CN108896636B - 一种超氧化物歧化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备 - Google Patents

一种超氧化物歧化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，其特征在于，首先采用纳米VN，氧化石墨烯，N‑乙基‑3‑甲基吡啶六氟磷酸盐制备得到纳米VN/石墨烯复合糊电极；然后，采用，γ―氨丙基三乙氧基硅烷修饰纳米VN/石墨烯复合糊电极，得到氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极；最后，采用磷酸盐缓冲溶液溶解牛血清蛋白和超氧化物岐化酶，制得超氧化物岐化酶固定液；再将超氧化物岐化酶固定液滴涂在氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极上，制备得到超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器。该电极具有比普通的碳糊电极导电性能提高，电化学窗口宽、制备方法简单、成本低、表面易更新、残余电流小等优点。检测超氧自由基灵敏度高，选择性好。

Description

一种超氧化物歧化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备
技术领域
本发明涉及一种电化学传感器的制备方法，特别涉一种超氧化物歧化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法及应用。属于电化学分析领域。
背景技术
酶电极分析方法是将酶蛋白分子采用传统的吸附法、包埋法、共价键合法、交联法作用固定化制成固定化酶膜，再与电化学基础电极相结合，构成酶电极生物传感器用于特异底物分析的一项生物技术。由于酶的高度专一性，该方法具有专一性高、稳定性好、检测速度快、选择性好、灵敏度高等特点。酶电极研究起步于20世纪60年代，自2000年以来，生物传感器技术在环境检测、食品安全、军事和医学等方面的应用日益广泛，在申请号为201410210210.3的专利中公开了检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用；在授权公告号为CN102435650 B的专利中公开了一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法；在授权公告号为CN102495115 B的专利中公开了利用生物酶电极法检测根系分泌物中苹果酸的电化学方法。
超氧自由基 superoxide radical,即O2·-，人体内产生的活性氧自由基，能引发体内脂质过氧化，加快从皮肤到内部器官整个肌体的衰老过程，并可诱发皮肤病变、心血管疾病、癌症等，严重危害人体健康，自由基摧毁细胞膜，导致细胞膜发生变性，使得细胞不能从外部吸收营养，也排泄不出细胞体内的代谢废物,并丧失了对细菌和病毒的抵御能力。从而使人体免疫力低下、疲劳和器官病变。自由基攻击正在复制中的基因，造成基因突变，诱发癌症发生。自由基侵蚀脑细胞使人易患老年性痴呆症。自由基氧化血液中的脂蛋白造成胆固醇向血管壁的沉积，引起心脏病和中风，动脉硬化，脑血栓，脑溢血，偏瘫，高血压等心脑血管病症。自由基引起关节膜及关节滑液的降解，从而导致关节炎。自由侵蚀胰脏细胞引起糖尿病等。因此检测及清楚人体中超氧自由基是十分必要的。
氮化钒（VN）是一种面心立方晶体结构的多功能金属氮化物，其具有高的导电性(电导率约为106/(Ω•m)和高的电化学活性六方晶体结构。是一类具有高催化活性的类贵金属催化剂和高容量电化学储能电极材料。石墨烯作为一类新型的超级电容器电极材料，石墨烯表现出以下众多的优势：超高的比表面积、良好的导电性能、优异的稳定的化学性能以及宽的电势窗口。单层石墨烯的容量可达21μF/cm2 ，但是很多情况下石墨烯都是多层叠加在一起，层与层之间的面积没有得到有效利用，其实际容量比单层石墨烯容量低，将石墨烯与其他纳米结构复合也抑制石墨烯片层的重叠。将高容量的过渡金属氮化物或导电聚合物与石墨烯进行叠层复合，一方面石墨烯被其他物质隔离开，能够减少团聚，增加电解液的流动性，另一方面，石墨烯为复合后的赝电容物质提供了电子传导的三维网络。基于石墨烯的复合材料表现出协同效应，在获得高容量的同时保持有良好的倍率性能。
发明内容
本发明的目的是采用N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐作为胶粘剂制备一种纳米VN/石墨烯复合糊电极，制备纳米VN /石墨烯复合糊电极，再采用超氧化物岐化酶修饰电极，提供一种超氧化物歧化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，并应用检测超氧自由基中。
仪器与试剂
CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），纳米VN /石墨烯复合糊电极（GCE）为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。
纳米VN，氧化石墨烯，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐，无水乙醇，氢氧化钠，液体石蜡，石油醚、磷酸盐缓冲溶液，超氧化物岐化酶（SuperoxideDismutase），简称SOD，ECl.15.1.1，戊二醛，γ―氨丙基三乙氧基硅烷，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，按如下质量百分比加入，纳米VN：42~45%，氧化石墨烯：20~25%，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：12~18%，液体石蜡：8~12%，石油醚：6~10%，各组分质量百分比之和为百分之百，，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/ N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，无水乙醇：74~78%，γ―氨丙基三乙氧基硅烷：22~26%，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应4~6h，温度升到50±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，放入质量百分浓度为15%的戊二醛溶液中，超声20~30min，取出干燥，得到氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极；
（3）超氧化物岐化酶固定液的制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中：98%~99%，牛血清蛋白：0.4%~1.5%，超氧化物岐化酶：0.4%~1.5%，各组分质量百分浓度之和为百分之百，搅拌溶解，该溶液为超氧化物岐化酶固定液；
（4）超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的超氧化物岐化酶固定液滴涂到步骤（2）制备的氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极上，滴涂的量为15~20μL，干燥，即得超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器。
步骤（1）所述的液体石蜡为环保级液体石蜡。
步骤（1）所述的石油醚为石油醚60-90℃。
步骤（3）所述的牛血清蛋白与超氧化物岐化酶的质量比为1：1。
超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器测定超氧自由基步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的超氧自由基标准溶液，底液为pH7.0的磷酸盐缓冲溶液；
（2）将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极为工作电极组成三电极系统， 连接CHI660B电化学工作站，底液为pH7.0的磷酸盐缓冲溶液，在-1.2~0.6V的电位范围，以50mV/s循环扫描15min，取出洗涤。然后采用计时电流法扫描该溶液，工作电压为-0.85V，取不同浓度下超氧自由基的峰电流值与超氧自由基浓度做工作曲线；
（3）超氧自由基的检测：用待测样品代替步骤（1）中的超氧自由基标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中超氧自由基的含量；
本发明的优点及效果是：
（1）本发明制备超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器，在糊电极中加入氮化钒，以N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐作为胶粘剂，将氮化钒与氧化石墨烯混合制备的糊电极比普通的碳糊电极导电性能提高2~4倍，再采用超氧化物岐化酶修饰纳米VN /石墨烯复合糊电极制备的，电化学窗口宽、对超氧自由基具有专一的选择性，制备方法简单、成本低、表面易更新、残余电流小等优点；
