CN108663422B - 胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法 - Google Patents

胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，首先，采用，纳米TiB2、氧化碳纳米管和1‑丙烯基‑3‑甲基咪唑四氟硼酸盐，制备得到纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极；然后，采用巯基丙基三甲氧基硅烷环氧化纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极，得到巯基化纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极；最后采用0.5%OP‑10水溶液、动物胶、胆固醇氧化酶配制胆固醇氧化酶固定液；将巯基化纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极浸泡在胆固醇氧化酶固定液中，超声反应30min，冷冻干燥，即得胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器。该电极传感器具有比普通的碳糊电极导电性能高，对胆固醇具有专一识别性，灵敏度高。

Description

胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种电化学传感器的制备方法，特别涉及一种胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法及应用。属于电化学分析领域。
背景技术
胆固醇又称胆甾醇。一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。胆固醇经代谢还能转化为胆汁酸、类固醇激素、7-脱氢胆固醇，并且7-脱氢胆固醇经紫外线照射就会转变为维生素D3，所以胆固醇并非是对人体有害的物质。胆固醇还是临床生化检查的一个重要指标，在正常情况下，机体在肝脏中合成和从食物中摄取的胆固醇，将转化为甾体激素或成为细胞膜的组分，并使血液中胆固醇的浓度保持恒定。当肝脏发生严重病变时，胆固醇浓度会降低。而在黄疸性梗阻和肾病综合征患者体内，胆固醇浓度往往会升高。胆固醇在体内有着广泛的生理作用，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，对机体产生不利的影响。现代研究已发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成与胆石症与高胆固醇血症有密切的相关性。高胆固醇血症是导致动脉粥样硬化的一个很重要的原因。因此，简单、快速和灵敏的测定胆固醇在临床医学检验中具有重要的价值。
酶电极分析方法是将酶蛋白分子采用传统的吸附法、包埋法、共价键合法、交联法作用固定化制成固定化酶膜，再与电化学基础电极相结合，构成酶电极生物传感器用于特异底物分析的一项生物技术。由于酶的高度专一性，该方法具有专一性高、稳定性好、检测速度快、选择性好、灵敏度高等特点。酶电极研究起步于20世纪60年代，自2000年以来，生物传感器技术在环境检测、食品安全、军事和医学等方面的应用日益广泛，在申请号为201410210210.3的专利中公开了检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用；在授权公告号为CN102435650 B的专利中公开了一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法；在授权公告号为CN102495115 B的专利中公开了利用生物酶电极法检测根系分泌物中苹果酸的电化学方法。
二硼化钛（TiB2），具有六方(AlB2)的晶体结构。晶体结构中的硼原子面和钛原子面交替出现构成二维网状结构。这种类似于石墨的硼原子层状结构和Ti外层电子决定了TiB2具有良好的导电性和金属光泽，而硼原子面和钛原子面之间Ti-B键决定了这种材料的高硬度和脆性的特点。呈现金属的导电特性电阻率在10-8Ω•m化学和热稳定性好等特点。是一类具有高容量电化学储能电极材料。碳纳米管作为一维纳米材料，重量轻，六边形结构连接完美，具有许多异常的力学、电学和化学性能。由于碳纳米管（CNTs）的管径小于6nm时，CNTs可以被看成具有良好导电性能的一维量子导线。另外，将碳纳米管与其他纳米结构复合也抑制碳纳米管片层的重叠。一方面碳纳米管被其他物质隔离开，能够减少团聚，增加电解液的流动性，另一方面，碳纳米管为复合后的赝电容物质提供了电子传导的三维网络。基于碳纳米管的复合材料表现出协同效应，在获得高容量的同时保持有良好的倍率性能。
发明内容
提供了一种胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法，并应用检测胆固醇中。
仪器与试剂
CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极传感器为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。
纳米TiB2，氧化碳纳米管，1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，无水乙醇，，盐酸，胆固醇，巯基丙基三甲氧基硅烷，胆固醇氧化酶(EC1.1.3.6)，牛血清蛋白，甘油，pH=6.8 磷酸盐缓冲溶液，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，按如下质量百分比加入，纳米TiB2：40~44%，氧化碳纳米管：26~30%，1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐：20~24%，甘油：6~10%，各组分质量百分比之和为百分之百，研磨均匀，即得纳米TiB2 /碳纳米管/1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ4.0mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨抛光，去离子水洗涤，即得纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极。
（2）巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，无水乙醇：65~70%，巯基丙基三甲氧基硅烷：30~35%，混合均匀，将纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极放入，温度升到45±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极；
（3）胆固醇氧化酶固定液的制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，0.5%OP-10水溶液：96~98%，动物胶：0.5~1.5%，加热，溶解，冷至室温，胆固醇氧化酶：1.5~2.5%，各组分质量百分浓度之和为百分之百，搅拌溶解，该溶液为胆固醇氧化酶固定液；
（4）胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备：将步骤（2）制备的巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极浸泡在步骤（3）制备的胆固醇氧化酶固定液中，超声反应30min，取出水洗，冷冻干燥，即得胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器。
步骤（1）中所述的碳纳米管为多壁碳纳米管管径小于6nm。
步骤（3）中所述的胆固醇氧化酶为胆固醇氧化酶EC1.1.3.6，规格为18.45U/mg。
胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器测定胆固醇步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的胆固醇标准溶液，底液为，pH=6.8 磷酸盐缓冲溶液；
（2）将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，底液为，pH=6.8 磷酸盐缓冲溶液，在-0.5~0.5V的电位范围，以40mV/s循环扫描30min，取出洗涤。然后采用计时电流法扫描该溶液，工作电压为-0.1V，取不同浓度下次胆固醇的峰电流值与胆固醇浓度做工作曲线；
（3）胆固醇的检测：用待测样品处理成待测液代替步骤（1）中的胆固醇标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中胆固醇的含量；
本发明的优点及效果是：
（1）本发明制备胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器，以纳米TiB2和氧化碳纳米管，采用1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐作为胶粘剂，混合制备的糊电极比普通的碳糊电极导电性能提高2~4倍，再采用胆固醇氧化酶修饰巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极，电化学窗口宽、对胆固醇具有专一的选择性，制备方法简单、成本低、表面易更新、残余电流小等优点；
