好的稳定性，且Genipin的毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂，保证了安全性的同时也能提高交联材料的热稳定性、拉伸性能、长期稳定性，降低溶胀率。
附图说明
图1为本发明实施例一的流程图；
图2为图1中步骤S1的具体流程图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
实施例一
请参阅图1、图2，本发明实施例提供了一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、制备二氯二甲基联吡啶锇，具体为：
步骤S11、将氯锇酸钾、二甲基联吡啶加入到二甲基甲酰胺（DMF）中，氩气保护防止被氧化，搅拌使溶液混合均匀，加热回流使反应物尽可能的充分反应以提高转化率，反应结束后将溶液过滤；
步骤S12、在滤液中加入甲醇，产生沉淀物，然后用乙醚洗涤沉淀物，清洗掉多余的杂质和未反应完全的反应物，得到暗红色产物；
步骤S13、待暗红色产品干燥后，将暗红色产品溶解在二甲基甲酰胺/甲醇（DMF/MeOH）溶液中，然后再加入连二亚硫酸钠（Na2O4S2）溶液，搅拌使溶液混合均匀；
步骤S14、将搅拌均匀后的溶液置于冰浴中结晶，得到二氯二甲基联吡啶锇。
采用上述方法制备的二氯二甲基联吡啶锇原料来源简单，可操作空间大，收率高，易于分离。二氯二甲基联吡啶锇作为传递电子的介体具有性质稳定，传递效率高的特点，容易与电极表面形成有效的电子转移通道，对传感器具有良好的电催化性能，相比市场同类的产品能够有较长时间的响应；相比较普通的锇联吡啶，二氯二甲基联吡啶锇上含有活泼的氯离子可以修饰酶分子上的氨基，使形成的锇氧化还原聚合物交联更完全。
步骤S2、将二氯二甲基联吡啶锇加入到无水乙醇中混合，在混合溶液中加入聚乙烯异丁基醚（PVI），氮气置换，将容器内的氧气置换到低于爆炸极限，防止合成气与氧气混合而发生爆炸，在氮气保护下加热回流以充分反应，反应结束后加入乙醚溶液搅拌过滤，除去多余杂质和未反应完全的反应物，得到锇氧化还原聚合物溶液。
步骤S3、将得到的锇氧化还原聚合物溶液与葡萄糖氧化酶、Genipin溶液进行混合，配置成内膜混合溶液。
步骤S4、将内膜混合溶液涂覆盖在电极表面，待内膜混合溶液干燥后再涂覆一层聚氨酯外膜，聚氨酯（PU）外膜的作用是限制葡萄糖的进入，电极干燥后保存备用。
Genipin(Gnp，京尼平)是一种优良的天然生物交联剂，从化学结构上看，Genipin是一个环烯醚萜类的杂环化合物，它具有-OH、-COOH等多个活性官能基团，可以自发的和氨基起反应，达到以单分子或多分子形式交联的效果。常见的化学交联剂如戊二醛、PEGDGE等虽然能够增强交联材料的稳定性和亲水性，但其仍具有细胞毒性，存在安全性和潜在风险问题，且经戊二醛交联改性后的材料，在水环境中戊二醛会部分溢出，导致交联的材料具有一定的细胞毒性，不适合用于生物医学等领域，而天然生物交联剂京尼平能够在不引入外源毒性物质的同时能取得比较理想的交联效果。本发明采用天然生物交联剂Genipin来代替传统的交联剂以制备葡萄糖传感器，在类似条件下与使用传统交联剂的酶电极相比，保证了安全性的同时也能提高交联材料的热稳定性、拉伸性能、长期稳定性，降低溶胀率。
实施例二
本发明提供一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、制备二氯二甲基联吡啶锇，具体为：
步骤S11、将50mg的氯锇酸钾、405mg的二甲基联吡啶加入到40ml的二甲基甲酰胺中，氩气保护，搅拌使溶液混合均匀，加热回流使反应物尽可能的充分反应以提高转化率，反应结束后将溶液过滤；
步骤S12、在滤液中加入20ml的甲醇，产生沉淀物，然后用乙醚洗涤沉淀物，清洗掉多余的杂质和未反应完全的反应物，得到暗红色产物；
步骤S13、待暗红色产品干燥过夜后，将暗红色产品溶解在19ml 2：1的二甲基甲酰胺/甲醇溶液中，然后再加入130ml 1%的连二亚硫酸钠溶液，搅拌使溶液混合均匀；
步骤S14、将搅拌均匀后的溶液置于冰浴中结晶，得到二氯二甲基联吡啶锇。
采用上述方法制备的二氯二甲基联吡啶锇原料来源简单，可操作空间大，收率高，易于分离。二氯二甲基联吡啶锇作为传递电子的介体具有性质稳定，传递效率高的特点，容易与电极表面形成有效的电子转移通道，对传感器具有良好的电催化性能，相比市场同类的产品能够有较长时间的响应；相比较普通的锇联吡啶，二氯二甲基联吡啶锇上含有活泼的氯离子可以修饰酶分子上的氨基，使形成的锇氧化还原聚合物交联更完全。
步骤S2、将132mg的二氯二甲基联吡啶锇加入到200mL的无水乙醇中混合，在混合溶液中加入200mg的聚乙烯异丁基醚，氮气置换3次或者更多次，将容器内的氧气置换到低于爆炸极限，防止合成气与氧气混合而发生爆炸，在氮气保护下78℃加热回流3天以充分反应，反应结束后加入1.5L的乙醚溶液搅拌过滤，得到锇氧化还原聚合物溶液。
步骤S3、配置20mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液和10%的Genipin溶液。
步骤S4、取140μL的锇氧化还原聚合物溶液与60μL的葡萄糖氧化酶、7.5μL 10%的Genipin溶液进行混合，配置成内膜混合溶液。采用上述比例配置溶液可以提高膜混合溶液的交联程度。
步骤S5、将内膜混合溶液涂覆盖在丝网印刷碳电极（SPCE）表面，待内膜混合溶液干燥后再涂覆一层聚氨酯外膜，丝网印刷碳电极干燥后放入磷酸缓冲盐溶液（PBS）中保存备用。