（2）本发明制备超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器对超氧自由基表现出很高选择性和灵敏性，响应电流与超氧自由基的浓度在4.0×10-7~4.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，相关系数R=0.9982，检测限为6.45×10-7mol/ L，回收率在96.84~104.26%之间；
（3）本发明制备超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器在制备的过程中不使用有毒的试剂，环保绿色；
（4）将本发明制备超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器成功用于药品、生物中超氧自由基的检测中，解决了超氧自由基检测困难。
具体实施方式
实施例1
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米VN：43g，氧化石墨烯：22g，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：15g，液体石蜡：10g，石油醚：15.5mL，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/ N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：96 mL，γ―氨丙基三乙氧基硅烷：24g，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应5h，温度升到50±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，放入质量百分浓度为15%的戊二醛溶液中，超声25min，取出干燥，得到氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极；
（3）超氧化物岐化酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中：98 mL，牛血清蛋白：1.0g，超氧化物岐化酶：1.0g，搅拌溶解，该溶液为超氧化物岐化酶固定液；
（4）超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的超氧化物岐化酶固定液18μL滴涂到步骤（2）制备的氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极上，干燥，即得超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器。
实施例2
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米VN：45g，氧化石墨烯：20g，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：18g，液体石蜡：12g，石油醚：9.5mL，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/ N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：94 mL，γ―氨丙基三乙氧基硅烷：26g，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应4h，温度升到50±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，放入质量百分浓度为15%的戊二醛溶液中，超声20min，取出干燥，得到氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极；
（3）超氧化物岐化酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中：99 mL，牛血清蛋白：0.5g，超氧化物岐化酶：0.5g，搅拌溶解，该溶液为超氧化物岐化酶固定液；
（4）超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的超氧化物岐化酶固定液15μL滴涂到步骤（2）制备的氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极上，干燥，即得超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器。
实施例3
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米VN：42g，氧化石墨烯：25g，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：14g，液体石蜡：11g，石油醚：12.5mL，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/ N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：99 mL，γ―氨丙基三乙氧基硅烷：22g，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应6h，温度升到50±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，放入质量百分浓度为15%的戊二醛溶液中，超声30min，取出干燥，得到氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极；
（3）超氧化物岐化酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中：98.5 mL，牛血清蛋白：0.75g，超氧化物岐化酶：0.75g，搅拌溶解，该溶液为超氧化物岐化酶固定液；
（4）超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的超氧化物岐化酶固定液20μL滴涂到步骤（2）制备的氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极上，干燥，即得超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器。
实施例4
（1）纳米VN /石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米VN：44g，氧化石墨烯：24g，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：12g，液体石蜡：11g，石油醚：14mL，研磨均匀，即得纳米VN /石墨烯/ N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN /石墨烯复合糊电极；
（2）氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：95 mL，γ―氨丙基三乙氧基硅烷：25g，混合均匀，将纳米VN /石墨烯复合糊电极放入，室温反应4.5h，温度升到50±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，放入质量百分浓度为15%的戊二醛溶液中，超声28min，取出干燥，得到氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极；
（3）超氧化物岐化酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中：49.4mL，牛血清蛋白：0.3g，超氧化物岐化酶：0.3g，搅拌溶解，该溶液为超氧化物岐化酶固定液；
（4）超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的超氧化物岐化酶固定液16μL滴涂到步骤（2）制备的氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极上，干燥，即得超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器。
本发明制备的超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器成功用于药品、环境、生物样品中超氧自由的检测中，回收率在96.84~104.26%之间，因此本发明制备的超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器可广泛应用于生物医药、食品、化工、环保检测等相关领域，解决了超氧自由基检测的困难。

