CN108414600A - 一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法 - Google Patents

一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，其特征在于，首先采用纳米VN，氧化石墨烯，N‑乙基‑3‑甲基吡啶六氟磷酸盐制备得到纳米VN/石墨烯复合糊电极；然后，采用γ‑缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN/石墨烯复合糊电极，制得γ‑缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN/石墨烯复合糊电极；由去离子水、牛血清蛋白、透明质酸酶和聚乙烯醇配制透明质酸酶固定液；最后，将透明质酸酶固定液滴涂到γ‑缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN/石墨烯复合糊电极上，干燥，制得透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器。该电极传感器具有比普通的碳糊电极导电性能高，对透明质酸具有专一识别性，灵敏度高。

Description

一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种电化学传感器的制备方法，特别涉及一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法及应用。属于电化学分析领域。
背景技术
透明质酸是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子（Natural moisturizing factor，NMF），例如：2%的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98%水分。透明质酸是一种多功能基质，透明质酸（玻尿酸）HA广泛分布于人体各部位。其中皮肤也含有大量的透明质酸。人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。具有较高临床价值的生化药物,广泛应用于各类眼科手术,如晶体植入、角膜移植和抗青光眼手术等。还可用于治疗关节炎和加速伤口愈合。将其用于化妆品中,能起到独特的保护皮肤作用,可保持皮肤滋润光滑,细腻柔嫩,富有弹性,具有防皱、抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。因此，准确检测药物、生物样品、化妆品中的透明质酸备受关注。
酶电极分析方法是将酶蛋白分子采用传统的吸附法、包埋法、共价键合法、交联法作用固定化制成固定化酶膜，再与电化学基础电极相结合，构成酶电极生物传感器用于特异底物分析的一项生物技术。由于酶的高度专一性，该方法具有专一性高、稳定性好、检测速度快、选择性好、灵敏度高等特点。酶电极研究起步于20世纪60年代，自2000年以来，生物传感器技术在环境检测、食品安全、军事和医学等方面的应用日益广泛，在申请号为201410210210.3的专利中公开了检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用；在授权公告号为CN102435650 B的专利中公开了一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法；在授权公告号为CN102495115 B的专利中公开了利用生物酶电极法检测根系分泌物中苹果酸的电化学方法。
氮化钒（VN）是一种面心立方晶体结构的多功能金属氮化物，其具有高的导电性(电导率约为106/(Ω•m)和高的电化学活性六方晶体结构。是一类具有高催化活性的类贵金属催化剂和高容量电化学储能电极材料。石墨烯作为一类新型的超级电容器电极材料，石墨烯表现出以下众多的优势：超高的比表面积、良好的导电性能、优异的稳定的化学性能以及宽的电势窗口。单层石墨烯的容量可达21μF/cm2 ，但是很多情况下石墨烯都是多层叠加在一起，层与层之间的面积没有得到有效利用，其实际容量比单层石墨烯容量低，将石墨烯与其他纳米结构复合也抑制石墨烯片层的重叠。将高容量的过渡金属氮化物或导电聚合物与石墨烯进行叠层复合，一方面石墨烯被其他物质隔离开，能够减少团聚，增加电解液的流动性，另一方面，石墨烯为复合后的赝电容物质提供了电子传导的三维网络。基于石墨烯的复合材料表现出协同效应，在获得高容量的同时保持有良好的倍率性能。
发明内容
本发明的目的是采用N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐作为胶粘剂制备一种纳米VN/石墨烯复合糊电极，再采用透明质酸酶修饰电极，提供一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，并应用检测透明质酸中。
仪器与试剂
CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），纳米VN /石墨烯复合糊电极（GCE）为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。
纳米VN，氧化石墨烯，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐，无水乙醇，氢氧化钠，液体石蜡，石油醚、磷酸盐缓冲溶液，透明质酸，简称SOD，ECl.15.1.1，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，按如下质量百分比加入，纳米VN：46~50%，氧化石墨烯：15~18%，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：10~14%，液体石蜡：10~14%，石油醚：10~14%，各组分质量百分比之和为百分之百，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，无水乙醇：68~72%，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：28~32%，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应2h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（3）透明质酸酶固定液的制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，去离子水：96~98%，牛血清蛋白：0.6~1.6%，透明质酸酶：0.6~1.6%，聚乙烯醇：0.5~1.5%，各组分质量百分浓度之和为百分之百，搅拌溶解，该溶液为透明质酸酶固定液；
（4）透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的透明质酸酶固定液18~22μL滴涂到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极，干燥，即得透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器。
步骤（1）所述的液体石蜡与为环保级液体石蜡。
步骤（1）所述的石油醚为石油醚60-90℃。
步骤（3）所述的牛血清蛋白与透明质酸酶的质量比为1：1。
透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器测定透明质酸步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的透明质酸标准溶液，底液为pH6.8的磷酸盐缓冲溶液；
（2）将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的透明质酸酶修饰氮化钒糊电极为工作电极组成三电极系统， 连接CHI660B电化学工作站，底液为pH6.8的磷酸盐缓冲溶液，在-1.2~0.6V的电位范围，以50mV/s循环扫描18min，取出洗涤。然后采用计时电流法扫描该溶液，工作电压为-0.75V，取不同浓度下透明质酸的峰电流值与透明质酸浓度做工作曲线；
（3）透明质酸的检测：用待测样品处理成待测液代替步骤（1）中的透明质酸标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中透明质酸的含量；
本发明的优点及效果是：
（1）本发明制备透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器，在糊电极中加入氮化钒，以N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐作为胶粘剂，将氮化钒与氧化石墨烯混合制备的糊电极比普通的碳糊电极导电性能提高2~4倍，再采用透明质酸酶修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极制备的，电化学窗口宽、对透明质酸具有专一的选择性，制备方法简单、成本低、表面易更新、残余电流小等优点；
（2）本发明制备透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器对透明质酸表现出很高选择性和灵敏性，响应电流与透明质酸的浓度2.0×10-7~4.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，相关系数R=0.9978，检测限为9.45×10-8mol/ L，回收率在95.84~103.62%之间；
（3）本发明制备透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器在制备的过程中不使用有毒的试剂，环保绿色；
（4）将本发明制备透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器成功用于药品、生物、化妆品等样品中透明质酸的检测中，解决了透明质酸检测困难。
