CN104237337A - 一种生物传感器敏感膜及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物传感器敏感膜及其制备方法与用途。所述生物传感器敏感膜由一种新型的梭状CFe₃O₄纳米颗粒及高导电性的[EMIM]EtOSO₃制备得到。本发明还保护了所述生物传感器敏感膜的制备方法。本发明可用于三氯乙酸(TCA)等环污染物的测定。检测范围宽，灵敏度高，并且具有感应膜制备工艺简单、成本低的优点。

Description

一种生物传感器敏感膜及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及生物传感器领域，尤其涉及一种生物传感器敏感膜及其制备方法与用途。

背景技术

电化学生物传感器的近几十年来发展起来的一种新的传感器分析技术。电化学传感器具有选择性高、检测范围宽、灵敏度高、仪器设备简单、操作方便等优点，已在临床诊断、工业控制、食品和药物分析、生物药物开发、环境分析和军事等诸多领域得到广泛应用。

随着人们环保意识的加强，将电化学生物传感器应用于环境污染物质的测定已成为电化学生物传感器研究的重要发展方向之一。如Lei等利用离子液体[BMIM][PF₆]制备了卟啉/SWCNT/IL复合膜修饰的玻碳电极，研究了卟啉的直接电化学性质及其对TCA的电催化还原性能。

纳米材料具有比表面积大、表面活性中心多、吸附能力强及多种独特的物理化学性质，将纳米材料引入电化学生物传感器敏感膜中，可以避免使用电子媒介体，且可以提高传感器的响应敏感度、增强稳定性及抗干扰能力等性能指标。因此将纳米材料运用于生物传感器成为最近热门的话题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测范围宽，灵敏度高，用于三氯乙酸(TCA)等环污染物测定的电化学生物传感器敏感膜。

为实现上述目的，本发明提供一种电化学生物传感器敏感膜，其特征在于：由一种新型的梭状CFe₃O₄纳米颗粒及高导电性的[EMIM]EtOSO₃制备得到。

所述电化学生物传感器敏感膜，其特征在于，由以下制备方法制备得到，

A梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备：

A-1Fe₂O₃纳米颗粒的制备：称量FeCl₃·6H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液；再将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，于烘箱中反应一段时间，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温；倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，将洗涤多次的浑浊液烘箱中烘干至样品完全干燥得到Fe₂O₃纳米颗粒；

A-2CFe₃O₄纳米颗粒的制备：称量上述所得Fe₂O₃粉末并超声分散在去离子水中，随后将葡萄糖溶液和无水乙醇加入到上述悬浮液里，超声处理；再将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，于烘箱中反应，结束后取出高压釜使之自然冷却至室温；去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，烘箱中烘干后，再将前驱体在氮气保护下退火，最终可得到梭状CFe₃O₄纳米颗粒；

B CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备：

将石墨粉，[BMIM]BF₄和液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨使其完全碾碎成糊状液体并混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管中，并在玻璃管的尾端插入一根铜导线，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极CILE；使用电极前将CILE在称量纸上打磨，使其表面光滑；

Mb修饰的CILE电极制备：取上述所得的CFe₃O₄纳米颗粒配制成10uL 2.0mg/mL的悬浮水液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的10.0mg/mL Mb水溶液，室温自然晾干后，再向上述所得的离子液体修饰碳糊电极CILE表面分别滴涂5.0μL[EMIM]EtOSO₃和8.0uL CTS的水溶液，在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极。

所述梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备为，

A-1称量1.6mmol的FeCl₃·6H₂O和0.2mmol的NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入80mL去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液。将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，于100℃的烘箱中反应48h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤，转速：5000SPEED/RCF，下层的混浊液多次，将洗涤多次的浑浊液于60℃的烘箱中烘干8小时至样品完全干燥得到Fe₂O₃纳米颗粒；

A-2CFe₃O₄纳米颗粒的制备：称量150mg上述已制备好的Fe₂O₃粉末并超声，工作频率：40KHz，分散在5mL的去离子水中，随后将15mL浓度为0.3Mol/L的葡萄糖溶液和10mL的无水乙醇加入到上述悬浮液里，进行超声，频率为40KHz处理半小时；将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，于180℃的烘箱中反应12h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，60℃的烘箱中烘干后，再将前驱体在氮气保护下600℃退火4h，其升温速度5℃/min，气流量45sccm，最终可得到梭状的CFe₃O₄纳米颗粒。