（2）本发明制备胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器对胆固醇表现出很高选择性和灵敏性，响应电流与胆固醇的浓度1.0×10-7~2.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，相关系数R=0.9983，检测限为1.21×10-7mol/ L，回收率在97.82~103.37%之间；
（3）本发明制备胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器在制备的过程中不使用有毒的试剂，环保绿色；成功用于药品、生物等样品中胆固醇的检测中。
具体实施方式
实施例1
（1）纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米TiB2：42g，氧化碳纳米管：28g，1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐：22g，甘油：8g，研磨均匀，即得纳米TiB2 /碳纳米管/1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ4.0mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨抛光，去离子水洗涤，即得纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极。
（2）巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：86 mL，巯基丙基三甲氧基硅烷：32g，混合均匀，将纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极放入，温度升到45±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到巯基化纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极；
（3）胆固醇氧化酶固定液制备：在反应器中，分别加入，0.5%OP-10水溶液：97 mL，动物胶：1.0g，加热，溶解，冷至室温，胆固醇氧化酶：2.0g，搅拌溶解，该溶液为胆固醇氧化酶固定液；
（4）胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备：将步骤（2）制备的巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极浸泡在步骤（3）制备的胆固醇氧化酶固定液中，超声反应30min，取出水洗，冷冻干燥，即得胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器。
实施例2
（1）纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米TiB2：40g，氧化碳纳米管：30g，1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐：24g，甘油：6g，研磨均匀，即得纳米TiB2 /碳纳米管/1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ4.0mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨抛光，去离子水洗涤，即得纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极。
（2）巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：82 mL，巯基丙基三甲氧基硅烷：35g，混合均匀，将纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极放入，温度升到45±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到巯基化纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极；
（3）胆固醇氧化酶固定液制备：在反应器中，分别加入，0.5%OP-10水溶液：96 mL，动物胶：1.5g，加热，溶解，冷至室温，胆固醇氧化酶：2.5g，搅拌溶解，该溶液为胆固醇氧化酶固定液；
（4）胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备：将步骤（2）制备的巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极浸泡在步骤（3）制备的胆固醇氧化酶固定液中，超声反应30min，取出水洗，冷冻干燥，即得胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器。
实施例3
（1）纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米TiB2：44g，氧化碳纳米管：26g，1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐：20g，甘油：10g，研磨均匀，即得纳米TiB2 /碳纳米管/1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ4.0mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨抛光，去离子水洗涤，即得纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极。
（2）巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：88mL，巯基丙基三甲氧基硅烷：30g，混合均匀，将纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极放入，温度升到45±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极；
（3）胆固醇氧化酶固定液制备：在反应器中，分别加入，0.5%OP-10水溶液：98 mL，动物胶：0.5g，加热，溶解，冷至室温，胆固醇氧化酶：1.5g，搅拌溶解，该溶液为胆固醇氧化酶固定液；
（4）胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备：将步骤（2）制备的巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极浸泡在步骤（3）制备的胆固醇氧化酶固定液中，超声反应30min，取出水洗，冷冻干燥，即得胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器。
实施例4
（1）纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米TiB2：43g，氧化碳纳米管：29g，1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐：21g，甘油：7g，研磨均匀，即得纳米TiB2 /碳纳米管/1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ4.0mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨抛光，去离子水洗涤，即得纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极。
（2）巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极制备：在反应器中，分别加入，无水乙醇：84mL，巯基丙基三甲氧基硅烷：34g，混合均匀，将纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极放入，温度升到45±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极；
（3）胆固醇氧化酶固定液制备：在反应器中，分别加入，0.5%OP-10水溶液：97.4mL，动物胶：0.8g，加热，溶解，冷至室温，胆固醇氧化酶：1.8g，搅拌溶解，该溶液为胆固醇氧化酶固定液；
（4）胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备：将步骤（2）制备的巯基化纳米TiB2 /碳纳米管复合糊电极浸泡在步骤（3）制备的胆固醇氧化酶固定液中，超声反应30min，取出水洗，冷冻干燥，即得胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器。
本发明制备的胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器成功用于药品、生物等样品中胆固醇的检测中，回收率在97.82~103.37%之间。

