KR20220096570A - 펜타플루오로페닐 에스터를 포함하는 고분자 및 이를 포함하는 전기화학적 바이오센서 - Google Patents

펜타플루오로페닐 에스터를 포함하는 고분자 및 이를 포함하는 전기화학적 바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전기화학센서의 제조에 사용되는 폴리펜타플루오로페닐 에스터 기반의 중합체로서, 아민 작용기와의 높은 반응성을 가지고, 가수분해가 덜 일어나며, 유기용매에 범용적으로 좋은 용해도를 가질 뿐 아니라 유사 구조를 갖는 고분자들과 비교시 입체 장애 및 독성이나 부작용 문제가 낮아, 특히 연속적인 혈당 모니터링 센서와 같이 인체 내에 센서의 일부가 들어가는 삽입형 장치에 유용하다.

Description

펜타플루오로페닐 에스터를 포함하는 고분자 및 이를 포함하는 전기화학적 바이오센서{Polymer comprising pentafluorophenyl ester and electrochemical biosensor comprising the same}
본 발명은 전자전달매개체 및 산화환원효소를 전기화학적 바이오센서와 같은 장치 중의 전극 표면에 고정시키기 위해 유용한 펜타플루오로페닐 에스터를 포함하는 고분자 및 이를 포함하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.
당뇨병은 높은 혈당 수치가 오랫동안 지속되었을 때 나타나는 질환으로 심혈관 질환, 뇌졸증, 신장 질환 등의 합병증을 유발한다. 높은 혈당 수치에 대응하여 인슐린 주입을 통해 혈당 수치를 감소시키는 과정이 필요하지만 만약 인슐린이 과다 주입된다면, 저혈당증이 발생하고 이를 통해 쇼크 또는 사망에 이르는 수도 있다. 이를 방지하기 위해 당뇨병 환자들은 적절한 혈당 수치를 유지하려는 목적으로 혈당측정센서를 이용하여 지속적으로 체내 혈당 농도를 측정하는 것이 필수적이다.
최근에는, 연속혈당측정시스템(Continuous Glucose Monitoring System, CGMS)이 적용된 혈당센서가 많이 연구되고 상용화되었다. CGMS 센서는 피하조직에 삽입되어 혈액이 아닌 세포간액을 통해 연속적으로 포도당 농도를 측정하는 장치이다. 손가락 채혈 방식의 경우 하루에 5 ~ 6번의 혈당 측정으로는 정확한 혈당 수치 변화를 확인하기 어려운 반면, CGMS는 하루에 혈당 수치 변화와 경향성을 확인할 수 있는 장점이 있다. 이를 통해 환자가 고혈당증 또는 저혈당증을 빠르게 인지할 수 있고 혈당 관리 능력이 더욱 개선될 수 있다.
바이오센서는 선택적으로 생체 시료를 감지하고, 이를 특정 신호로 전환해주는 기기를 뜻한다. 특히 전기화학적 방식을 이용한 효소 기반의 바이오센서는 효소에 의해 선택성이 향상될 뿐만 아니라 소형화가 가능하고 측정의 정확성 때문에 많이 선호된다. 전기화학방식을 이용한 혈당 바이오센서는 크게 1세대와 2세대 방식으로 나누어진다. 1세대 혈당 센서는 클라크(Clark)와 리옹(Lyon)에 의해 처음 개발되었으며, 효소의 산화-환원 반응을 거쳐 감소한 산소 농도 및 발생한 과산화 수소의 농도 변화를 통해 혈당 수치를 측정하는 방식이고, 2세대 혈당 센서는 효소의 산화-환원 반응을 통해 발생한 전자를 전자전달매개체를 통해서 전극에 전달해주는 방식이다. 2세대 센서는 1세대 센서보다 산소 농도에 따른 오차가 적고, 매개체에 의한 전자전달 반응이 효율적이고 빠르다는 점에서 많은 장점을 가지고 있다. 이러한 이유로, 전자전달매개체를 포함하는 2세대 센서 방식이 CGMS 혈당 센서에 적용되고 있다.
전기화학방식의 효소기반 혈당 바이오센서는 일반적으로 효소, 전자전달매개체, 전극으로 구성되어 있다. 처음에는 효소에 의해 포도당이 글루코노락톤(gluconolactone)으로 산화되고, 이어서 환원된 효소는 산화되면서 전자전달매개체에 전자를 내어준다. 그 다음 환원된 매개체가 산화되면서 전극으로 전자를 전달해주는 과정을 거친다. 이러한 일련의 과정으로부터 혈당 수치를 전기적 신호로 확인할 수 있다.
혈당 센서의 제작하는데 있어서 전극 표면에 전자전달매개체와 효소를 고정하는 방법은 매우 중요하다. 이전까지는 전자전달매개체를 포함한 산화-환원 수화 고분자를 효소와 섞어 가교제를 첨가해 전극에 고정시키는 방법이 연구되어왔다. 그 중에서도 폴리바이닐피리딘(polyvinylpyridine)과 폴리바이닐이미다졸(polyvinylimidazole)이 산화-환원 고분자 매트릭스로 잘 알려져 있다. 하지만 이러한 기존의 산화-환원 고분자들은 하기 반응식 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 최종 재료의 합성 단계가 길고 복잡하고, 전이금속 착체의 낮은 고정화 효율을 나타낼 뿐 아니라, 고분자에 다른 기능성의 도입이 어렵다는 문제를 가지고 있었다. 따라서, 현재까지도 우수한 성능의 산화-환원 고분자의 개발을 위해서 기존 재료들의 한계를 벗어나 새로운 소재들의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 전기화학적 바이오센서를 위한 전자전달매개체 및 효소를 고정하는데 유용한 고분자에 대해 연구를 거듭한 결과, 펜타플루오로페닐(Pentafluorophenyl, PFP) 에스터를 포함하는 고분자를 사용하는 경우 아민 작용기와의 높은 반응성을 가지고, 가수분해가 덜 일어나며, 유기용매에 범용적으로 좋은 용해도를 가질 뿐 아니라 유사 구조를 갖는 고분자들과 비교시 입체 장애와 독성이 적음을 확인하여 특히 연속적인 혈당 모니터링 센서와 같이 인체 내에 센서의 일부가 들어가는 삽입형 장치에 유용함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 펜타플루오로페닐 에스터를 포함하는 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 전이금속 착체 및 상기 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체를 포함하는 산화-환원 고분자 재료 박막 및 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 펜타플루오로페닐 에스터를 포함하는 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체, 상기 중합체 및 전이금속착체를 포함하는 전기화학적 바이오센서용 산화-환원 고분자, 이로부터 제조된 전기화학적 바이오센서용 산화-환원 고분자를 포함하는 산화-환원 고분자 재료 박막 및 이를 포함하는 전기화학적 바이오센서, 예컨대 혈당 센서에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체는 폴리펜타플루오로페닐 에스터에 기반하는 것으로, 구체적으로는 펜타플루오로페닐 에스터에 유래된 반복 단위를 포함하는, 산화-환원 고분자 재료의 고분자 전구체로서 사용된다. 바람직하게, 상기 중합체는 아민기를 포함하는 반응기를 갖는 가교물질 및 전이금속착체와 함께 전자전달매개체용 산화-환원 고분자 재료를 형성할 수 있다.
일 실시예로서, 본 발명에 따른 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체는 상기 폴리펜타플루오로페닐 에스터에, 아민기를 포함하는 가교물질로서 1차 및 2차 아민계 화합물을 사용하여 가아민분해(아미노분해, aminolysis)를 통해 도입하는 것을 특징으로 하는, 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체일 수 있다.