所述CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备为，

将3.2g石墨粉，100μL[BMIM]BF₄和900μL液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨1小时使其完全碾碎成糊状液体，使其混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管中，并在玻璃管的尾端插入一根直径1mm，长度3-6cm的铜导线，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极CILE；

Mb修饰的CILE电极制备：取上述所得的CFe₃O₄纳米颗粒配制成10uL 2.0mg/mL的悬浮水液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的10.0mg/mL Mb水溶液，室温自然晾干后，再向上述所得的离子液体修饰碳糊电极CILE表面分别滴涂5.0 μL[EMIM]EtOSO₃和8.0μL CTS的水溶液，所述[EMIM]EtOSO₃浓度为6.0重量体积％，溶剂为PBS溶液，pH值为7.0，所述CTS为1.0体积％，溶剂为HAc；在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极。

步骤为，

A梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备：

A-1Fe₂O₃纳米颗粒的制备：称量FeCl₃·6H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液；再将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，于烘箱中反应一段时间，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温；倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，将洗涤多次的浑浊液烘箱中烘干至样品完全干燥得到Fe₂O₃纳米颗粒；

A-2CFe₃O₄纳米颗粒的制备：称量上述所得Fe₂O₃粉末并超声分散在去离子水中，随后将葡萄糖溶液和无水乙醇加入到上述悬浮液里，超声处理；再将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，于烘箱中反应，结束后取出高压釜使之自然冷却至室温；去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，烘箱中烘干后，再将前驱体在氮气保护下退火，最终可得到梭状的CFe₃O₄纳米颗粒；

B CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备：

将石墨粉，[BMIM]BF₄和液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨使其完全碾碎成糊状液体并混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管中，并在玻璃管的尾端插入一根铜导线，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极CILE；使用电极前将CILE在称量纸上打磨，使其表面光滑；

Mb修饰的CILE电极制备：取上述所得的CFe₃O₄颗粒配制成10uL 2.0mg/mL的悬浮水液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的Mb水溶液(10.0mg/mL)，室温自然晾干后，再向上述所得的离子液体修饰碳糊电极CILE表面分别滴涂5.0μL[EMIM]EtOSO₃和CTS的水溶液，在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极，所述[EMIM]EtOSO₃浓度为6.0重量体积％，溶剂为PBS溶液，pH值为7.0，所述CTS为1.0体积％，溶剂为HAc。

所述梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备为，

A-1称量1.6mmol的FeCl₃·6H₂O和0.2mmol的NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入80mL去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液。将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，于100℃的烘箱中反应48h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤，转速：5000SPEED/RCF，下层的混浊液多次，将洗涤多次的浑浊液于60℃的烘箱中烘干8小时至样品完全干燥得到Fe₂O₃纳米颗粒；

A-2CFe₃O₄纳米颗粒的制备：称量150mg上述已制备好的Fe₂O₃粉末并超声，工作频率：40KHz，分散在5mL的去离子水中，随后将15mL浓度为0.3Mol/L的葡萄糖溶液和10mL的无水乙醇加入到上述悬浮液里，进行超声，频率为40KHz处理半小时；将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，于180℃的烘箱中反应12h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，60℃的烘箱中烘干后，再将前驱体在氮气保护下600℃退火4h，其升温速度5℃/min，气流量45sccm，最终可得到梭状的CFe₃O₄纳米颗粒。

所述CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备为，

将3.2g石墨粉，100μL[BMIM]BF₄和900μL液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨1小时使其完全碾碎成糊状液体，使其混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管中，并在玻璃管的尾端插入一根直径1mm，长度3-6cm的铜导线，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极CILE；

Mb修饰的CILE电极制备：取10μL 2.0mg/mL上述制备的CFe₃O₄悬浮液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的10.0mg/mL Mb水溶液，室温自然晾干后，再向上述所得的离子液体修饰碳糊电极CILE表面分别滴涂5.0μL[EMIM]EtOSO₃和8.0μL CTS的水溶液，所述[EMIM]EtOSO₃为6.0体积％PBS溶液，pH值为7.0，所述CTS为1.0体积％HAc溶液；在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极。