具体实施方式
实施例1
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米VN：48g，氧化石墨烯：16g，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：12g，液体石蜡：12g，石油醚：18 mL，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/ N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：89 mL，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：30g，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应2h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（3）透明质酸酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：97 mL，牛血清蛋白：1.0g，透明质酸酶：1.0g，聚乙烯醇：1.0g，搅拌溶解，该溶液为透明质酸酶固定液；
（4）透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的透明质酸酶固定液20μL滴涂到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极，干燥，即得透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器。
实施例2
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米VN：50g，氧化石墨烯：15g，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：110g，液体石蜡：11g，石油醚：20mL，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/ N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：86mL，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：32g，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应2h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（3）透明质酸酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：96 mL，牛血清蛋白：1.25g，透明质酸酶：1.25g，聚乙烯醇：1.5g，搅拌溶解，该溶液为透明质酸酶固定液；
（4）透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的透明质酸酶固定液18μL滴涂到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极，干燥，即得透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器。
实施例3
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米VN：46g，氧化石墨烯：18g，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：14g，液体石蜡：10g，石油醚：15 mL，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/ N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：91mL，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：28g，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应2h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（3）透明质酸酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：98 mL，牛血清蛋白：0.6g，透明质酸酶：0.6g，聚乙烯醇：0.8g，搅拌溶解，该溶液为透明质酸酶固定液；
（4）透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的透明质酸酶固定液22μL滴涂到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极，干燥，即得透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器。
实施例4
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米VN：47g，氧化石墨烯：17g，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：11g，液体石蜡：14g，石油醚：16 mL，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/ N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：90 mL，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：29g，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应2h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（3）透明质酸酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：96.3 mL，牛血清蛋白：1.6g，透明质酸酶：1.6g，聚乙烯醇：0.5g，搅拌溶解，该溶液为透明质酸酶固定液；
（4）透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的透明质酸酶固定液19μL滴涂到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极，干燥，即得透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器。
本发明制备的透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器成功用于药品、化妆品、生物等样品中透明质酸的检测中，回收率在95.84~103.62%之间，因此本发明制备的透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器可广泛应用于生物医药、化妆品、生物、环保检测等相关领域，解决了透明质酸检测的困难。

Claims (5)

1.一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，按如下质量百分比加入，纳米VN：46~50%，氧化石墨烯：15~18%，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：10~14%，液体石蜡：10~14%，石油醚：10~14%，各组分质量百分比之和为百分之百，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，无水乙醇：68~72%，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷：28~32%，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应2h，温度升到55±2℃恒温反应4h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（3）透明质酸酶固定液的制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，去离子水：96~98%，牛血清蛋白：0.6~1.6%，透明质酸酶：0.6~1.6%，聚乙烯醇：0.5~1.5%，各组分质量百分浓度之和为百分之百，搅拌溶解，该溶液为透明质酸酶固定液；
（4）透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的透明质酸酶固定液18~22μL滴涂到步骤（2）制备的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极，干燥，即得透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的液体石蜡与为环保级液体石蜡。
3.根据权利要求1所述的一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的石油醚为石油醚60-90℃。
4.根据权利要求1所述的一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的牛血清蛋白与透明质酸酶的质量比为1：1。
5.根据权利要求1所述的一种透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法所制备的透明质酸酶修饰氮化钒糊电极传感器。
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