Claims (1)

1.一种超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
(1)纳米VN/石墨烯复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，按如下质量百分比加入，纳米VN：42～45％，氧化石墨烯：20～25％，N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐：12～18％，液体石蜡：8～12％，石油醚：6～10％，各组分质量百分比之和为百分之百，研磨均匀，即得纳米VN/石墨烯/N-乙基-3-甲基吡啶六氟磷酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内径为Φ3mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米VN/石墨烯复合糊电极；
(2)氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，无水乙醇：74～78％，γ―氨丙基三乙氧基硅烷：22～26％，混合均匀，将纳米VN/石墨烯复合糊电极放入，室温反应4～6h，温度升到50±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，放入质量百分浓度为15％的戊二醛溶液中，超声20～30min，取出干燥，得到氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极；
(3)超氧化物岐化酶固定液的制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液：98％～99％，牛血清蛋白：0.4％～1.5％，超氧化物岐化酶：0.4％～1.5％，各组分质量百分浓度之和为百分之百，搅拌溶解，该溶液为超氧化物岐化酶固定液；
(4)超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器的制备：取步骤(3)制备的超氧化物岐化酶固定液滴涂到步骤(2)制备的氨丙基三乙氧基硅烷修饰电极上，滴涂的量为15～20μL，干燥，即得超氧化物岐化酶修饰氮化钒糊电极传感器。
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