所述电化学生物传感器敏感膜或所述制备方法制备得到的电化学生物传感器敏感膜的用途。具体为为用于三氯乙酸的测定的用途。

本发明将一种新型的梭状CFe₃O₄纳米颗粒及高导电性的[EMIM]EtOSO₃引入到生物传感器感应膜中，应用于TCA等环境污染物的测定。

本发明CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备方法是：

A梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备

A-1称量1.6mmol的FeCl₃·6H₂O和0.2mmol的NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入80mL去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液。将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，于100℃的烘箱中反应48h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，60℃的烘箱中烘干得到Fe₂O₃纳米颗粒。

A-2然后再利用水热法包碳制备CFe₃O₄纳米颗粒：称量150mg上述已制备好的Fe₂O₃粉末并超声分散在5mL的去离子水中，随后将15mL浓度为0.3Mol/L的葡糖糖溶液和10mL的无水乙醇加入到上述悬浮液里，超声处理半小时。将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，于180℃的烘箱中反应12h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，60℃的烘箱中烘干后，再将前躯体在氮气保护下600℃退火4h，最终可得到梭状的CFe₃O₄纳米颗粒。

B CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备

将3.2g石墨粉，100μL[BMIM]BF₄和900μL液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨1小时，使其混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管中，并在玻璃管的尾端插入一根铜导线，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极(CILE)。值得注意的是，每次使用前必须将CILE在称量纸上打磨，使其表面光滑。

Mb(牛肌红蛋白)修饰的CILE电极制备：取10μL 2.0mg/mL的CFe₃O₄悬浮液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的Mb溶液(10.0mg/mL)，室温自然晾干后，再向上述电极表面分别滴涂5.0μL[EMIM]EtOSO₃(6.0％PBS pH为7.0)和8.0μL CTS(1.0％HAc)，在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极。

采用JSM-6700F型扫描电子显微镜对水热反应制备的CFe₃O₄纳米颗粒进行表征，结果如图1所示，形状为梭形，其平均长度为450nm，直径约100nm。本发明的效果可以从用本发明提供的敏感膜修饰的电极性能看出。用本发明方法在碳糊电极(CILE)电极上制备的敏感膜电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，将三电极体系置于5.0mol/L[Fe(CN)₆]^3-/^4-和0.1mol/L KCl混合溶液中扫描范围为0.1-105Hz的电化学交流阻抗谱(EIS)来研究不同的修饰电极性能。如图2所示在CILE(曲线a)上电子传递电阻(Ret)为40.5Ω。然而在CTS/IL/Mb/CILE电极上，其阻抗值减小到24.1Ω(曲线b)，这是由于复合膜中存在有高导电率的IL。在CTS/IL/Mb/CFe₃O₄/CILE(曲线d)上Ret值进一步降低，半圆形基本消失，而且其Ret值小于CTS/IL/Mb/Fe₂O₃/CILE电极的Ret值(曲线c)，说明由于具有良好导电性的CFe₃O₄纳米颗粒的引入导致修饰电极具有更高的电化学活性。较高的电化学活性应该主要归因于碳良好的导电性和大的比表面积。EIS结果表明不同的电极固定方式使得修饰电极界面的电子传递电阻不同，并且Mb也被成功地固定在电极表面。将电极置于0.1mol/L的pH 7.0PBS缓冲溶液中的直接电化学行为如图3所示在裸CILE(曲线a)上没有氧化还原峰出现，表明电极表面不存在电活性物质。在CTS/Mb/CILE(曲线b)上出现一对不对称的氧化还原峰且峰电流很小，这表明Mb和CILE电极之间存在着较慢的直接电子传递速率。当把IL或CFe₃O₄加到复合膜中后，CTS/Mb/CFe₃O₄/CILE(曲线c)和CTS/IL/Hb/CILE(曲线d)上的氧化还原峰电流比CTS/Mb/CILE上的明显增大，电化学反应的可逆性增加，这是由于复合膜中存在的高导电率的IL或CFe₃O₄，促进了Mb与CILE之间的电子传递。而在CTS/IL/Mb/CFe₃O₄/CILE上(曲线e)得到了一对可逆性更好的氧化还原峰且循环伏安响应也比CTS/Mb/CFe₃O₄/CILE和CTS/IL/Mb/CILE电极上的大，表明复合膜中的IL和CFe₃O₄之间存在协同效应，从而有利于加快电子的传递。由曲线e可以得出还原峰电位Epc和氧化峰电位Epa分别为-0.298V和-0.168V(vs.SCE)，且峰电位差(□Ep)为74mV，式电位(E^0’)为-0.233V，氧化峰电流与还原峰电流的比值接近1。这一结果表明电极上Mb的血红素辅基Fe(III)/Fe(П)电对的直接电子转移得以实现，CILE上的复合膜的存在促进了电子传递。研究了CTS/IL/Mb/CFe₃O₄/CILE生物传感器对三氯乙酸(TCA)的电催化还原性能，结果如图4所示。当往氮气饱和的pH 7.0的PBS缓冲溶液中滴加一定浓度的TCA后，可以发现还原峰电流显著增大，且随着TCA加入量的不断增大，还原峰电流明显增大而氧化峰逐渐则逐渐减少甚至消失还原峰电流和TCA的浓度在1.0-20.0mmol/L的范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为Iss(μA)＝20.680C(mmol L^-1)5.764(γ＝0.993)，检测限为0.3337mmol/L(3σ)。当TCA的浓度大于20.0mmol/L时，峰电流基本不变，且已达到饱和，说明这是一个典型的Michaelis-Menten动力学过程说明复合膜中的Mb对TCA具有较好的电催化能力，这主要是由于CTS/IL/CFe₃O₄纳米复合膜具有良好的生物相容性，使得酶和底物之间的反应能更好的进行。

