CN110441373A - 一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，采用纳米氮化铌、氧化纳米石墨粉、复合胶黏剂和液体石蜡，制得纳米NbN/石墨复合糊电极传感器；采用环氧基硅烷偶联剂对上述糊电极进行预处理，采用去离子水，乙醇氧化酶，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，黄原胶制得乙醇氧化酶固定液固定液；采用滴涂法将乙醇氧化酶固定液固定液滴涂到环氧基硅烷偶联剂预处理纳米NbN/石墨复合糊电极，得到乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器。该电极传感器具有比普通的碳糊电极导电性能高，对乙醇具有专一识别性，灵敏度高，广泛应用于生物医药、化妆品、生物、环保检测等相关领域。

Description

一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种电化学传感器的制备方法，特别涉及一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法及应用。属于电化学分析领域。
背景技术
血液中酒精浓度检测现在不仅作为控制和惩罚酒驾的执法手段，在需要高度精神集中的岗位，如：吊车司机、哨所、火车司机、飞机驾驶员、煤矿工人、钢厂炉前操作工、医生等等，酒精检测也得到广泛的应用。目前最简洁的血液中酒精浓度检测是呼气酒精浓度检测。呼气浓度检测与血液酒精浓度关系密切。目前市场上流行的酒精测试传感器,共有三种方案:半导体式酒精传感器方案、电化学酒精传感器方案、红外线酒精传感器方案，除此之外还有比色法、色谱法等。其中，电化学法相对精确作为执法手段被广泛应用，半导体酒精检测仪主要用于个人检测。目前市场上通用的电化学酒精传感器基本上是以燃料电池型酒精传感器为主,它是利用醇类化合物在贵金属电极上发生电化学氧化反应，产生氧化电流,电流的强度与乙醇的浓度直接相关。由于使用燃料电池原理,传感器的工作电极的催化剂活性非常高,这就使得这种传感器的选择性不是很好。传感器的设计者必须在提高传感器选择性和灵敏度有所突破。因此，准确检测血液中的乙醇备受关注。
酶电极分析方法是将酶蛋白分子采用传统的吸附法、包埋法、共价键合法、交联法作用固定化制成固定化酶膜，再与电化学基础电极相结合，构成酶电极生物传感器用于特异底物分析的一项生物技术。由于酶的高度专一性，该方法具有专一性高、稳定性好、检测速度快、选择性好、灵敏度高等特点。酶电极研究起步于20世纪60年代，自2000年以来，生物传感器技术在环境检测、食品安全、军事和医学等方面的应用日益广泛，在申请号为201410210210.3的专利中公开了检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用；在授权公告号为CN102435650 B的专利中公开了一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法；在授权公告号为CN102495115 B的专利中公开了利用生物酶电极法检测根系分泌物中苹果酸的电化学方法。
纳米NbN /石墨复合糊电极传感器，在碳糊电极中加入纳米NbN，采用1-乙烯基-3-丁基咪唑三氟甲磺酸盐熔融丝瓜络作为复合胶粘剂，液体石蜡作为辅助剂，将纳米NbN 与预处理纳米石墨粉混合制备的碳糊电极比普通的碳糊电极导电性能提高6~8倍，电化学窗口宽、制备方法简单、成本低、表面易更新、残余电流小等优点。本申请将乙醇氧化酶修饰在纳米NbN /石墨复合糊电极上制得乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器，并用于乙醇的检测中。
发明内容
仪器与试剂
CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。
纳米NbN，氧化石墨，1-乙烯基-3-丁基咪唑三氟甲磺酸盐，无水乙醇，液体石蜡，石油醚、磷酸盐缓冲溶液，乙醇氧化酶（ECl.1.3.13），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，环氧基硅烷偶联剂，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米NbN /石墨复合糊电极传感器的制备：在玛瑙研钵中，按如下质量百分比加入，纳米氮化铌：42~46%，氧化纳米石墨粉：22~26%，复合胶黏剂：14~18%，液体石蜡：16~20%，各组分质量百分比之和为百分之百，研磨均匀成碳糊状，然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ6mm的玻璃管内，压实，干燥，用金相砂纸打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米NbN /石墨复合糊电极传感器。
（2）环氧基硅烷偶联剂预处理电极：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，丙酮：64~67%，环氧基硅烷偶联剂：33~36%，混合均匀，将纳米NbN /石墨复合糊电极放入，室温浸泡6h，温度升到45±2℃恒温反应3h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到环氧基硅烷偶联剂预处理纳米NbN /石墨复合糊电极；
（3）乙醇氧化酶固定液的制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，去离子水：86~90%，乙醇氧化酶：2.0~4.0%，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：5~9%，黄原胶：1.0~2.0%，各组分质量百分浓度之和为百分之百，搅拌溶解，该溶液为乙醇氧化酶固定液固定液；
（4）乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的乙醇氧化酶固定液固定液16~20μL滴涂到步骤（2）制备的环氧基硅烷偶联剂预处理电极，干燥，即得乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器。
步骤（1）所述的复合胶黏剂的制备方法为在反应釜中，按如下质量百分比加入，1-乙烯基-3-丁基咪唑三氟甲磺酸盐：72~76%，预处理丝瓜络粉：24~28%，盖好密封盖，置于恒温箱中，温度在160±2℃恒温，反应15~18h，得到粘稠淡黄色透明液体，为复合胶黏剂。