상기 산화-환원 고분자 재료용 중합체의 비제한적인 예로는, 폴리펜타플루오로페닐 아크릴레이트(PPFPA) 호모중합체, 폴리펜타플루오로페닐 메타크릴레이트(PPFPM) 호모중합체, 폴리펜타플루오로페닐 아크릴레이트-폴리다이메틸아크릴아마이드(PPFPA-PDMA) 공중합체, 폴리펜타플루오로페닐 메타크릴레이트-폴리다이메틸아크릴아마이드(PPFPM-PDMA) 공중합체, 폴리펜타플루오로페닐 아크릴레이트-폴리아크릴아마이드(PPFPA-PAA) 공중합체 및 폴리펜타플루오로페닐 메타크릴레이트-폴리아크릴아마이드(PPFPM-PAA) 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 중합체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체는 하기 화학식 1 또는 2의 구조를 갖는 것일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
상기 화학식 1 또는 2에서,
RT 및 RL 은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 사이클로알킬렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 30의 에틸렌 글라이콜기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 30의 헤테로아릴렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알케닐기 및 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알키닐기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 n는 10 내지 300의 정수이다.
바람직하게, 상기 RT 및 RL 은 각각 독립적으로 분자량 1,000 g/mol ~ 50,000 g/mol의 폴리다이메틸아크릴아마이드(PDMA), 폴리아크릴아마이드(PAA), 폴리스티렌(PS), 폴리에틸렌글라이콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리비닐이미다졸(PVI), 폴리비닐피리딘(PVP) 및 폴리실록산(PDMS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
일 예로서 본 발명에 따른 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체는, 1,000 g/mol 내지 500,000 g/mol 범위의 중량 평균 분자량을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리펜타플루오로페닐 에스터 기반의 중합체에 전이금속착체가 도입된 전기화학적 센서용 산화-환원 고분자 재료에 관한 것이다.
예를 들어, 이러한 산화-환원 고분자 재료는 상기 폴리펜타플루오로페닐 에스터 기반의 중합체를 아민기, 암모늄기, 할로젠기, 에폭시기, 아자이드기, 아크릴레이트기, 알케닐기, 알키닐기, 싸이올기, 이소시아네이트, 알코올기, 및 실란기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능기를 포함하는 화합물을 도입하여 기능화시키고, 이와 같이 기능화된 중합체에 전이금속착체를 결합시켜 제조할 수도 있다.
또한 상기 산화-환원 고분자 재료는 상기 폴리펜타플루오로페닐 에스터 기반의 중합체를 기능화시키는 대신, 전이금속착체의 리간드에 치환반응 및 첨가반응을 통해 아민기, 암모늄기, 싸이올기, 알코올기 등의 상기 가교물질과 같은 기능기를 도입하여 기능화시키고, 이와 같이 기능화된 전이금속착체와 상기 본 발명에 따른 중합체를 결합시켜 제조할 수도 있다.
또는, 상기 고분자 재료는 폴리펜타플루오로페닐 에스터 기반의 중합체 및 전이금속착체를 모두 아민기, 암모늄기, 할로젠기, 에폭시기, 아자이드기, 아크릴레이트기, 알케닐기, 알키닐기, 싸이올기, 이소시아네이트, 알코올기, 및 실란기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능기를 포함하는 가교물질을 사용하여 기능화 시켜 서로 결합시켜 제조할 수도 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 산화-환원 고분자 재료는 상기 폴리펜타플루오로페닐 에스터 기반의 중합체에 1차 및 2차 아민기 및 암모늄기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기능기 및 전이금속착체가 결합된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 전이금속착체는 하기 화학식 3 또는 4의 구조를 갖는 것일 수 있다.
[화학식 3]
Figure pat00003
[화학식 4]
Figure pat00004
상기 화학식 3 또는 4에서,
M 은 Os, Rh, Ru, Ir, Fe 및 Co 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 전이금속이고;
상기 화학식 3에서, LG1 및 LG2는 서로 합쳐져 하기 화학식 5 내지 6으로부터 선택되는 바이덴테이트 리간드를 형성하고;
LG3 및 LG4는 서로 합쳐져 하기 화학식 5 내지 6으로부터 선택되는 바이덴테이트 리간드를 형성하고; LG5 및 LG6는 각각 서로 합쳐져 하기 화학식 5 내지 6으로부터 선택되는 바이덴테이트 리간드를 형성하고;
[화학식 5]
Figure pat00005
[화학식 6]
Figure pat00006
상기 화학식 5에서 LC는 질소원자를 하나이상 포함한 헤테로 고리 화합물이며, 바람직하게 2번 위치에서 벤젠의 화학식과 연결될 수 있고,
상기 화학식 6에서 LN은 질소원자를 하나이상 포함한 헤테로 고리 화합물이며, 바람직하게 LN1과 LN2는 각각 2번 위치에서 서로 연결되어 있다.
RL은 헤테로 고리 화합물 LC, LN1 및 LN2 의 모든 작용기이다.
일 양태에서, 상기 R1, R2, R3, R4, R5 및 RL 은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 20의 에틸렌 글라이콜기 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알코올기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬할로젠기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 싸이올기, 치환 또는 비치환된 탄소 수 3 내지 20의 알킬아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 7 내지 30의 아릴아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알키닐기, 시아노기, 할로겐기, 중수소 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
일 양태에서, 상기 화학식 4의 LH1, LH3 및 LH4은 LH2을 중심으로 서로 합쳐져 하기 화학식 7로 나타내어지는 테트라덴테이트 리간드를 형성할 수 있다.
이때, LH5 및 LH6는 각각 화학식 8에 나타내어지는 바와 같이 전이금속 M에 대한 모노덴테이트 리간드를 형성하거나; LH5 및 LH6는 각각 서로 합쳐져 하기 화학식 9에 나타내어지는 바와 같이 전이금속 M에 대한 바이덴테이트 리간드를 형성하고;
[화학식 7]
Figure pat00007