Claims (3)

1.一种胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
(1)纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极的制备：在玛瑙研钵中，按如下质量百分比加入，纳米TiB2：40～44％，氧化碳纳米管：26～30％，1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐：20～24％，甘油：6～10％，各组分质量百分比之和为百分之百，研磨均匀，即得纳米TiB2/碳纳米管/1-丙烯基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐混合物碳糊；然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ4.0mm的玻璃管内，压实，干燥，用抛光粉打磨抛光，去离子水洗涤，即得纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极；
(2)巯基化纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，无水乙醇：65～70％，巯基丙基三甲氧基硅烷：30～35％，混合均匀，将纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极放入，温度升到45±2℃恒温反应6h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到巯基化纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极；
(3)胆固醇氧化酶固定液的制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，0.5％OP-10水溶液：96～98％，动物胶：0.5～1.5％，加热，溶解，冷至室温，胆固醇氧化酶：1.5～2.5％，各组分质量百分浓度之和为百分之百，搅拌溶解，该溶液为胆固醇氧化酶固定液；
(4)胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备：将步骤(2)制备的巯基化纳米TiB2/碳纳米管复合糊电极浸泡在步骤(3)制备的胆固醇氧化酶固定液中，超声反应30min，取出水洗，冷冻干燥，即得胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器。
2.根据权利要求1所述的一种胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碳纳米管为多壁碳纳米管管径小于6nm。
3.根据权利要求1所述的一种胆固醇氧化酶修饰TiB2复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的胆固醇氧化酶为胆固醇氧化酶EC1.1.3.6，规格为18.45U/mg。
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