本发明的优点在于：采用了本发明制备的肌红蛋白-梭状CFe₃O₄纳米颗粒-离子液体-壳聚糖复合材料敏感膜，可以应用于TCA等环境污染物的测定，并且具有感应膜制备工艺简单、成本低。

附图说明

图1为本发明水热合成的梭形CFe₃O₄纳米颗粒的SEM照片。

图2为本发明不同修饰电极的阻抗曲线对比图。

图3为本发明不同修饰在0.1mol/L的pH 7.0PBS缓冲溶液电极直接电化学图。

图4为本发明的敏感膜对对三氯乙酸(TCA)的电催化还原性能图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

A梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备

A-1称量1.6mmol的FeCl₃·6H₂O和0.2mmol的NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入80mL去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液。将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜(武汉市709研究所)中，于100℃的烘箱中反应48h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤(转速：5000SPEED/RCF)下层的混浊液多次，将洗涤多次的浑浊液于60℃的烘箱中烘干8小时至样品完全干燥得到Fe₂O₃纳米颗粒。

A-2然后再利用水热法包碳制备CFe₃O₄纳米颗粒：称量150mg上述已制备好的Fe₂O₃粉末并超声(工作频率：40KHz)分散在5mL的去离子水中，随后将15mL浓度为0.3Mol/L的葡萄糖溶液和10mL的无水乙醇加入到上述悬浮液里，超声(工作频率：40KHz处理半小时。将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜(武汉市709研究所)中，于180℃的烘箱中反应12h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，60℃的烘箱中烘干后，再将前驱体在氮气保护下600℃退火4h(升温速度5℃/min，气流量45sccm)，最终可得到梭状的CFe₃O₄纳米颗粒。

B CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备

将3.2g石墨粉，100μL[BMIM]BF₄和900μL液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨1小时使其完全碾碎成糊状液体，使其混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管(武汉市709研究所)中，并在玻璃管的尾端插入一根铜导线(直径1mm，长度3-6cm)，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极(CILE)。值得注意的是，每次使用前必须将CILE在称量纸上打磨，使其表面光滑。

Mb修饰的CILE电极制备：取10μL 2.0mg/mL上述制备的CFe₃O₄悬浮液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的Mb水溶液(10.0mg/mL)，室温自然晾干后，再向上述所得的离子液体修饰碳糊电极(CILE)电极表面分别滴涂5.0μL[EMIM]EtOSO₃(6.0％PBS pH为7.0)和8.0μL CTS的水溶液(1.0％HAc)，在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极。

实施例2：

A交流阻抗(EIS)