상기 화학식 7에서 Ca, Cb 및 Cc는 각각 독립적으로 질소원자를 하나 이상 포함한 헤테로 고리 화합물이고, 바람직하게, 상기 헤테로 고리 화합물은 그 2번 위치에서 메틸아민과 연결될 수 있고, 상기 3개의 헤테로 고리가 갖는 3개의 질소와, 상기 3개의 헤테로 고리를 서로 연결하는 중심의 1개의 질소가 전이금속 M과 연결될 수 있다.
R1, R2, R3은 헤테로 고리 화합물 Ca, Cb, Cc의 모든 작용기를 의미한다.
일 양태에서, 상기 R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 20의 에틸렌 글라이콜기 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알코올기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬할로젠기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 싸이올기, 치환 또는 비치환된 탄소 수 3 내지 20의 알킬아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 7 내지 30의 아릴아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알키닐기, 시아노기, 할로겐기, 중수소 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 각각 독립적으로 고분자에 연결할 수 있는 반응기가 도입될 수 있다.
[화학식 8]
Figure pat00008
[화학식9]
Figure pat00009
상기 화학식 8에서,
LH5 및 LH6는 각각 모노덴테이트 리간드이며, 각각 독립적으로 -H, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NCCH3, -CO, -OH2, -NH3 또는 질소원자를 하나이상 포함한 헤테로 고리 화합물일 수 있다.
상기 화학식 9에서,
LH5-LH6는 바이덴테이트 리간드이며, 카테콜, 아세틸아세톤, 2-피콜리닉애시드, 2-피리딘카복사마이드, 2,2’-바이피리딘 또는 2,2’-바이싸이아졸일 수 있다.
상기 L1은 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20 의 사이클로알킬렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 에틸렌 글라이콜기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기, 및 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 30의 헤테로아릴렌기로 이루어진 군으로부터 선택 되고;
상기 Ａa는 아민기 및 암모늄기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양태는 상기 중합체를 포함하는 산화-환원 중합체 재료를 전극에 코팅한 후, 코팅된 전극을 경화시키는 단계를 포함하는, 산화-환원 고분자 재료 박막의 제조방법 및 이에 의해 제조된 산화-환원 고분자 재료 박막 및 이를 포함하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 추가 일 양태는 액체성 생체시료를 산화환원시킬 수 있는 효소와 상기 전이금속 착체를 포함하는 전자전달 매개체를 포함하는 전기화학적 바이오센서용 센싱 막에 관한 것이다.
산화환원효소는 생체의 산화환원반응을 촉매하는 효소를 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 측정하고자 하는 대상물질, 예컨대 바이오센서의 경우에는 측정하고자 하는 대상물질과 반응하여 환원되는 효소를 의미한다. 이와 같이 환원된 효소는 전자 전달 매개체와 반응하며, 이 때 발생한 전류변화 등의 신호를 측정하여 대상물질을 정량하게 된다. 본 발명에 사용 가능한 산화환원효소는 각종 탈수소효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 에스테르화효소(esterase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 산화환원 또는 검출 대상 물질에 따라서, 상기 효소 군에 속하는 효소들 중에서 상기 대상 물질을 기질로 하는 효소를 선택하여 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 산화환원효소는 글루코오스탈수소효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소효소(glutamate dehydrogenase), 글루코오스산화효소(glucose oxidase), 콜레스테롤산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트산화효소(lactate oxidase), 아스코르브산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈산화효소(bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한편, 상기 산화환원효소는 측정하고자 하는 대상물질(예컨대, 대상물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자 (cofactor)를 함께 포함할 수 있는데, 예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 혈중 글루코오스 농도를 측정하고자 하는 경우, 상기 산화환원효소로서 글루코오스 탈수소효소(glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할 수 있으며, 상기 글루코오스 탈수소효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소(flavin adenine dinucleotide- glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및/또는 보조인자로서 FAD-GDH를 포함하는 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (nicotinamide adenine dinucleotide- glucose dehydrogenase)일 수 있다.
구체예에서, 상기 사용 가능한 산화환원효소는 FAD-GDH (예컨대, EC 1.1.99.10 등), NAD-GDH (예컨대, EC 1.1.1.47 등), PQQ-GDH (예컨대, EC1.1.5.2 등), 글루탐산탈수소효소 (예컨대, EC 1.4.1.2 등), 글루코오스산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.4 등), 콜레스테롤산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.6 등), 콜레스테롤에스테르화효소 (예컨대, EC 3.1.1.13 등), 락테이트산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.2 등), 아스코빅산산화효소 (예컨대, EC 1.10.3.3 등), 알코올산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.13 등), 알코올탈수소효소 (예컨대, EC 1.1.1.1 등), 빌리루빈산화효소 (예컨대, EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
가장 바람직하게, 상기 산화환원효소는 37℃ 완충용액에서 1주일 동안 70% 이상의 활성도를 유지할 수 있는 글루코오스 탈수소효소이다.