通过上述步骤制备的葡萄糖传感器，在类似条件下与使用传统交联剂的酶电极相比，提供了更好的稳定性，且Genipin的毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂，使用或者制备时更能保证人们的生命安全。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
上面结合附图对本发明专利进行了示例性的描述，显然本发明专利的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明专利的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明专利的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，包括：
步骤S1、制备二氯二甲基联吡啶锇；
步骤S2、将二氯二甲基联吡啶锇加入到无水乙醇中混合，在混合溶液中加入聚乙烯异丁基醚，氮气置换，在氮气保护下加热回流以充分反应，反应结束后加入乙醚溶液搅拌过滤，得到锇氧化还原聚合物溶液；
步骤S3、将得到的锇氧化还原聚合物溶液与葡萄糖氧化酶、Genipin溶液进行混合，配置成内膜混合溶液；
步骤S4、将内膜混合溶液涂覆盖在电极表面，待内膜混合溶液干燥后再涂覆一层聚氨酯外膜，电极干燥后保存备用。
2.根据权利要求1所述的基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，步骤S1具体包括：
步骤S11、将氯锇酸钾、二甲基联吡啶加入到二甲基甲酰胺中，氩气保护，搅拌使溶液混合均匀，加热回流以充分反应，反应结束后将溶液过滤；
步骤S12、在滤液中加入甲醇，产生沉淀物，然后用乙醚洗涤沉淀物，得到暗红色产物；
步骤S13、待暗红色产品干燥后，将暗红色产品溶解在二甲基甲酰胺/甲醇溶液中，然后再加入连二亚硫酸钠溶液，搅拌使溶液混合均匀；
步骤S14、将搅拌均匀后的溶液置于冰浴中结晶，得到二氯二甲基联吡啶锇。
3.根据权利要求1所述的基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，步骤S1具体包括：
步骤S11、将50mg的氯锇酸钾、405mg的二甲基联吡啶加入到40ml的二甲基甲酰胺中，氩气保护，搅拌使溶液混合均匀，加热回流以充分反应，反应结束后将溶液过滤；
步骤S12、在滤液中加入20ml的甲醇，产生沉淀物，然后用乙醚洗涤沉淀物，得到暗红色产物；
步骤S13、待暗红色产品干燥后，将暗红色产品溶解在19ml 2：1的二甲基甲酰胺/甲醇溶液中，然后再加入130ml 1%的连二亚硫酸钠溶液，搅拌使溶液混合均匀；
步骤S14、将搅拌均匀后的溶液置于冰浴中结晶，得到二氯二甲基联吡啶锇。
4.根据权利要求1所述的基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，步骤S2具体为：将132mg的二氯二甲基联吡啶锇加入到200mL的无水乙醇中混合，在混合溶液中加入200mg的聚乙烯异丁基醚，氮气置换，在氮气保护下78℃加热回流以充分反应，反应结束后加入1.5L的乙醚溶液搅拌过滤，得到锇氧化还原聚合物溶液。
5.根据权利要求4所述的基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，氮气置换的次数为3次。
6.根据权利要求4所述的基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S3之前还包括：配置20mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液和10%的Genipin溶液。
7.根据权利要求1所述的基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，步骤S3具体为：取140μL的锇氧化还原聚合物溶液与60μL的葡萄糖氧化酶、7.5μL 10%的Genipin溶液进行混合，配置成内膜混合溶液。
8.根据权利要求1所述的基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，步骤S4具体为：将内膜混合溶液涂覆盖在丝网印刷碳电极表面，待内膜混合溶液干燥后再涂覆一层聚氨酯外膜，丝网印刷碳电极干燥后保存备用。
9.根据权利要求8所述的基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，丝网印刷碳电极干燥后放入磷酸缓冲盐溶液中保存备用。
10.一种基于Genipin的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，包括：
步骤S1、制备二氯二甲基联吡啶锇；
步骤S2、将132mg的二氯二甲基联吡啶锇加入到200mL的无水乙醇中混合，在混合溶液中加入200mg的聚乙烯异丁基醚，氮气置换，在氮气保护下78℃加热回流以充分反应，反应结束后加入1.5L的乙醚溶液搅拌过滤，得到锇氧化还原聚合物溶液；
步骤S3、取140μL的锇氧化还原聚合物溶液与60μL的葡萄糖氧化酶、7.5μL 10%的Genipin溶液进行混合，配置成内膜混合溶液；
步骤S4、将内膜混合溶液涂覆盖在丝网印刷碳电极表面，待内膜混合溶液干燥后再涂覆一层聚氨酯外膜，丝网印刷碳电极干燥后放入磷酸缓冲盐溶液中保存备用。
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