所述预处理丝瓜络粉是成熟的丝瓜去皮去子，分别用酸碱处理，去除酸碱可溶物，经粉碎，过筛300目。
步骤（1）所述的液体石蜡与为环保级液体石蜡。
步骤（3）所述的乙醇氧化酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摩尔比为1：1~1.2之间。
乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器测定乙醇步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的乙醇标准溶液，底液为pH7.2的磷酸盐缓冲溶液；
（2）将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的乙醇氧化酶修饰复合糊电极为工作电极组成三电极系统， 连接CHI660B电化学工作站，底液为pH7.2的磷酸盐缓冲溶液，取不同浓度下乙醇的峰电流值与乙醇浓度做工作曲线；
（3）乙醇的检测：用待测样品处理成待测液代替步骤（1）中的乙醇标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中乙醇的含量；
本发明的优点及效果是：
（1）本发明制备的乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器，在糊电极中加入氮化铌，以1-乙烯基-3-丁基咪唑三氟甲磺酸盐溶解丝瓜络作为胶粘剂，将氮化铌与氧化石墨混合制备的糊电极比普通的碳糊电极导电性能提高6~8倍，再采用乙醇氧化酶修饰纳米纳米NbN /石墨复合糊电极制备的，电化学窗口宽、对乙醇具有专一的选择性，制备方法简单、成本低、表面易更新、残余电流小等优点；
（2）本发明制备乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器对乙醇表现出很高选择性和灵敏性，响应电流与乙醇的浓度6.5×10-6~2.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，相关系数R=0.9956，检测限为8.42×10-7mol/ L，回收率在92.82~103.62%之间；
（3）本发明制备的乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器在制备的过程中不使用有毒的试剂，环保绿色，成功用于药品、生物、化妆品等样品中乙醇的检测中。
具体实施方式
实施例1
（1）纳米NbN /石墨复合糊电极传感器的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米氮化铌：44g，氧化纳米石墨粉：24g，复合胶黏剂：16g，液体石蜡：16g，研磨均匀成碳糊状，然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ6mm的玻璃管内，压实，干燥，用金相砂纸打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米NbN /石墨复合糊电极传感器。
（2）环氧基硅烷偶联剂预处理电极：在反应器中，分别加入，丙酮：83 mL，环氧基硅烷偶联剂：35g，混合均匀，将纳米NbN /石墨复合糊电极放入，室温浸泡6h，温度升到45±2℃恒温反应3h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到环氧基硅烷偶联剂预处理电极；
（3）乙醇氧化酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：88 mL，乙醇氧化酶：3.0g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：7.0g，黄原胶：2.0g，搅拌溶解，该溶液为乙醇氧化酶固定液固定液；
（4）乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的乙醇氧化酶固定液固定液18μL滴涂到步骤（2）制备的环氧基硅烷偶联剂预处理电极，干燥，即得乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器。
实施例2
（1）纳米NbN /石墨复合糊电极传感器的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米氮化铌：46g，氧化纳米石墨粉：21g，复合胶黏剂：14g，液体石蜡：20g，研磨均匀成碳糊状，然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ6mm的玻璃管内，压实，干燥，用金相砂纸打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米NbN /石墨复合糊电极传感器。
（2）环氧基硅烷偶联剂预处理电极：在反应器中，分别加入，丙酮：85mL，环氧基硅烷偶联剂：33g，混合均匀，将纳米NbN /石墨复合糊电极放入，室温浸泡6h，温度升到45±2℃恒温反应3h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到环氧基硅烷偶联剂预处理电极；
（3）乙醇氧化酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：86 mL，乙醇氧化酶：4.0g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：9.0g，黄原胶：1.0g，搅拌溶解，该溶液为乙醇氧化酶固定液固定液；
（4）乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的乙醇氧化酶固定液固定液20μL滴涂到步骤（2）制备的环氧基硅烷偶联剂预处理电极，干燥，即得乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器。
实施例3
（1）纳米NbN /石墨复合糊电极传感器的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米氮化铌：42g，氧化纳米石墨粉：22g，复合胶黏剂：15g，液体石蜡：17g，研磨均匀成碳糊状，然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ6mm的玻璃管内，压实，干燥，用金相砂纸打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米NbN /石墨复合糊电极传感器。