본 발명에 따른 센싱 막은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 산화-환원 중합체 20 내지 700 중량부, 예컨대 60 내지 700 중량부 또는 30 내지 340 중량부를 함유할 수 있다. 상기 산화-환원 중합체의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 센싱 막은 막 성능의 증가를 위해 카본 나노튜브를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 카본 나노튜브는 전이금속착체, 특히 오스뮴과 함께 사용시 전자전달속도가 증가되어 센싱 막의 성능을 더욱 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 센싱 막은 가교제를 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 센싱 막은 계면활성제, 수용성 고분자, 4차 암모늄염, 지방산, 점증제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 시약 용해시의 분산제, 시약 제조시의 점착제, 장기 보관의 안정제 등의 역할을 위하여 추가로 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 조성물을 분주할 때 조성물이 전극위에서 골고루 퍼져서 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X-100 (Triton X-100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate), 소듐스테아레이트 (sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 적절하게 수행하도록 하기 위하여, 상기 계면활성제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 3 내지 25 중량부, 예컨대 10 내지 25 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 계면활성제 10 내지 25 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 계면활성제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 시약 조성물의 고분자 지지체로서 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 수행하는 것일 수 있다. 상기 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트(polyperfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate), 폴리아미드 (polyamide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 산화환원효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을 충분하고 적절하게 발휘하도록 하기 위하여, 상기 수용성 고분자를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 수용성 고분자 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 수용성 고분자의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 지지체 및 효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역학을 효과적으로 수행하기 위하여 중량평균분자량이 2,500 g/mol 내지 3,000,000 g/mol 정도, 예컨대, 5,000 g/mol 내지 1,000,000 g/mol 정도일 수 있다.
상기 점증제는 시약을 전극에 견고하게 부착하도록 하는 역할을 한다. 상기 점증제로는 나트로졸, 디에틸아미노에틸-덱스트란 하이드로클로라이드 (DEAE-Dextran hydrochloride) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 전기화학적 센서는, 본 발명에 따른 산화-환원 중합체가 전극에 견고하게 부착되도록 하기 위하여, 상기 점증제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 90 중량부, 예컨대 30 내지 90 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 점증제 30 내지 90 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 점증제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 이러한 유기전자전달매개체를 포함하는 장치, 바람직하게, 삽입가능한 장치일 수 있다. 또한 바람직하게, 상기 장치는 전기화학적 바이오센서일 수 있고, 더욱 바람직하게 전기화학적 글루코오스(혈당)센서일 수 있다.
구체적으로, 상기 전기화학적 바이오센서의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 연속적인 혈당 모니터링 센서일 수 있다.
이러한 연속적인 혈당 모니터링 센서의 구성으로, 본 발명은, 예를 들어 전극, 절연체(insulator), 기판, 상기 산화-환원 중합체 및 산화환원효소를 포함하는 센싱 막(sensing layer), 확산 막(diffusion layer), 보호 막(protection layer) 등을 포함할 수 있다. 전극의 경우, 작동 전극 및 대향 전극과 같은 2종의 전극을 포함할 수도 있고, 작동 전극, 대향 전극 및 기준 전극과 같은 3종의 전극을 포함할 수도 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 바이오센서는, 적어도 두개, 바람직하게는 두개 또는 세개의 전극을 갖춘 기판에, 상기 화학식 1의 유기계열 전자전달매개체를 포함하는 산화-환원 중합체와 액체성 생체시료를 산화환원시킬 수 있는 효소를 포함하는 시약 조성물을 도포한 후 건조하여 제작한 전기화학적 바이오센서일 수 있다. 예를 들면, 전기화학적 바이오센서에 있어서 작동 전극 및 대향 전극이 기판의 서로 반대면에 구비되고, 상기 작동 전극 위에 본 발명에 따른 유기계열 전자전달매개체를 갖는 산화-환원 중합체가 포함되는 센싱 막이 적층되고, 작동 전극 및 대향 전극이 구비된 기판의 양쪽 면에 차례로 절연체, 확산막 및 보호막이 적층되는 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다.
구체적인 양태로서, 상기 기판은 PET(polyethylene terephthalate), PC(polycarbonate) 및 PI(polyimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소재로 된 것일 수 있다.
또한, 작동 전극은 탄소, 금, 백금, 은 또는 은/염화은 전극을 사용할 수 있다.
또한, 2 전극을 갖는 전기화학적 바이오센서의 경우 대향 전극이 기준 전극의 역할까지 같이 하기 때문에, 대향 전극으로 금, 백금, 은 또는 은/염화은 전극을 사용할 수 있고, 기준 전극까지 포함하는 3 전극의 전기화학적 바이오센서의 경우, 기준 전극으로 금, 백금, 은 또는 은/염화은 전극을 사용할 수 있고, 대향 전극으로 탄소 전극을 사용할 수 있다.
확산막으로는 Nafion, cellulose acetate, silicone rubber를 사용할 수 있으며, 보호막으로는 silicone rubber, polyurethane, polyurethane 기반 copolymer 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