流阻抗是检测电化学电极修饰过程中阻抗变化的常用手段，根据高频区半圆半径大小可以直观地判断修饰电极的界面阻抗变化。本实验所用测试仪器为测试仪器为上海辰华工作站CHI 440A，采用三电极体系(参比电极为Ag/AgCl，对电极为铂丝ADl3-0.3mm，工作电极为不同的修饰电极)研究了不同的修饰电极在5.0mol/L[Fe(CN)₆]^3-/^4-和0.1mol/L KCl混合溶液中扫描范围为0.1-105Hz的电化学交流阻抗谱(EIS)。如图2所示在CILE(曲线a)上电子传递电阻(Ret)为40.5Ω。然而在CTS/IL/Mb/CILE电极上，其阻抗值减小到24.1Ω(曲线b)，这是由于复合膜中存在有高导电率的IL。在CTS/IL/Mb/CFe₃O₄/CILE(曲线d)上Ret值进一步降低，半圆形基本消失，而且其Ret值小于CTS/IL/Mb/Fe₂O₃/CILE电极的Ret值(曲线c)，说明由于具有良好导电性的CFe₃O₄纳米颗粒的引入导致修饰电极具有更高的电化学活性。较高的电化学活性应该主要归因于碳良好的导电性和大的比表面积。EIS结果表明不同的电极固定方式使得修饰电极界面的电子传递电阻不同，并且Mb也被成功地固定在电极表面。

B研究了MB(牛肌红蛋白，分子量为17800，生物纯，美国Sigma公司)的直接电化学行为

测试仪器为上海辰华工作站CHI 440A，采用三电极体系(参比电极为Ag/AgCl，对电极为铂丝ADl30.3mm，工作电极为不同的修饰电极)。将不同的修饰电极置于0.1mol/L的pH 7.0PBS缓冲水溶液中的直接电化学行为如图3所示，在裸CILE(曲线a)上没有氧化还原峰出现，表明电极表面不存在电活性物质。在CTS/Mb/CILE(曲线b)上出现一对不对称的氧化还原峰且峰电流很小，这表明Mb和CILE电极之间存在着较慢的直接电子传递速率。当把IL或CFe₃O₄加到复合膜中后，CTS/Mb/CFe₃O₄/CILE(曲线c)和CTS/IL/Hb/CILE(曲线d)上的氧化还原峰电流比CTS/Mb/CILE上的明显增大，电化学反应的可逆性增加，这是由于复合膜中存在的高导电率的IL或CFe₃O₄，促进了Mb与CILE之间的电子传递。而在CTS/IL/Mb/CFe₃O₄/CILE上(曲线e)得到了一对可逆性更好的氧化还原峰且循环伏安响应也比CTS/Mb/CFe₃O₄/CILE和CTS/IL/Mb/CILE电极上的大，表明复合膜中的IL和CFe₃O₄之间存在协同效应，从而有利于加快电子的传递。由曲线e可以得出还原峰电位Epc和氧化峰电位Epa分别为-0.298V和-0.168V(vs.SCE)，且峰电位差(ΔEp)为74mV，式电位(E^0’)为-0.233V，氧化峰电流与还原峰电流的比值接近1。这一结果表明电极上Mb的血红素辅基Fe(III)/Fe(П)电对的直接电子转移得以实现，CILE上的复合膜的存在促进了电子传递。

C研究了所制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄/CILE生物传感器对三氯乙酸(TCA)的电催化还原性能

测试仪器为上海辰华工作站CHI 440A，采用三电极体系(参比电极为Ag/AgCl，对电极为铂丝AD13-0.3mm，工作电极为CTS/IL/Mb/CFe₃O₄/CILE电极)。结果如图4所示，各曲线代表CTS/IL/Mb/CFe₃O₄/CILE在不同浓度TCA的PH 7.0PBS缓冲液中的循环伏安图(其中从a到k，TCA的浓度分别为：0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0，12.0，18.0mmol/L)，插图为TCA浓度与相应的催化还原电流之间的关系。。这说明了向氮气饱和的pH 7.0的PBS缓冲溶液中滴加一定浓度的TCA后，可以发现还原峰电流显著增大，且随着TCA浓度的不断增大，还原峰电流也在明显增大而氧化峰逐渐则逐渐减少甚至消失，这是一个典型的电催化还原反应。根据文献可以推导其电催化机理如下：

Mb(Fe^III)+e→Mb(Fe^II)

CCl₃COOH→CCl₃COO-+H⁺

Mb(Fe^II)+CCl₃COOH+H⁺→Mb(Fe^III)+HCCl₂COOH+Cl^-

在1.0-20.0mmol/L的范围内，还原峰电流与TCA的浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为Iss(μA)＝24.707C(mmol L-1)-22.154(n＝12，γ＝0.993)，检测限为0.333mmol/L(3σ)。当TCA的浓度大于20.0mmol/L时，峰电流基本不变，且已达到饱和，说明这是一个典型的Michaelis-Menten动力学过程。根据Lineweaver-Burk方程的电化学形式：