（2）环氧基硅烷偶联剂预处理电极：在反应器中，分别加入，丙酮：82 mL，环氧基硅烷偶联剂：36g，混合均匀，将纳米NbN /石墨复合糊电极放入，室温浸泡6h，温度升到45±2℃恒温反应3h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到环氧基硅烷偶联剂预处理电极；
（3）乙醇氧化酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：90 mL，乙醇氧化酶：2.0g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：6.0g，黄原胶：2.0g，搅拌溶解，该溶液为乙醇氧化酶固定液固定液；
（4）乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的乙醇氧化酶固定液固定液16μL滴涂到步骤（2）制备的环氧基硅烷偶联剂预处理电极，干燥，即得乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器。
实施例4
（1）纳米NbN /石墨复合糊电极传感器的制备：在玛瑙研钵中，分别加入，纳米氮化铌：43g，氧化纳米石墨粉：26g，复合胶黏剂：16g，液体石蜡：17g，研磨均匀成碳糊状，然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ6mm的玻璃管内，压实，干燥，用金相砂纸打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米NbN /石墨复合糊电极传感器。
（2）环氧基硅烷偶联剂预处理电极：在反应器中，分别加入，丙酮：84 mL，环氧基硅烷偶联剂：34g，混合均匀，将纳米NbN /石墨复合糊电极放入，室温浸泡6h，温度升到45±2℃恒温反应3h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到环氧基硅烷偶联剂预处理电极；
（3）乙醇氧化酶固定液的制备：在反应器中，分别加入，去离子水：90 mL，乙醇氧化酶：2.0g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：7.0g，黄原胶：1.0g，搅拌溶解，该溶液为乙醇氧化酶固定液固定液；
（4）乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的乙醇氧化酶固定液固定液17μL滴涂到步骤（2）制备的环氧基硅烷偶联剂预处理电极，干燥，即得乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器。
本发明制备的乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器成功用于药品、化妆品、生物等样品中乙醇的检测中，回收率在92.82~103.62%之间，因此本发明制备的乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器可广泛应用于生物医药、化妆品、生物、环保检测等相关领域。

Claims (5)

1.一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米NbN /石墨复合糊电极传感器的制备：在玛瑙研钵中，按如下质量百分比加入，纳米氮化铌：42~46%，氧化纳米石墨粉：22~26%，复合胶黏剂：14~18%，液体石蜡：16~20%，各组分质量百分比之和为百分之百，研磨均匀成碳糊状，然后将其碳糊装入连有导线的内经为Φ6mm的玻璃管内，压实，干燥，用金相砂纸打磨，抛光，去离子水洗涤，即得纳米NbN /石墨复合糊电极传感器；
（2）环氧基硅烷偶联剂预处理电极：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，丙酮：64~67%，环氧基硅烷偶联剂：33~36%，混合均匀，将纳米NbN /石墨复合糊电极放入，室温浸泡6h，温度升到45±2℃恒温反应3h，取出电极，用无水乙醇洗涤，干燥，得到环氧基硅烷偶联剂预处理纳米NbN /石墨复合糊电极；
（3）乙醇氧化酶固定液的制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，去离子水：86~90%，乙醇氧化酶：2.0~4.0%，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：5~9%，黄原胶：1.0~2.0%，各组分质量百分浓度之和为百分之百，搅拌溶解，该溶液为乙醇氧化酶固定液固定液；
（4）乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备：取步骤（3）制备的乙醇氧化酶固定液固定液16~20μL滴涂到步骤（2）制备的环氧基硅烷偶联剂预处理电极，干燥，即得乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器。
2.根据权利要求1所述的一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的复合胶黏剂的制备方法为在反应釜中，按如下质量百分比加入，1-乙烯基-3-丁基咪唑三氟甲磺酸盐：72~76%，预处理丝瓜络粉：24~28%，盖好密封盖，置于恒温箱中，温度在160±2℃恒温，反应15~18h，得到粘稠淡黄色透明液体，为复合胶黏剂。
3.根据权利要求1所述的一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，所述预处理丝瓜络粉是成熟的丝瓜去皮去子，分别用酸碱处理，去除酸碱可溶物，经粉碎，过筛300目。
4.根据权利要求1所述的一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的液体石蜡与为环保级液体石蜡。
5.根据权利要求1所述的一种乙醇氧化酶修饰复合糊电极传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的乙醇氧化酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摩尔比为1：1~1.2之间。
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