제한되지 않은 예로서, 2 전극인 경우 대향전극이 기준전극의 역할까지 같이 하기 때문에 염화은 또는 은이 사용될 수 있으며, 3 전극일 경우 기준전극이 염화은 또는 은이 사용되고, 대향 전극은 탄소 전극을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예는 전기화학적 바이오센서의 적용 가능한 예로서 글루코오스를 측정하기 위한 바이오센서를 예시하고 있지만, 본 발명의 시약조성물에 포함되는 효소의 종류를 달리함으로써 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 과산화수소, 알코올, 아미노산, 글루타메이트와 같은 다양한 물질의 정량을 위한 바이오센서에 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펜타플루오로페닐 에스터 기반의 중합체는 전기화학적 센서에 이용하는 경우 아민 작용기와의 높은 반응성을 가지고, 가수분해가 덜 일어나며, 유기용매에 대한 높은 용해도를 가지며, 체 장애 및 독성이나 부작용 문제가 낮아, 특히 연속적인 혈당 모니터링 센서와 같이 인체 내에 센서의 일부가 들어가는 삽입형 장치에 유용하다.
도 1은 도 1은 본 발명에 따른 PFPA 고분자 P1에 오스뮴 착물 22를 첨가한 후 19F NMR을 통한 반응 모니터링 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 PFPA 고분자(36)와 오스뮴 착물(22, 33)이 최종 반응이 진행되었을 때의 19F NMR 그리고 이를 통해 예상한 산화-환원 고분자(37, 38)의 비율을 확인한 그래프이다.
도 3은 실시예 1-4의 C-N 리간드를 포함하는 전이금속착체 및 PFP 고분자를 포함하는 산화-환원 고분자의 합성을 확인한 19F NMR 데이터이다.
도 4는 실시예 1-5의 C-N 리간드를 포함하는 전이금속착체 및 PFP 고분자를 포함하는 산화-환원 고분자의 합성을 확인한 19F NMR 데이터이다.
도 5는 산화-환원 중합체 및 효소의 조성과 SPCEs 전극 표면 위 가교 방법 모식도
도 6a는 본 발명에 따른 산화-환원 고분자(37 및 38)를 200초 마다 포도당 농도를 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100 mM를 증가시켰을 때 나타난 전류의 변화(위), 포도당 농도에 따른 전류의 변화(아래), 좌측은 저농도 구간(0 ~ 1 mM), 우측은 전체 구간(0 ~ 100 mM)를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 본 발명에 따른 산화-환원 고분자(C-N 리간드를 포함하는 전이금속 착체 및 PFP 고분자를 포함하는 산화-환원 고분자 1)를 200초 마다 포도당 농도를 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 mM를 증가시켰을 때 나타난 전류의 변화(위-좌측), 포도당 농도에 따른 전류의 변화(위-우측) 및 200초마다 포도당 농도를 0, 1, 5, 10, 50, 100 mM를 증가시켰을 때 나타난 전류의 변화(아래-좌측), 포도당 농도에 따른 전류의 변화(아래-우측)를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 본 발명에 따른 산화-환원 고분자(C-N 리간드를 포함하는 전이금속 착체 및 PFP 고분자를 포함하는 산화-환원 고분자 1)를 200초 마다 포도당 농도를 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 mM를 증가시켰을 때 나타난 전류의 변화(위-좌측), 포도당 농도에 따른 전류의 변화(위-우측) 및 200초마다 포도당 농도를 0, 1, 5, 10, 50, 100 mM를 증가시켰을 때 나타난 전류의 변화(아래-좌측), 포도당 농도에 따른 전류의 변화(아래-우측)를 나타내는 그래프이다.
도 7a 내지 7d는 본 발명에 따른 산화-환원 고분자(37, 38 및 C-N 리간드를 포함하는 전이금속 착체 및 PFP 고분자를 포함하는 산화-환원 고분자 1 및 2)의 순환전압전류 시험 전후의 전류 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7a 내지 7d에서 CV는 전극 완성 직후 측정한 것을 나타내고, after CV는 PBS 용액 내에서 1시간 교반한 후 측정한 값을 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험재료
참고예 1. 시약 및 시료
Aldrich 사와 Acros 사, TCI 사, Alfa aesar 사에서 상업적으로 구매한 시약들은 별다른 정제 없이 사용하였고 에틸렌다이아민, 피리딘, 1-메틸이미다졸, 트리에틸아민의 경우에는 10 mL 피펫에 베이직 알루미나를 채운 뒤 걸러서 사용하였다. 대정과 삼전에서 구매한 다음과 같은 몇 가지 용매들은 정제하여 사용하였다. 무수 다이클로로메테인와 무수 N,N-다이메틸포름아마이드는 수소화칼슘을 넣고 증류하여 얻었고, 무수 아세토나이트릴은 P2O5를 이용해 증류하여 얻었다. 다이에틸 에터는 소듐과 벤조페논을 사용해 증류하였다. 분석용 얇은층크로마토그래피는 Merck silica gel 60 F254 glass plate를 사용했으며, 이중의 단파장(254 nm)/장파장(365 nm) UV 램프를 사용하여 형광을 관찰했다. 칼럼크로마토그래피에는 Aldrich basic aluminum oxide 또는 Alfa neutral aluminum oxide를 사용하였다. Screen printed carbon electrodes(SPCEs)는 Zensor사의 SE102제품을 사용하였다.
참고예 2. 장비
수소 핵자기 공명(1H NMR), 탄소 핵자기 공명(13C NMR) 및 불소 핵자기 공명(19F NMR) 스펙트럼은 Varian Inova 400 (400 MHz for 1H, and 100 MHz for 13C) spectrometer를 사용하여 얻었다. 모든 화학적 이동은 테트라메틸실레인(δ 0.00)이나 듀테로화 클로로포름(δ 7.26 for CDCl3 in 1H NMR, δ 77.2 for CDCl3 in 13C NMR), 듀테로화 디메틸설폭사이드(δ 2.50 for DMSO in 1H NMR, δ 39.52 for DMSO in 13C NMR), 듀테로화 아세토나이트릴(δ 1.94 for CD3CN in 1H NMR)를 기준하여 ppm 단위로 나타내었다. 불소 핵자기 공명(19F NMR)의 경우에는 듀테로화 메탄올에 트리플루오로톨루엔(CF3-Ar, δ -69.27 for CD3OD in 19F NMR)을 소량 첨가하여 이를 기준으로 ppm 단위로 나타내었다. Cyclic voltammograms(CV)의 측정은 CH Instruments 사의 CHI1040C의 모델을 통해 측정하였다. 잘 세척된 지름 3mm 탄소 유리전극을 작업전극으로 사용하고 Ag/AgCl 전극을 기준전극으로, Pt 전극을 상대전극으로 하여 10 ~ 50 mV/s의 주사속도로 측정하였다. 질량 스펙트럼은 서강대학교의 유기화학 연구센터에서 ThermoFisher Scientific 사의 LTQ XL 모델의 저분해능의 경우 ESI-Iontrap, 고분해능의 경우 ESI-orbitrap 질량 분석기를 통해 얻었다. 단결정 X-ray 회절분석은 한국화학연구원에 의뢰하여 Bruker SMART APEX II 모델을 사용하여 결정 구조를 파악할 수 있었다.