$1/I_{\mathrm{SS}}=1/I_{\max }+K_M^{\mathrm{app}}/I_{\max }C$

其中Iss是加底物后的稳态电流，Imax是在饱和底物状态下所测得的最大电流，C是底物的体积浓度。

结合双倒数作图法(1/ISS-1/[TCA])可以计算出此催化反应的表观米氏常数为1.886mmol/L，这比之前报道的一些关于Mb生物传感器的KMapp值都要小[138-140]，表明在此复合膜中的Mb对TCA有较好的电催化能力。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种电化学生物传感器敏感膜，其特征在于：由一种新型的梭状CFe₃O₄纳米颗粒及高导电性的[EMIM]EtOSO₃制备得到。

2.权利要求1所述电化学生物传感器敏感膜，其特征在于，由以下制备方法制备得到，A梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备：

A-1Fe₂O₃纳米颗粒的制备：称量FeCl₃·6H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液；再将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，于烘箱中反应一段时间，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温；倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，将洗涤多次的浑浊液烘箱中烘干至样品完全干燥得到Fe₂O₃纳米颗粒；

A-2CFe₃O₄纳米颗粒的制备：称量上述所得Fe₂O₃粉末并超声分散在去离子水中，随后将葡萄糖溶液和无水乙醇加入到上述悬浮液里，超声处理；再将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，于烘箱中反应，结束后取出高压釜使之自然冷却至室温；去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，烘箱中烘干后，再将前驱体在氮气保护下退火，最终可得到梭状CFe₃O₄纳米颗粒；

B CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备：

将石墨粉，[BMIM]BF₄和液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨使其完全碾碎成糊状液体并混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管中，并在玻璃管的尾端插入一根铜导线，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极CILE；使用电极前将CILE在称量纸上打磨，使其表面光滑；

Mb修饰的CILE电极制备：取上述所得的CFe₃O₄纳米颗粒配制成10uL 2.0mg/mL的悬浮水液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的10.0mg/mL Mb水溶液，室温自然晾干后，再向上述所得的离子液体修饰碳糊电极CILE表面分别滴涂5.0μL[EMIM]EtOSO₃和8.0uL CTS的水溶液，在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极。

3.权利要求2所述电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征在于，所述梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备为，

A-1称量1.6mmol的FeCl₃·6H₂O和0.2mmol的NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入80mL去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液。将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，于100℃的烘箱中反应48h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤，转速：5000SPEED/RCF，下层的混浊液多次，将洗涤多次的浑浊液于60℃的烘箱中烘干8小时至样品完全干燥得到Fe₂O₃纳米颗粒；

A-2CFe₃O₄纳米颗粒的制备：称量150mg上述已制备好的Fe₂O₃粉末并超声，工作频率：40KHz，分散在5mL的去离子水中，随后将15mL浓度为0.3Mol/L的葡萄糖溶液和10mL的无水乙醇加入到上述悬浮液里，进行超声，频率为40KHz处理半小时；将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，于180℃的烘箱中反应12h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，60℃的烘箱中烘干后，再将前驱体在氮气保护下600℃退火4h，其升温速度5℃/min，气流量45sccm，最终可得到梭状的CFe₃O₄纳米颗粒。

4.权利要求2所述电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征在于，所述CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备为，

将3.2g石墨粉，100μL[BMIM]BF₄和900μL液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨1小时使其完全碾碎成糊状液体，使其混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管中，并在玻璃管的尾端插入一根直径1mm，长度3-6cm的铜导线，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极CILE；

Mb修饰的CILE电极制备：取上述所得的CFe₃O₄纳米颗粒配制成10uL 2.0mg/mL的悬浮水液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的10.0mg/mL Mb水溶液，室温自然晾干后，再向上述所得的离子液体修饰碳糊电极CILE表面分别滴涂5.0μL[EMIM]EtOSO₃和8.0μL CTS的水溶液，所述[EMIM]EtOSO₃浓度为6.0重量体积％，溶剂为PBS溶液，pH值为7.0，所述CTS为1.0体积％，溶剂为HAc；在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极。