실시예 1. PFPA 고분자 매트릭스를 이용한 산화-환원 고분자 합성
이 실험의 목적은 펜타플루오로페닐아크릴레이트(PFPA) 기반의 고분자 매트릭스로부터 말단에 아민(-NH2)기를 포함하는 전자전달매개체와 반응을 통해 산화-환원 고분자를 합성하고자 했다. 먼저 AIBN을 사용하여 펜타플루오로페닐아크릴레이트(PFPA)와 다이메틸아크릴아마이드(DMA)를 5:5비율로 라디칼 중합을 통해 DMA : PFPA 고분자(P1)를 합성했다.
1-1. Poly(N,N-dimethyl acrylamide-co-pentafluorophenyl acrylate) (P1)의 합성
Figure pat00010
[DMA : PFPA 고분자의 합성]
유리 배양 튜브에 N,N-다이메틸 아크릴아마이드(150 mg, 1.51 mmol), 펜타플루오르페닐 아크릴레이트(360 mg, 1.51 mmol), 아조비스이소부티로나이트릴(AIBN, 7 mg, 0.043 mmol)을 넣고 아세토나이트릴(8 mL)을 넣어 혼합용액을 만든다. 이 후 아르곤 기체를 10분 동안 불어넣어 유리 배양 튜브 안을 아르곤 분위기로 만들어 준 뒤 80 oC에서 12시간 환류한다. 반응이 끝난 후, 회전증발 건조기를 이용하여 용매를 제거하고, CH2Cl2를 넣어 혼합용액을 만든다. n-헥산에 혼합용액을 천천히 떨어뜨려 침전을 얻는 것을 3번 반복하여 생성된 고분자를 정제한다. 침전물을 걸러주고 n-헥산으로 씻어서 얻은 고분자를 진공상태에서 6시간 이상 건조하여 하얀색 고체 형태의 생성물 P1을 얻었다. (482 mg, 95%) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.81 to 3.34 ppm (br, 7H, -CH- in the backbone of PPFPA and -N(CH3)2 from PDMA), 2.47 to 2.65 ppm (br, 1H, -CH- in the backbone of PDMA), 1.13 to 2.22 ppm (br, 4H, -CH2- in the backbone of PDMA and PPFPA), 19F NMR (400 MHz, CDCl3) δ -152.90 (br, ortho), -157.21 (br, para), -162.15 (br, meta)
합성한 고분자는 메탄올, 아세토나이트릴, 아세톤, 다이클로로메테인에서는 좋은 용해도를 나타냈지만, 물과 다이에틸 에터에서는 전혀 용해되지 않았다.
1-2. PFPA 고분자가 전자전달매개체와 GDH를 고정할 수 있는 고분자 매트릭스로써 기능할 수 있는지 여부의 확인
상기 실시예 1-1에서 합성한 고분자 P1과 말단에 아민기를 포함하는 오스뮴 착물 22 사이의 반응 진행 여부를 확인하기 위해 19F NMR을 통해서 관찰하였다.
Figure pat00011
22번 착물은 짝이온이 Cl-인 형태로 반응하여 착물과 고분자를 모두 용해시킬 수 있는 듀테로화 메탄올 용매 하에서 NMR 피크를 확인하였다. 또한 22번 착물의 아민기가 암모늄(-NH4 +)형태로 존재할 경우 PFP 에스터와 반응할 수 없기 때문에 착물의 당량만큼 트리에틸아민(TEA)를 첨가하였다. 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 처음에 19F NMR로 고분자 P1 만 확인한 결과 PFPA에 해당하는 넓은 형태의 피크 3개가 나타냈다. 그 다음 22번 착물을 첨가하자마자 뾰족한 형태의 펜타플루오르페놀(PFPOH) 피크 3개가 추가적으로 나타난 것을 관찰하였다. 이는 22번 착물 말단의 아민이 반응하고 생성되는 부산물인 PFPOH의 피크이다. 시간이 경과하면서 점차 PFPOH의 피크가 커지고 PFPA의 피크가 줄어드는 변화가 나타났고 약 36시간 후 모든 PFPA의 피크가 사라지고 PFPOH의 피크만 남았다. 이 결과를 통해 TPMA 기반의 오스뮴 착물을 포함하는 아민기와도 PFP 에스터가 반응할 수 있고, PFPA 고분자가 전자전달매개체와 GDH를 고정할 수 있는 고분자 매트릭스로써 기능할 수 있다고 판단했다.
1-3. 산화-환원 중합체의 합성(Redox polymer (36) 및 (37))
아민 작용기를 포함한 TPMA 기반의 오스뮴 착물 22와 33을 PFPA 고분자 36과 반응하여 산화-환원 고분자를 합성했다(도 2). 전체 고분자 사슬에서 오스뮴 착물을 25~30% 정도 포함할 수 있는 산화-환원 고분자를 얻기 위해 당량비를 계산하여 반응을 진행했다.
1) 산화-환원 중합체(36)의 합성
Figure pat00012
NMR 튜브에 시작 물질 22(6 mg, 0.009 mmol)을 듀테로화 메탄올(0.5 mL)에 녹인다. 녹인 용액을 듀테로화 메탄올(0.5 mL)에 녹아있는 시작 물질 P1(5 mg)에 넣어주고 이어서 트리에틸아민(1.24 μL, 0.009 mmol)을 넣어준다. 반응 진행 여부를 19F NMR을 통해 확인한 후, 반응 용액을 다이에틸 에터에 천천히 떨어뜨려 침전을 얻는 것을 3번 반복하여 생성된 고분자를 정제한다. 생성된 침전물을 걸러주고 다이에틸 에터로 씻어준 뒤 진공상태에서 4시간 이상 건조하여 갈색 고체형태의 생성물 36를 얻었다. (6 mg, 64%) 19F NMR (400 MHz, CD3OD) δ -153.38 (br, ortho), -159.74 (br, para), -163.53 (br, meta)
2) 산화-환원 중합체(37)의 합성
Figure pat00013
NMR 튜브에 시작 물질 33(6.5 mg, 0.009 mmol)을 듀테로화 메탄올 (0.5 mL)에 녹인다. 녹인 용액을 듀테로화 메탄올(0.5 mL)에 녹아있는 시작 물질 P1(5 mg)에 넣어주고 이어서 트리에틸아민(1.22 μL, 0.009 mmol)을 넣어준다. 반응 진행 여부를 19F NMR을 통해 확인한 후, 반응 용액을 다이에틸 에터에 천천히 떨어뜨려 침전을 얻는 것을 3번 반복하여 생성된 고분자를 정제한다. 생성된 침전물을 걸러주고 다이에틸 에터로 씻어준 뒤 진공상태에서 4시간 이상 건조하여 갈색 고체형태의 생성물 37를 얻었다. (7.2 mg, 73%) 19F NMR (400 MHz, CD3OD) δ -154.57 (br, ortho), -160.27 (br, para), -164.95 (br, meta)
첨가한 착물과 PFPA 고분자 사이의 반응은 19F NMR을 통해서 더 이상 피크의 변화가 없을 때까지 확인하고 산화-환원 고분자의 비율을 판단했다. 첨가한 오스뮴 착물이 모두 반응하는데 약 24 ~ 36 시간이 소요됐다. 19F NMR을 통해서 두 산화-환원 고분자의 비율을 확인한 결과, 산화-환원 고분자 37은 PFPA : PFPOH 비율이 2 : 3 으로 나타나 오스뮴 착물이 전체 사슬의 30%를 차지하고, 38은 PFPA : PFPOH 비율이 2.2 : 2.8으로 나타나 오스뮴 착물이 28% 정도가 고분자 매트릭스에 포함?榮鳴? 간접적으로 판단할 수 있었다. 두 고분자는 모두 다이에틸 에터에 침전을 잡아서 얻었고, 시작 물질 36 고분자와 다르게 산화-환원 고분자는 모두 물에 녹는 성질을 나타냈다. 또한 이하에서 확인한 바와 같이 CV를 측정했을 때, 오스뮴 착물 단량체와 유사한 산화-환원 전위를 나타냈다. 이러한 결과를 통해 성공적으로 TPMA 기반의 오스뮴 착물을 포함한 산화-환원 고분자를 합성했다고 판단했다.
1-4. C-N 리간드를 포함하는 전이금속 착체 및 PFP 고분자를 포함하는 산화-환원 중합체의 합성 1
Figure pat00014
NMR 튜브에 시작 물질로 C-N 리간드를 포함하는 오스뮴 착체인 [Os(2-(2-pyridinyl-κN)-5-methaneamine-phenyl-κC)(4,4’-dimethyl-2,2’-bipyridine)2]Cl2 (11 mg, 0.014 mmol) 을 듀테로화 메탄올 (0.5 mL)에 녹인다. 녹인 용액을 듀테로화 메탄올(0.5 mL)에 녹아있는 시작 물질 PFP polymer(7:3) (17 mg)에 넣어주고 이어서 트리에틸아민(3.8 μL, 0.028 mmol)을 넣어주었다. 반응 진행 여부를 19F NMR을 통해 확인한 후(도 3), 반응 용액을 다이에틸 에터에 천천히 떨어뜨려 침전을 얻는 것을 3번 반복하여 생성된 고분자를 정제하였다. 생성된 침전물을 걸러주고 다이에틸 에터로 씻어준 뒤 진공상태에서 4시간 이상 건조하여 갈색 고체형태의 생성물을 얻었다.
1-5. C-N 리간드를 포함하는 전이금속 착체를 포함하는 산화-환원 중합체의 합성 2
Figure pat00015
NMR 튜브에 시작 물질 [Os(2-(2-pyridinyl-κN)-5-methaneamine-phenyl-κC)(4,4’-dimethoxy-2,2’-bipyridine)2]Cl2 (9.7 mg, 0.012 mmol)을 듀테로화 메탄올 (0.5 mL)에 녹인다. 녹인 용액을 듀테로화 메탄올(0.5 mL)에 녹아있는 시작 물질 PFP polymer(7:3) (15 mg)에 넣어주고 이어서 트리에틸아민(3.1 μL, 0.024 mmol)을 넣어준다. 반응 진행 여부를 19F NMR을 통해 확인한 후(도 4), 반응 용액을 다이에틸 에터에 천천히 떨어뜨려 침전을 얻는 것을 3번 반복하여 생성된 고분자를 정제한다. 생성된 침전물을 걸러주고 다이에틸 에터로 씻어준 뒤 진공상태에서 4시간 이상 건조하여 갈색 고체형태의 생성물을 얻었다.
실시예 2. 산화-환원 고분자와 효소의 고정 및 포도당에 대한 감응 시험
오스뮴 착물을 포함하는 산화-환원 고분자와 당 탈 수소효소(GDH)를 섞은 용액을 SPCEs 전극 위에 고정시키고 포도당 농도에 따른 감응을 확인하고자 다음의 시험을 수행하였다.
2-1. 산화-환원 고분자와 당 탈 수소효소가 고정된 전극 제조
산화-환원 고분자 0.4 mg을 증류수 50 μL에 녹인 용액과 당 탈 수소효소(GDH) 0.8 mg을 증류수 50 μL에 녹인 용액을 섞어준 혼합용액을 제조하였다(v/v 1:1). 이 혼합용액을 SPCEs 위에 상기 혼합용액을 산화-환원 고분자 37 및 38의 경우 0.83 μL, 그리고 C-N 리간드를 포함하는 전이금속착체를 포함하는 산화-환원 고분자 1 및 2의 경우 1 μL 를 고르게 올려주고 상온에서 천천히 건조시켰다. 건조가 끝나면 혼합용액을 산화-환원 고분자 37 및 38의 경우 0.83 μL, 그리고 C-N 리간드를 포함하는 전이금속착체를 포함하는 산화-환원 고분자 1 및 2의 경우 1 μL 를 다시 올려주고 이 과정을 2번 더 반복하였다. 총 2.5 μL(고분자 37 및 38) 및 3 μL (C-N 리간드를 포함하는 전이금속착체를 포함하는 산화-환원 고분자 1 및 2)의 혼합용액이 올려진 전극을 12시간 이상 상온에서 건조하여 전극을 제조하였다. 매개체와 효소의 조성과 SPCEs 전극 표면 위 가교 방법을 개략적으로 도 5에 나타내었다.
2-2. 포도당 농도에 따른 전류 측정
상기 실시예 2-1에서 제조된, 산화-환원 고분자와 당 탈 수소효소가 고정된 전극을 10 mM PBS 용액 50 mL에 교반 막대를 넣고 150 rpm으로 교반하며 i-t curve를 측정했다. 200초마다 포도당을 10 mM PBS에 녹인 용액을 일정량 첨가하여 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 100 mM 농도하에서 전류를 측정하여 전류의 변화를 확인하였다. 그 결과를 도 6a에 나타내었다.
시험 결과, 각각 37 및 38번 산화-환원 고분자를 효소와 가교시킨 전극은 포도당 농도가 점차 증가함에 따라 전류도 크기가 점점 증가했다. 우선 전류-시간 그래프에서는 두 전극 모두 100 mM 농도까지 계단식으로 점차 증가하는 모습을 보였고, 저농도 구간(0 ~ 1 mM)에서도 그 변화가 뚜렷하게 나타났다. 또한 농도에 따라 발생한 전류를 평균 내어 전류-농도 그래프를 도시하였을 때, 포도당 농도별로 발생하는 전류의 크기에 대한 상관관계를 확인하였다. 저농도 구간에서는 일정 전류의 양이 직선적으로 증가한 반면 농도가 점차 증가하면서 16 mM 이상의 고농도 구간에서는 전류 증가량이 점차 감소하여 전류값이 일정하게 나타나는 것을 보였다. 이는 전극에서 당이 산화될 수 있는 최대값에 도달하여 전류의 증가량이 점차 감소하고 한계촉매전류(imax)에 도달했음을 알 수 있다. 또한 37 번 산화-환원 고분자가 가교된 전극은 1.5 μA 정도의 최대 전류를 나타낸 반면, 38 번 산화-환원 고분자가 가교된 전극은 최대 전류가 0.5 μA 정도로 37 기반의 전극보다 1/3 수준으로 낮게 나타났다.
상기 실시예 2-1에서 제조된, 산화-환원 고분자와 당 탈 수소효소가 고정된 전극을 10 mM PBS 용액 50 mL에 교반 막대를 넣고 150 rpm으로 교반하며 i-t curve를 측정했다. C-N 리간드를 포함하는 전이금속착체를 포함하는 산화-환원 고분자 1 및 2를 효소와 가교시킨 전극은 200초마다 포도당을 10 mM PBS에 녹인 용액을 일정량 첨가하여 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 mM로 증가하는 저농도 구간하에서 그리고 1, 5, 10, 50, 100 mM로 증가하는 고농도 구간하에서 각각 전류를 측정하여 전류의 변화를 확인하였다. 그 결과를 도 6b내지 6c에 나타내었다.
시험 결과, 두 전극 모두 저농도 구간(0 ~ 0.5 mM)과 고농도 구간(0 ~ 100 mM)에서 모두 계단식으로 전류의 크기가 점차 증가했다. 저농도 구간에서는 일정 전류의 양이 직선적으로 증가한 반면 고농도 구간에서는 농도가 점차 증가하면서 50 mM 이상의 농도부터는 전류값이 일정하게 나타나는 것을 보였다. 이는 전극에서 당이 산화될 수 있는 최대값에 도달한 것으로 C-N 리간드를 포함하는 전이금속착체를 포함하는 산화-환원 고분자 1이 가교된 전극은 약 1.0 μA 정도의 최대 전류를 나타냈고, C-N 리간드를 포함하는 전이금속착체를 포함하는 산화-환원 고분자 2가 가교된 전극은 최대 전류가 약 0.2 μA 정도로 나타났다.
나아가, 순환전압전류 시험 전후의 전류 변화를 측정하였다. 구체적으로 전류 변화를 위해 10 mM PBS에서 -0.5 내지 +0.1 V 에서, C-N 리간드를 포함하는 전자전달매개체 및 PFPA를 포함하는 산화-환원 고분자 1 및 2의 경우 -0.3 내지 +0.4 V 에서 측정하였으며, 그 결과를 도 7a 내지 7d에 나타내었다. 도 7a 내지 7d에서 CV는 전극 완성 직후 측정한 것을 나타내고, after CV는 PBS 용액 내에서 1시간 교반한 후 측정한 값을 나타낸다.
이상과 같이, PFPA를 포함하는 산화-환원 고분자가 효소와 전극 표면에 잘 고정되어 저농도 구간에서도 뚜렷한 감응을 나타냈고, 일정 농도까지도 직선적인 전류 변화를 확인할 수 있었다. 또한 가교 전극들이 100 mM 농도에서 각각 1.5 μA, 0.5 μA, 1.0 μA, 0.2 μA의 한계촉매전류를 나타냈다. 이를 통해 TPMA-오스뮴 착물 기반 전자전달매개체 또는 C-N 리간드-오스뮴 착물 기반 전자전달매개체와 PFPA 고분자 매트릭스를 이용한 고정 방식이 혈당 센서로써 기능할 수 있다는 것을 증명하였다.