5.一种电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征在于，步骤为，

A梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备：

A-1Fe₂O₃纳米颗粒的制备：称量FeCl₃·6H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液；再将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，于烘箱中反应一段时间，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温；倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，将洗涤多次的浑浊液烘箱中烘干至样品完全干燥得到Fe₂O₃纳米颗粒；

A-2CFe₃O₄纳米颗粒的制备：称量上述所得Fe₂O₃粉末并超声分散在去离子水中，随后将葡萄糖溶液和无水乙醇加入到上述悬浮液里，超声处理；再将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，于烘箱中反应，结束后取出高压釜使之自然冷却至室温；去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，烘箱中烘干后，再将前驱体在氮气保护下退火，最终可得到梭状的CFe₃O₄纳米颗粒；

B CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备：

将石墨粉，[BMIM]BF₄和液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨使其完全碾碎成糊状液体并混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管中，并在玻璃管的尾端插入一根铜导线，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极CILE；使用电极前将CILE在称量纸上打磨，使其表面光滑；

Mb修饰的CILE电极制备：取上述所得的CFe₃O₄颗粒配制成10uL 2.0mg/mL的悬浮水液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的Mb水溶液(10.0mg/mL)，室温自然晾干后，再向上述所得的离子液体修饰碳糊电极CILE表面分别滴涂5.0μL[EMIM]EtOSO₃和CTS的水溶液，在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极，所述[EMIM]EtOSO₃浓度为6.0重量体积％，溶剂为PBS溶液，pH值为7.0，所述CTS为1.0体积％，溶剂为HAc。

6.权利要求1所述电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征在于，所述梭状CFe₃O₄纳米颗粒的制备为，

A-1称量1.6mmol的FeCl₃·6H₂O和0.2mmol的NaH₂PO₄·2H₂O于烧杯中，加入80mL去离子水，搅拌使之溶解，形成均一的溶液。将上述澄清溶液转移至100mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，于100℃的烘箱中反应48h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。倾滤出上层清液，用去离子水和无水乙醇离心洗涤，转速：5000SPEED/RCF，下层的混浊液多次，将洗涤多次的浑浊液于60℃的烘箱中烘干8小时至样品完全干燥得到Fe₂O₃纳米颗粒；

A-2CFe₃O₄纳米颗粒的制备：称量150mg上述已制备好的Fe₂O₃粉末并超声，工作频率：40KHz，分散在5mL的去离子水中，随后将15mL浓度为0.3Mol/L的葡萄糖溶液和10mL的无水乙醇加入到上述悬浮液里，进行超声，频率为40KHz处理半小时；将悬浮液转移至40mL的聚四氟乙烯不锈钢高压釜中，于180℃的烘箱中反应12h，反应结束后取出高压釜使之自然冷却至室温。去离子水和无水乙醇离心洗涤下层的混浊液多次，60℃的烘箱中烘干后，再将前驱体在氮气保护下600℃退火4h，其升温速度5℃/min，气流量45sccm，最终可得到梭状的CFe₃O₄纳米颗粒。

7.权利要求5所述电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征在于，所述CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极的制备为，

将3.2g石墨粉，100μL[BMIM]BF₄和900μL液体石蜡混合到一起，在研钵中研磨1小时使其完全碾碎成糊状液体，使其混合均匀。然后将上述混合均匀的碳糊填装到内径为4mm的玻璃管中，并在玻璃管的尾端插入一根直径1mm，长度3-6cm的铜导线，最后将玻璃管中的碳糊压紧压实，制得离子液体修饰碳糊电极CILE；

Mb修饰的CILE电极制备：取10μL 2.0mg/mL上述制备的CFe₃O₄悬浮液涂覆到CILE表面，自然晾干后，再在电极上涂覆8μL的10.0mg/mL Mb水溶液，室温自然晾干后，再向上述所得的离子液体修饰碳糊电极CILE表面分别滴涂5.0μL[EMIM]EtOSO₃和8.0μL CTS的水溶液，所述[EMIM]EtOSO₃为6.0体积％PBS溶液，pH值为7.0，所述CTS为1.0体积％HAc溶液；在室温下自然晾干后即可得到所要制备的CTS/IL/Mb/CFe₃O₄NSs/CILE电极。

8.权利要求1-4任一所述电化学生物传感器敏感膜或权利要求5-7任一所述制备方法制备得到的电化学生物传感器敏感膜的用途。

9.权利要求8所述用途为用于三氯乙酸的测定的用途。