Claims (19)

  1. 폴리펜타플루오로페닐 에스터 기반의 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펜타플루오로페닐 에스터에 1차 및 2차 아민계 화합물을 사용하여 가아미노 분해(aminolysis)를 통해 도입하는 것을 특징으로 하는, 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중합체는 폴리펜타플루오로페닐 아크릴레이트(PPFPA) 호모중합체, 폴리펜타플루오로페닐 메타크릴레이트(PPFPM) 호모중합체, 폴리펜타플루오로페닐 아크릴레이트-폴리다이메틸아크릴아마이드(PPFPA-PDMA) 공중합체, 폴리펜타플루오로페닐 메타크릴레이트-폴리다이메틸아크릴아마이드(PPFPM-PDMA) 공중합체, 폴리펜타플루오로페닐 아크릴레이트-폴리아크릴아마이드(PPFPA-PAA) 공중합체, 폴리펜타플루오로페닐 메타크릴레이트-폴리아크릴아마이드(PPFPM-PAA) 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 중합체를 포함하는 것인 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체.
  4. 제1항에 있어서, 하기 화학식 1 또는 2의 구조를 갖는 것인, 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체:
    [화학식 1]
    Figure pat00016

    [화학식 2]
    Figure pat00017

    상기 화학식 1 또는 2에서,
    RT 및 RL 은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 사이클로알킬렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 30의 에틸렌 글라이콜기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 30의 헤테로아릴렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알케닐기 및 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알키닐기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 n는 10 내지 300의 정수이다.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 RT 및 RL 은 각각 독립적으로 분자량 1,000 g/mol ~ 50,000 g/mol의 폴리다이메틸아크릴아마이드(PDMA), 폴리아크릴아마이드(PAA), 폴리스티렌(PS), 폴리에틸렌글라이콜 (PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리비닐이미다졸(PVI), 폴리비닐피리딘(PVP) 및 폴리실록산(PDMS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체.
  6. 제1항에 있어서, 1,000 g/mol 내지 500,000 g/mol 범위의 중량 평균 분자량을 갖는, 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 중합체를 포함하는 전기화학적 센서용 산화-환원 고분자 재료.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중합체에 1차 및 2차 아민기 및 암모늄기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능기 및 전이금속착체가 결합된 것을 특징으로 하는, 산화-환원 고분자 재료.
  9. 제8항에 있어서, 상기 전이금속착체는 하기 화학식 3 또는 4의 구조를 갖는 것인, 산화-환원 고분자 재료:
    [화학식 3]
    Figure pat00018

    [화학식 4]
    Figure pat00019

    상기 화학식 3 또는 4에서,
    M 은 Os, Rh, Ru, Ir, Fe 및 Co 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 전이금속이고;
    상기 화학식 3에서, LG1 및 LG2는 서로 합쳐져 하기 화학식 5 내지 6으로부터 선택되는 바이덴테이트 리간드를 형성하고;
    LG3 및 LG4는 서로 합쳐져 하기 화학식 5 내지 6으로부터 선택되는 바이덴테이트 리간드를 형성하고; LG5 및 LG6는 각각 서로 합쳐져 하기 화학식 5 내지 6으로부터 선택되는 바이덴테이트 리간드를 형성하고;
    [화학식 5]
    Figure pat00020

    [화학식 6]
    Figure pat00021

    상기 화학식 5에서 LC는 질소원자를 하나이상 포함한 헤테로 고리 화합물이며, 2번 위치에서 벤젠의 화학식과 연결되고;
    상기 화학식 6에서 LN은 질소원자를 하나이상 포함한 헤테로 고리 화합물이며, LN1과 LN2는 각각 2번 위치에서 서로 연결되어 있고;
    RL은 헤테로 고리 화합물 LC, LN1 및 LN2 의 모든 작용기이며;
    상기 R1, R2, R3, R4, R5 및 RL 은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 20의 에틸렌 글라이콜기 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알코올기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬할로젠기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 싸이올기, 치환 또는 비치환된 탄소 수 3 내지 20의 알킬아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 7 내지 30의 아릴아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알키닐기, 시아노기, 할로겐기, 중수소 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고;
    상기 화학식 4의 LH1, LH3 및 LH4은 LH2을 중심으로 서로 합쳐져 하기 화학식 7로 나타내어지는 테트라덴테이트 리간드를 형성하고;
    이때, LH5 및 LH6는 각각 화학식 8에 나타내어지는 바와 같이 전이금속 M에 대한 모노덴테이트 리간드를 형성하거나; LH5 및 LH6는 각각 서로 합쳐져 하기 화학식 9에 나타내어지는 바와 같이 전이금속 M에 대한 바이덴테이트 리간드를 형성하고;
    [화학식 7]
    Figure pat00022

    상기 화학식 7에서,
    Ca, Cb 및 Cc는 각각 독립적으로 질소원자를 하나 이상 포함한 헤테로 고리 화합물이고, 상기 헤테로 고리 화합물은 2번 위치에서 메틸아민과 연결되고, 상기 3개의 헤테로 고리가 갖는 3개의 질소와, 상기 3개의 헤테로 고리를 서로 연결하는 중심의 1개의 질소가 전이금속 M과 연결되고, R1, R2, R3은 헤테로 고리 화합물 Ca, Cb, Cc의 모든 작용기로서, 상기 R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 20의 에틸렌 글라이콜기 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알코올기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬할로젠기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 싸이올기, 치환 또는 비치환된 탄소 수 3 내지 20의 알킬아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 7 내지 30의 아릴아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알키닐기, 시아노기, 할로겐기, 중수소 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되고;

    [화학식 8]
    Figure pat00023


    [화학식9]
    Figure pat00024


    상기 화학식 8에서,
    LH5 및 LH6는 각각 모노덴테이트 리간드이며, 각각 독립적으로 -H, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NCCH3, -CO, -OH2, -NH3 또는 질소원자를 하나이상 포함한 헤테로 고리 화합물이고;
    상기 화학식 9에서,
    LH5-LH6는 바이덴테이트 리간드이며, 카테콜, 아세틸아세톤, 2-피콜리닉애시드, 2-피리딘카복사마이드, 2,2’-바이피리딘 또는 2,2’-바이싸이아졸이고;
    상기 L1는 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20 의 사이클로알킬렌기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 30의 에틸렌 글라이콜기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기, 및 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 30의 헤테로아릴렌기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 Ａa는 아민기 및 암모늄기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  10. 제7항에 따른 산화-환원 중합체 재료를 전극에 코팅한 후, 코팅된 전극을 경화시키는 단계를 포함하는, 산화-환원 고분자 재료 박막의 제조방법.
  11. 제10항에 따른 제조방법에 의해 제조된 산화-환원 고분자 재료 박막.
  12. 제10항에 따른 제조방법에 의해 제조된 산화-환원 고분자 재료 박막을 포함하는 전기화학적 바이오센서.
  13. 액체성 생체시료를 산화환원시킬 수 있는 효소; 및
    제7항에 따른 전자전달매개체를 포함하는 전기화학적 바이오센서용 센싱 막.
  14. 제13항에 있어서, 상기 효소는
    탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는
    탈수소효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함하는 것인, 전기화학적 바이오센서용 센싱 막.
  15. 제14항에 따른 전기화학적 바이오센서용 센싱 막을 포함하는 전기화학적 바이오센서.
  16. 제15항에 있어서, 상기 센서는 연속적인 혈당 모니터링 센서인 것인, 전기화학적 바이오센서.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 산화-환원 고분자 재료 제조용 중합체를 포함하는 장치.
  18. 제17항에 있어서, 상기 장치는 전기화학적 바이오센서인 것인, 장치.
  19. 제18항에 있어서, 상기 장치는 삽입가능한 것인 장치.
KR1020200189140A 2020-12-31 2020-12-31 펜타플루오로페닐 에스터를 포함하는 고분자 및 이를 포함하는 전기화학적 바이오센서 KR20220096570A (ko)

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